早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201310020747.9	申请日：	20130121
公开号：	CN103004611B	公开日：	20140312
当前法律状态：		有效性：	失效
法律详情：
IPC分类号：	A01H4/00,A01G31/00	主分类号：	A01H4/00,A01G31/00
申请人：	四川农业大学
发明人：	张帆,万雪琴,刘敏,钟宇,刘光立,张双,罗兵,黄金亮,吴富雨
地址：	611130 四川省成都市温江区柳城镇惠民路211号
优先权：	CN201310020747A
专利代理机构：	北京众合诚成知识产权代理有限公司	代理人：	龚燮英
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内容摘要

发明公开了一种早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法，（1）?早开堇菜外植体最佳灭菌方式；（2）初代培养；（3）继代培养；（4）生根培养；（5）炼苗与移栽。通过本发明培育出来的早开堇菜繁殖系数大、适合大规模生产，能够解决该物种资源匮乏的问题，实现可持续利用；此外早开堇菜快速繁殖，短期内获得大量规格一致的苗木，能够满足园林绿化对其需求量大的要求，这对园林、医药都有重大意义。

权利要求书

1.一种早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法，其特征在于：（1）早开堇菜外植体最佳灭菌方式：（1.1）子叶节的消毒方式是75%乙醇消毒30s，0.1%升汞消毒时间在4min；（1.2）叶片和叶柄的消毒方式是75%乙醇消毒30s、0.1%升汞消毒8min；（2）初代培养：（2.1）在光照培养条件下，早开堇菜子叶节诱导丛生芽的培养基为 MS + 6-BA 3.0mg·L+ NAA 0.2 mg·L；叶柄诱导不定芽的培养基为：MS + 6-BA 3.5mg·L+ NAA 0.2 mg·L；（2.2）子叶节、叶片、叶柄诱导愈伤组织的植物生长调节剂组合为 MS + 6-BA 1.5 mg·L + 2,4-D 1.5 mg·L；（3）继代培养：（3.1）丛生芽和不定芽增殖的培养基为：MS + 6-BA 3.5 mg·L + NAA 0.2 mg·L；（3.2）三种外植体愈伤组织继代增殖培养的组合是 MS + 6-BA 1.5 mg·L+ 2,4-D 0.75 mg·L+ NAA 1.0 mg·L；（3.3）早开堇菜愈伤组织分化的培养基为：MS + 6-BA 3.0 mg·L + NAA 0.3 mg·L；（4）生根培养：将在不添加任何激素的MS培养基中培养15天后的试管苗进行生根培养，早开堇菜幼苗生根的培养基为：1/2MS + 6-BA 1.0 mg·L；（5）炼苗与移栽：炼苗基质以珍珠岩:河沙:腐殖质以1:2:2的比例效果最好，植株成活率达100%，且植物的长势良好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养及快速繁殖的方法，属于植物组培工厂化快速育苗的方法技术领域。

背景技术

早开堇菜( V iola prionantha Bunge) 为堇菜科堇菜属多年生草本植物。其返青早，生长迅速，覆盖地面能力强，花期集中，一年内春秋两季均可开花，抑制杂草能力较强，作为早春野生开花地被植物，有较好的观赏效果及园林应用价值。

同时早开堇菜具有较高的药用价值，民间广泛用于痈疽疮毒、毒蛇咬伤等,它具有较强的抗菌、消炎、清热解毒作用。

早开堇菜主要靠种子繁殖和根状茎繁殖，但是两种繁殖方式的繁殖率都比较低，不能满足作为地被植物用量大的需求。种子在萌发过程中对温度十分敏感，最适发芽温度为25℃, 在高温下(>30℃)种子变褐色并霉烂, 在低温下(<20℃)萌发及生长缓慢或停止生长, 这都限制了早开堇菜的大量繁殖。

早开堇菜作为野生地被植物，尚未得到开发，药源以采挖野生资源为主，资源渐少，目前早开堇菜的组织培养尚未见报道，单纯的靠野生资源并不能满足需要。因此进行早开堇菜组织快繁体系研究具有很好的发展前景，不但能够及时保护发展这一野生资源，实现可持续利用；而且还能通过组织培养的快速繁殖满足城市园林绿化对地被植物需求量大的要求。早开堇菜作为早春地被植物被广泛应用于我国城市园林绿化之中，将进一步丰富我国的地被植物景观。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法。

