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1、(10)授权公告号 CN 103004648 B (45)授权公告日 2014.09.17 CN 103004648 B (21)申请号 201110283181.X (22)申请日 2011.09.22 A01K 61/00(2006.01) (73)专利权人 汕头大学 地址 515063 广东省汕头市大学路 243 号 (72)发明人 郑怀平 王迪文 孙泽伟 刘合露 张涛 林清 孙颖 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 温旭 UA 76680 C2,2006.08.15, CN 101642064 A,2010.02.10, CN 102077800 A,2。
2、011.06.01, CN 102090357 A,2011.06.15, CN 101773079 A,2010.07.14, CN 101990854 A,2011.03.30, JP 11-225609 A,1999.08.24, WO 8203532 A1,1982.10.28, 张国范等 . 海湾扇贝养殖遗传学 .海湾扇 贝养殖遗传学 . 科学出版社 ,2009,( 第 1 版 ), 张国范等 . 贝类杂交及杂种优势理论和技术 研究进展 .海洋科学 .2004,( 第 07 期 ), 劳邦盛等 . 牡蛎中脂肪酸在储藏过程中的稳 定性 .色谱 .2000,( 第 04 期 ), 丁勇等。
3、 . 褶牡蛎秋季人工育苗技术介绍 . 中 国水产 .1993,( 第 08 期 ), (54) 发明名称 一种提高牡蛎体内 DHA 含量的育种方法 (57) 摘要 本发明涉及一种提高牡蛎体内 DHA 含量的育 种方法， 利用来自于同一物种不同亚种或种群的 纯种牡蛎为亲本， 通过种内亚种间或种群间同源 远交能够产生 DHA 含量高的杂种后代， 本发明能 够提高牡蛎体内的 DHA 含量达 20% 以上， 效率高。 本发明不需要转基因、 药物处理等技术， 操作简 便， 实用性强。 本发明能够提高显著地牡蛎体内营 养成分， 从而可有效地遏制目前养殖牡蛎营养品 质低下的问题， 为高值化牡蛎品种的培育提供。
4、了 一条新途径， 市场前景广阔。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 秦婕 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 (10)授权公告号 CN 103004648 B CN 103004648 B 1/1 页 2 1. 一种提高牡蛎体内 DHA 含量的育种方法， 包括下列步骤 ： （1） 种贝选择、 纯种鉴定及性腺促熟 ： 种贝必须源自于同一种牡蛎的不同亚种的纯种， 采用形态学和分子生物学方法对亲本进行纯种鉴定， 通过人工方法调控种贝性腺同步成 熟 ； （2） 杂种与纯种组合的建立 ： 以性腺成熟的种贝。
5、为材料， 解剖分别获得精子和卵子， 每 种种贝的雌雄个体数至少 20 个， 然后采用种内亚种间远交产生杂种组， 同时， 采用亚种内 交配产生源自同一亲本的纯种组， 作为杂种组的对照组 ； （3） 幼虫培育与稚贝养成 ： 幼虫培育在室内进行， 主要包括对培育密度、 饵料、 水温、 盐 度的选择 ； 稚贝养成在海上进行， 幼虫培育的初始密度为 2 个 /ml， 每天全换水一次， 充气培 育 ； 饵料为等鞭金藻和亚心形扁藻， 日投饵 3 次， 投饵量前 3 天为 1 万个藻类细胞 /ml、 接下 来 7 天增加到 5 万个藻类细胞 /ml， 之后增加到 10 万个藻类细胞 /ml ； 每两天对幼虫培。