本发明的技术方案如下：

早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法，其关键方法参数如下：

1.1 早开堇菜外植体最佳灭菌方式

1.1.1 子叶节最佳的消毒方式是75%乙醇消毒30s，0.1%升汞消毒时间在4min。

1.1.2 叶片和叶柄最佳的消毒方式是75%乙醇消毒30s、0.1%升汞消毒 8min。

1.2 初代培养

1.2.1 在光照培养条件下，早开堇菜子叶节诱导丛生芽的最适培养基为 MS + 6-BA 3.0mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 ；叶柄诱导不定芽的最适培养基为：MS + 6-BA 3.5mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1，叶片不适合作为直接诱导不定芽的外植体。

1.2.2 三种外植体均能诱导产生愈伤组织，子叶节诱导产生愈伤组织的时间最短，其次为叶柄，叶片最晚。

1.2.3 子叶节、叶片、叶柄诱导愈伤组织的最适植物生长调节剂组合为 MS + 6-BA 1.5 mg·L-1 + 2,4-D 1.5 mg·L-1；

1.3 继代培养

1.3.1 丛生芽和不定芽增殖的最佳培养基为：MS + 6-BA 3.5 m g·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1。

1.3.2 三种外植体愈伤组织继代增殖培养的最优组合是 MS + 6- BA 1.5 mg·L-1 + 2,4-D 0.75 mg·L-1 + NAA 1.0 mg·L-1，

1.3.3早开堇菜愈伤组织分化的最佳培养基为：MS + 6-BA 3.0 m g·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1；

1.4 生根培养

将在不添加任何激素的MS培养基中培养15天后的试管苗进行生根培养，最适合早开堇菜幼苗生根的培养基为：1/2MS + 6-BA 1.0 mg· L-1 。

1.5 炼苗与移栽

炼苗基质以珍珠岩:河沙:腐殖质以1:2:2的比例效果最好，植株成活率达100%，且植物的长势良好。

通过本发明培育出来的早开堇菜繁殖系数大、适合大规模生产，能够解决该物种资源匮乏的问题，实现可持续利用；此外早开堇菜快速繁殖，短期内获得大量规格一致的苗木，能够满足园林绿化对其需求量大的要求，这对园林、医药都有重大意义。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1.2.1 培养基

（1）培养基的配置

培养基配方：基本培养基（MS）添加不同种类和浓度的生长素和细胞分裂素。

蔗糖浓度为25g/L，琼脂为6g/L , pH值用1mol/L的HCl或者1mo1/L的 NaOH调至6.0-6.2，使用前在121℃高压灭菌20min。

(2) 培养条件

培养温度为(25士1)℃，光照强度为20-30 umol/m2·s，丛生芽诱导、增殖和愈伤组织分化培养采用每日光培养16h和暗培养8h的光周期。愈伤组织诱导、增殖采用每日黑暗培养24小时，培养7天后转入上述每日光培养12h 和暗培养12h的光周期。

1.2.2 主要试剂

(1) 主要试剂及药品

植物生长调节剂6-BA、2,4-D、NAA、IBA均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；基本培养基配方中所有试剂、蔗糖、琼脂粉、维生素以及消毒试剂等均为国产分析纯。

1.2.3 仪器设备

(1)高压灭菌锅:主要用于植物组织培养操作中的培养基及其它多种需要无菌用品的灭菌。高压灭菌锅有多种类型，通常使用的多为手提式高压灭菌锅和大型高压灭菌锅。高压灭菌时，要求的最低压力为1.06 kg/cm2,温度为121℃ ,灭菌时间为不少于15min,并需要根据培养基容量的增大相应地增加灭菌时间，但最高不超过30min。本发明所用的灭菌锅为 TOMY Autoclave SS-325。

(2)超净工作台:超净工作台又称净化工作台，主要用十培养材料的接种等无菌操作过程。由于它具有机动的滤菌装置，可以在工作人员与操作对象之间形成风幕，使工作台面处于基本无菌的状态。在使用超净工作台前应先用70%的酒精棉将台面及周围擦净，再用紫外灯照射3 Omin左右对台面进行灭菌，同时启动风机把贮存于机体内的含菌空气排出。经常使用的超净工作台每隔半年左右要把滤料清洗一次，否则会因滤料附着太多的灰尘而影响正常的工作。滤料清洗后，超净工作台必须启动一个小时后才能进行正常的无菌操作。由于从超净工作台中吹出的空气也不是绝对无菌的，因此操作时要借助于酒精灯进行无菌操作，否则难以达到完全无菌的效果。本发明所用的超净工作台型号为苏州安泰空气技术有限公司生产 SW-CJ-ZFD。