6、养密 度进行定量， 并通过调节培养水体以使每个培育桶中的幼虫密度基本一致， 幼虫培育期间 不加抗生素， 当 20% 30% 的幼虫出现眼点时， 投放处理好的牡蛎壳、 扇贝壳采苗器进行采 苗， 按每个附着基附着 810 个稚贝投放， 当水体中的浮游幼虫全部附着变态后， 继续在室 内培养一周左右， 然后将附有稚贝的牡蛎壳或扇贝壳用绳子串起并做好标记， 在天气晴朗 的下午出池， 挂到海上进行稚贝养成 ； 之后， 定期检查稚贝的生长和存活情况， 6 个月后， 可 生长到 5cm-6cm， 为了降低环境效应， 杂种组和纯种组从幼虫、 稚贝， 到成贝期间一直养殖在 相同的环境条件下 ； （4） DHA 含。
7、量的测定与比较 ： 从杂种组和纯种组中各取至少 15 个成体牡蛎为材料， 活体 解剖获得新鲜的软体组织， 同一种的组织先搅匀、 真空冷冻干燥再研磨成粉， 先用氯仿 - 甲 醇混合液抽提脂肪， 然后用 NaOH 甲醇溶液对脂肪进行甲酯化， 最后用气相色谱仪分析脂肪 酸组分， 测定出杂种组和纯种组样品中的 DHA 含量并进行比较。 权 利 要 求 书 CN 103004648 B 2 1/3 页 3 一种提高牡蛎体内 DHA 含量的育种方法 技术领域 0001 本发明涉及一种提高牡蛎体内营养成分的育种方法， 具体说是一种提高牡蛎体内 DHA 含量的育种方法。 背景技术 0002 DHA（二十二碳六。
8、烯酸， 22:6n-3） ， 俗称 “脑黄金” ， 是人体必需的一种长链多价不饱 和脂肪酸， 是大脑细胞膜的重要构成成分， 参与脑细胞的形成和发育， 对神经细胞轴突的延 伸和新突起的形成有重要作用， 可维持神经细胞的正常生理活动， 参与大脑思维和记忆形 成过程。 DHA还是视网膜光受体中最丰富的长链多价不饱和脂肪酸， 是视网膜的重要构成成 分， 对促进视网膜组织的发育， 促进视功能的发展， 改善视敏锐性等具有重要作用。 DHA同维 生素、 矿物质一样也是人体的必需营养物质， 在人体大脑皮层中含量高达 20% 在人体大脑 皮层中含量高达 20%， 在眼睛视网膜中所占比例最大， 约占 50%。因此。
9、， 对胎婴儿智力和视力 发育至关重要， 同时也可有效地预防老年痴呆、 视力衰退等。近年研究表明， DHA 还能够降 低胆固醇、 抑制血小板聚集， 从而预防心血管疾病。此外， DHA 还具有很强的抗氧化功能， 能 够提高机体免疫力、 阻止肿瘤细胞的增生。 然而， 人体不能够自己合成DHA， 必须从食物中获 得。因此， 如何提高食物中的 DHA 含量越来越引起人们的重视。 0003 牡蛎俗称 “蚝” 、“海蛎子” 等， 味道鲜美、 营养丰富， 蛋白含量高， 素有 “海洋牛奶” 之 称。 牡蛎中也含有较高的不饱和脂肪酸， 其含量通常在4.74%-19.96%。 中医学认为， 牡蛎重 镇安神， 潜阳补。
10、阴,软坚散结,收敛固涩 ； 对于惊悸失眠、 劳神伤脾、 阳萎、 腰痛、 崩漏等症有 疗效。因品种和地区的差异， 牡蛎的营养成分也有一定的差别。 0004 牡蛎也是世界水产养殖产量最高的种类。据世界粮农组织统计， 全世界仅太平洋 牡蛎养殖产量在2003年就已达到440万吨。 我国是贝类养殖大国， 同时也是牡蛎养殖大国， 2009年， 牡蛎养殖产量达350.38万吨， 占养殖贝类总产量的32.55%。 近10年来我国牡蛎产 量一直呈上升趋势。目前， 我国养殖的牡蛎多为巨蛎属 （Crassostrea） 种类， 如太平洋牡蛎 C.gigas、 近江牡蛎 C.ariakensis、 香港巨牡蛎 C.h。
11、ongkongensis、 葡萄牙牡蛎 C.angulata 等。然而， 由于养殖规模的扩大，“水蛎子” 日渐增多， 导致牡蛎的营养品质不断下降， 严重地 影响了牡蛎的产量和效益。 因此， 必须寻求一种方法来提高牡蛎的营养成分， 解决养殖牡蛎 营养品质下降问题。 0005 “同源远交” 指的是源自于同一物种的不同亚种 （种群） 间的个体或群体水平的交 配。众所周知， 杂交是动植物遗传改良的重要手段， 其目的就是为了获得杂种优势。杂种优 势是指两个遗传背景不同的亲本杂交产生的杂种 F1在生长势、 生活力、 生殖力、 抗逆性、 产 量和品质上比亲本的一方或双亲优越的现象。但并不是所有杂交都能够产生。
12、杂种优势。当 杂种的表型超越双亲表型的平均值时， 这样的杂交产生了杂种优势， 当杂种的表型值低于 双亲表型的平均值时， 这样的杂交就产生了杂种衰退。 研究表明， 牡蛎的种间远源杂交绝大 多数是不成功的。然而， 利用种内不同亚种或不同地理种群的同源远交方法改良牡蛎品种 性状却取得了可喜的进展， 大多能够产生正的杂种优势。 但迄今为止， 利用同源远交的育种 说 明 书 CN 103004648 B 3 2/3 页 4 方法提高牡蛎体内 DHA 含量却一直没有报道。 发明内容 0006 本发明的目的为了提供一种简便、 目标明确地提高牡蛎营养成分的育种方法， 来 解决我国牡蛎养殖营养品质下降的问题， 。
13、从而推动我国牡蛎养殖产业的发展。 0007 本发明的技术方案是 ： 种贝选择、 纯种鉴定及性腺促熟、 杂种与纯种组合的建立、 苗种培育与稚贝养成、 DHA 含量测定与比较等过程， 可使杂种的 DHA 含量显著提高， 其操作 步骤为 ： 0008 1、 种贝选择、 纯种鉴定及性腺促熟 ： 种贝必须源自于同一种牡蛎的不同亚种或种 群的纯种， 采用形态学和分子生物学方法对亲本进行纯种鉴定， 通过人工方法调控种贝性 腺同步成熟。 0009 2、 杂种与纯种组合的建立 ： 以性腺成熟的种贝为材料， 解剖分别获得精子和卵子。 然后采用种内亚种间或种群间远交产生杂种组。同时， 采用亚种内或种群内交配产生源自。
14、 同一亲本的纯种组， 作为杂种组的对照组。 0010 3、 幼虫培育与稚贝养成 ： 包括幼虫的培育密度、 饵料、 水温、 盐度 ； 稚贝为了降低 环境效应， 杂种组和纯种组从幼虫、 稚贝， 到成贝期间一直养殖在相同的环境条件下。 0011 4、 DHA 含量的测定与比较 ： 采用气相色谱测定杂种和纯种牡蛎的 DHA 含量， 然后杂 种组与纯种组进行比较。 0012 本发明的优点和有益效果如下 ： 0013 1、 通过 1 代杂交就可使牡蛎体内的 DHA 含量显著地提高 20% 以上， 效率高。 0014 2、 首次从提高多不饱和脂肪酸含量的角度改良养殖贝类的营养品质， 开辟了贝类 品种培育的新。
15、途径， 为其他贝类新品种的培育起到了示范作用。 0015 3、 鉴于 DHA 对医疗、 保健等方面的特殊作用， DHA 含量的提高可也可提高牡蛎产品 的附加值， 经济价值得到提高， 增加养殖企业和养殖户的收入， 市场前景广阔。 0016 4、 本方法不需要转基因、 药物处理等技术， 操作简便， 实用性强。 0017 本发明是一种提高牡蛎营养成分的方法， 通过这种技术可显著提高牡蛎体内的 DHA 含量。这种方法培育的牡蛎由于富含 DHA， 在医疗和保健等方面具有特殊价值。通过本 发明可提高牡蛎的营养品种和经济价值， 有效地遏制目前养殖业产品价格贱、 产值低等问 题， 为高值化牡蛎品种的培育提供一。