(3)智能人工气候箱：具有光照、加湿功能的高精度冷热恒温设备。主要用于植物材料的恒温培养、光照培养以及用于愈伤组织分化和植株再生过程的培养。气候箱的温度变化范围为5-50℃（无光照）、10℃-50℃ （有光照）,组织培养时的使用温度常为20-30℃。气候箱内通常有四层活动的金属网格，每层网格都可以放满培养瓶，但上下层培养物之间必须保留一定的空隙，以保证箱内空气的流动和温度的恒定。本研究所用的是宁波江南仪器厂制造的RXZ型智能人工气候箱。

除了上述仪器设备以外，还用到电子天平、电炉、冰箱、容量瓶、烧杯、玻璃棒、移液管、洗耳球、量筒、酒精灯、试管、组培瓶、解剖刀、镊子、封口膜等。

1.2.4 初代培养

(1)外植体的预处理和灭菌

a.子叶节处理方式

采收的早开堇菜新鲜种子，挑选颜色较深、子粒饱满者摆放于培养皿中，并置于25℃恒温箱中进行催芽。待胚根长出1cm左右，子叶恰好脱离种皮，此时发芽得到的幼苗，先用流水冲洗3h,然后在1.0g/l的多菌灵溶液中浸泡20分钟。冲洗干净之后的幼苗置于超净工作台上放入75 %的乙醇中消毒(15s、30s、45s)后，用无菌水冲洗2次，再放入0.1%的升汞中消毒(4min、6min、8mim)，无菌水冲洗5次，以尽可能冲洗干净残留在外植体上的消毒液，每次2min以上，过程中不断摇晃。用无菌纱布吸干幼苗表面的水分，再用解剖刀切取整个子叶节，下胚轴留约 0.3cm,接种于基本培养基（MS）中。

表1-1 子叶节消毒处理结果

注:显著性测验，字母相同者差异不显著。字母不同者表示在5%(小写字母)或1%(大写字母)水平上差异显著。(下同)。

实验结果表明：子叶节最佳的消毒方式是75%乙醇消毒30s，0.1%升汞消毒时间在4min。

b.叶片、叶柄处理方式

选择健壮、无病虫害的优良植物，用剪刀剪取带叶柄的幼嫩叶片，在洗衣粉中浸泡15min, 用毛刷轻轻刷去叶片、叶柄上残留的脏物，再用流水冲洗3h, 然后在1g/l的多菌灵溶液中浸泡30分钟，流水冲干净残留的多菌灵。叶片、叶柄冲洗干净之后置于超净工作台上放在75%的乙醇中消毒(15s、30s、45s)后，用无菌水冲洗2次，再放入0.1%的升汞中消毒(6min、8min、10mim)，无菌水冲洗5次，以尽可能洗掉残留在外植体上的消毒液，每次2min以上，过程中不断摇晃。用无菌纱布吸干叶片、叶柄表明的水分，叶柄剪成0.5-1cm左右的节段，叶片剪成 1.0×1.0cm2大小接种于基本培养基（MS）中。

表1-2 叶片消毒处理结果

表1-3 叶柄消毒处理结果

实验结果表明：叶片和叶柄最佳的消毒方式是75%乙醇消毒30s、0.1% 升汞消毒8min。

(2) 子叶节丛生芽的诱导

将预处理后的子叶节接种于丛生芽诱导培养基中。基本培养基为MS培养基，处理激素为:6-BA (1.5 mg·L-1、2.5 mg·L-1、3.0mg·L-1) , NAA（0.05 mg·L-1、0.2mg·L-1、0.8mg·L-1),进行完全实验，筛选出丛生芽诱导的最佳配方。

所有的培养基均添加25g/L蔗糖，6g/L琼脂，PH 6.0-6.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。培养温度为(25士1)℃，光照强度为20-30 umol/m2·s，光照时间12 h/d。[没有对培养基（选择的就是基本培养基：M S）以及培养条件进行筛选，蔗糖、琼脂含量是查询了一些参考文件后确定的，本实验中仅仅对植物生长调节剂的种类和浓度进行了对照试验]

表2 子叶节丛生芽诱导试验结果

实验结果表明：在光照培养条件下，早开堇菜子叶节诱导丛生芽的最适培养基均为 MS + 6-BA 3.0mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 。

(3) 叶片、叶柄不定芽的诱导

将预处理后的幼嫩叶片、叶柄接种于不定芽诱导培养基中。基本培养基:MS，处理激素: 6-BA (1.5 mg·L-1、3.5 mg·L-1、4.0mg ·L-1), NAA（0.05 mg·L-1、0.2mg·L-1、0.8mg·L-1),进行完全实验，筛选出不定芽诱导的最佳配方。

表3 叶柄不定芽诱导试验结果

将早开堇菜的叶片接种于培养基中，光照15d后观察发现从叶片切口处开始膨大，25天后在极少数处理中叶脉处或叶片四周开始有少量芽的分化，但生长一段时由叶片分化而来的少量不定芽很快就褐化死亡；剩下的其它处理中叶片并未分化出不定芽，并且全部褐化死亡，因此叶片不适合作为外植体直接诱导产生不定芽。

实验结果表明：在光照培养条件下，早开堇菜叶柄诱导不定芽的最适培养基为 MS + 6-BA 3.5mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 ，叶片不适合作为直接诱导不定芽的外植体。

(4)子叶节、叶片、叶柄的愈伤组织诱导

将预处理后幼嫩的叶片、叶柄、子叶节接种于愈伤组织诱导培养基中。基本培养基:MS，处理激素:6-BA (1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2 .0 mg·L-1), 2,4-D (0.5 mg·L-1、0.75 mg·L-1、1.5 mg·L-1), NAA (0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1)，进行正交实验，筛选出愈伤组织诱导的最佳配方。

所有的培养基均添加25g/L蔗糖，6g/L琼脂，PH 6.0-6.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。在培养温度为(25士1)℃天条件下暗培养3周，再移到同温度下光培养，光照强度为20-30 umol/m2·s，光照时间8h/d。

表4 子叶节愈伤组织诱导培养试验结果

表5 叶片愈伤组织诱导诱导试验结果

表6 叶柄愈伤组织诱导试验结果

实验结果表明：子叶节、叶片、叶柄诱导愈伤组织的最适植物生长调节剂组合为 MS + 6-BA 1.5 mg·L-1 + 2,4-D 1.5 mg·L-1。

1.2.5 继代培养

(1) 丛生芽和不定芽的增殖培养

将由愈伤组织分化而来的不定芽、由外植体直接诱导产生的丛生芽和不定芽切割成单芽，在增殖培养基上进行继代培养，40d继代一次。基本培养基：MS，处理激素:6-BA (1.5 mg·L-1、3.0 mg·L-1、3.5m g·L-1),NAA（0.15 mg·L-1、0.2mg·L-1、0.4mg·L-1)，进行完全实验，筛选出丛生芽和不定芽增殖的最佳培养基。

所有的培养基均添加25g/L蔗糖，6g/L琼脂，PH 6.0-6.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。培养温度为(25士1)℃，光照强度为20-30 umol/m2·s，光照时间12 h/d。

表7 芽的继代增殖培养试验结果

实验结果表明：丛生芽和不定芽增殖的最佳培养基为：MS + 6-BA 3.5 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1。

(2) 愈伤组织的增殖培养

以初代培养的愈伤组织为外植体，接种在增殖培养基上使其体积长大、数量

增加，30d继代一次。基本培养基：MS，处理激素: 6-BA (1.0 mg ·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1), 2,4-D (0.5 mg·L-1、0.75 mg·L-1、1.5 mg·L-1), NAA (0.1mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg ·L-1)，进行正交实验，筛选出愈伤组织增殖的最佳培养基。

所有的培养基均添加25g/L蔗糖，6g/L琼脂，PH 6.0-6.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。在培养温度为(25士1)℃天条件下暗培养3周，再移到同温度下光培养，光照强度为20-30 umol/m2·s，光照时间8h/d。[ 没有对培养基（选择的就是基本培养基：MS）以及培养条件进行筛选，蔗糖、琼脂含量是查询了一些参考文件后确定的，本实验中仅仅对植物生长调节剂的种类和浓度进行了对照试验]

表8 愈伤组织继代增殖培养试验结果

注:愈伤组织增殖倍数是以最初接入直径为 1.0cm左右的愈伤为基数，根据其体积的增大来计算其增殖倍数。(下同)

实验结果表明：三种外植体愈伤组织继代增殖培养的最优组合是 MS + 6-BA 1.5 mg·L-1 + 2,4-D 0.75 mg·L-1 + NAA 1.0 mg· L-1。

(3) 愈伤组织不定芽的分化

将诱导形成的愈伤组织转接到分化培养基上，使愈伤组织分化成苗。基本培养基：MS，处理激素: 6-BA (0 mg·L-1、2.5 mg·L-1、3. 0 mg·L-1、3.5mg·L-1), NAA（0mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.15mg· L-1、0.3mg·L-1),进行完全实验，筛选出丛生芽诱导的最佳配方。