16、条新途径。 本发明不需要通过转基因、 药物处理等复杂 技术， 因此该产品对生物和环境安全没有影响。 具体实施方式 0018 1、 种贝选择、 纯种鉴定及性腺促熟 ： 2010 年 6 月， 从汕头和青岛两地各选择 100 个健康、 无损伤的 1 龄牡蛎为种贝。先各取 10 个， 通过形态学和 16S 测序对种贝进行 纯种鉴定， 结果表明青岛养殖的牡蛎为 Crassostrea gigas gigas、 汕头养殖的牡蛎为 Crassostrea gigas angulata， 二者都属于太平洋牡蛎个种、 均为纯种， 但属于不同亚种。 来自青岛养殖的牡蛎简称青岛牡蛎、 来自汕头养殖的的牡蛎简称汕头。
17、牡蛎。种贝先在海区 自然催熟半个月， 然后再移到室内、 放在 4 个 500L 的聚乙烯桶中对性腺进行人工促熟。每 天换水 2-3 次、 以亚心形扁藻 + 叉鞭金藻 + 酵母混合投喂、 不间断充气。约 10 天左右， 种贝 说 明 书 CN 103004648 B 4 3/3 页 5 性腺可同步成熟。 0019 2、 杂种和纯种组合的建立 ： 以性腺成熟的青岛牡蛎和汕头牡蛎为种贝， 解剖分别 获得各自的精子和卵子。每个亚种的雌雄种贝都用 20 个， 接着将同一杂种的卵子混在一起 并等分为两部分、 同一亚种的精子也混在一起。然后取适量的青岛牡蛎精子与汕头牡蛎卵 子受精进行亚种间杂交， 建立了同源。
18、杂种组 ； 同时取适量的青岛牡蛎精子与青岛牡蛎卵子 受精、 取适量的汕头牡蛎精子与汕头牡蛎卵子受精进行亚种内近交， 建立了两个同源纯种 组， 作为杂种组的对照组。在 27 -28、 盐度 31-32 条件下， 经过 24h， 受精卵发育至 D 型 幼虫。 0020 3、 幼虫培育与稚贝养成 ： 幼虫培育在室内进行， 主要包括培育密度、 饵料、 水温、 盐 度 ； 稚贝养成在海上进行。用 300 目筛绢网收集 D 型幼虫放入 500L 的聚乙烯桶中充气培 育。幼虫培育的初始密度约 2 个 /ml、 每个组设置 3 个重复。幼虫的饵料以等边金藻和扁藻 为主， 每日投饵 3 次， 投饵量前 3 天每。
19、次 1 万个藻类细胞 /ml、 接下来 7 天每次 5 万个藻类细 胞 /ml、 之后每次投喂 10 万个藻类细胞 /ml ； 每日换水 1 次， 壳顶期和出眼点时将幼虫换入 其他干净的 500L 的聚乙烯桶中培育。每两天对幼虫培养密度进行定量， 并通过调节培养水 体以使每个培育桶中的幼虫密度基本一致。幼虫培育期间不加抗生素。15 天后， 幼虫眼点 率超过 30 ， 投放牡蛎壳或扇贝壳等附着基， 按每个附着基附着 8-10 个稚贝投放。投放附 着基约 1 周后， 幼虫全部变态为稚贝。稚贝在室内 500L 的聚乙烯桶中继续养殖 1 周， 将附 有稚贝的牡蛎壳或扇贝壳用绳子串起并做好标记， 在天气。
20、晴朗的下午出池， 挂到海上进行 稚贝养成 ； 之后， 定期检查稚贝的生长和存活情况。6 个月后， 可生长到 5cm-6cm。为了减少 环境的影响， 从幼虫、 稚贝到养成阶段， 杂种组与纯种组的养殖环境始终保持一致。 0021 4、 DHA 含量的测定与比较 ： 从杂种组和纯种组中各取 15 个成体牡蛎为材料， 活体 解剖获得新鲜的软体组织。同一种的软体组织先搅匀、 真空冷冻干燥再研磨成粉。先用氯 仿 - 甲醇混合液抽提脂肪， 然后用 NaOH 甲醇溶液对脂肪进行甲酯化， 最后用气相色谱仪 分析脂肪酸组分， 测定出杂种组和纯种组样品中的 DHA 含量。杂种牡蛎的 DHA 含量达到 16.24%、 纯种牡蛎的 DHA 含量平均值为 12.54%， 然后对杂种与纯种的 DHA 含量进行比较， 发 现杂种牡蛎体内的 DHA 含量比纯种牡蛎体内的 DHA 含量高出了 29.51%。因此， 同源远交能 够提高牡蛎体内的 DHA 含量达 20% 以上。 0022 显然本发明能够显著地提高牡蛎体内的 DHA 含量， 从而可有效地遏制目前养殖牡 蛎营养品质低下的问题， 为高值化牡蛎品种的培育提供了一条新途径。 说 明 书 CN 103004648 B 5 。