所有的培养基均添加25g/L蔗糖，6g/L琼脂，PH 6.0-6.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。培养温度为(25士1)℃，光照强度为20-30 umol/m2·s，光照时间12 h/d。

表9 愈伤组织分化试验结果

实验结果表明：早开堇菜愈伤组织分化的最佳培养基为：MS + 6-B A 3.0 mg·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1。

1.2.6 生根培养

将健壮的单苗进行生根诱导培养。生根基本培养基(MS、1/2MS、1/4M S)，6-BA(0.5 mg·L-1、0.75 mg·L-1、1.0mg·L-1)、NAA（0 mg· L-1、0.5mg·L-1、1.0 mg·L-1), 进行正交实验，筛选出单苗诱导生根的最佳配方。

所有的培养基均添加25g/L蔗糖，6g/L琼脂，PH 6.0-6.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。培养温度为(25士1)℃，光照强度为20-30 umol/m2·s，光照时间12 h/d。

表10 不同培养基和植物植物生长调节剂组合对试管苗生根的影响

实验结果表明：最适合早开堇菜幼苗生根的培养基为：1/2MS + 6- BA 1.0 mg·L-1 。

1.2.7 炼苗与移栽

待生根苗根长2cm，苗高5-6cm时，在封口膜上密刺小孔，于温室散射光下培养，第4d揭开1/4的封口膜，第7d揭开1/2封口膜，第10d将封口膜全部揭开，第13d将试管苗轻轻取出来，洗净根部的培养基，移栽在用珍珠岩、河沙、腐殖质按一定比例配成的基质中。

炼苗前，使用0.1%的高锰酸钾对基质进行消毒处理。苗栽后浇透水一次，初期可加盖遮阳网，注意遮荫保温保湿，温度保持20-30℃，湿度保持80%以上。

实验结果表明：炼苗基质以珍珠岩:河沙:腐殖质以1:2:2的比例效果最好，植株成活率达100%，且植物的长势良好。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

资源描述

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1、(10)授权公告号 CN 103004611 B (45)授权公告日 2014.03.12 CN 103004611 B (21)申请号 201310020747.9 (22)申请日 2013.01.21 A01H 4/00(2006.01) A01G 31/00(2006.01) (73)专利权人四川农业大学地址 611130 四川省成都市温江区柳城镇惠民路 211 号 (72)发明人张帆万雪琴刘敏钟宇刘光立张双罗兵黄金亮吴富雨 (74)专利代理机构北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246 代理人龚燮英 CN 1554229 A,2004.12.15, JP。

2、特开平 6-30668 A,1994.02.08, JP 特开平 6-30670 A,1994.02.08, JP 平 2-27982 A,1999.01.30, 朱锦懋等 .“蔓茎堇菜愈伤组织分化再生植株” .福建师范大学学报 .2001, 第 17 卷 ( 第 1 期 ), 第 79-83 页 . (54) 发明名称早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法 (57) 摘要本发明公开了一种早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法，（1）早开堇菜外植体最佳灭菌方式；（2）初代培养；（3）继代培养；（4）生根培养；（5）炼苗与移栽。通过本发明培育出来的早开堇菜繁殖系数大、适合大。

3、规模生产，能够解决该物种资源匮乏的问题，实现可持续利用；此外早开堇菜快速繁殖，短期内获得大量规格一致的苗木，能够满足园林绿化对其需求量大的要求，这对园林、医药都有重大意义。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员杜玉娟权利要求书 1 页说明书 19 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书1页说明书19页 (10)授权公告号 CN 103004611 B CN 103004611 B 1/1 页 2 1. 一种早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法，其特征在于：（1）早开堇菜外植体最佳灭菌方式：（1.1）子叶节的消。

4、毒方式是 75% 乙醇消毒 30s， 0.1% 升汞消毒时间在 4min ；（1.2）叶片和叶柄的消毒方式是 75% 乙醇消毒 30s、 0.1% 升汞消毒 8min ；（2）初代培养：（2.1）在光照培养条件下，早开堇菜子叶节诱导丛生芽的培养基为 MS + 6-BA 3.0mgL-1 + NAA 0.2 mgL-1 ；叶柄诱导不定芽的培养基为： MS + 6-BA 3.5mgL-1 + NAA 0.2 mgL-1；（2.2）子叶节、叶片、叶柄诱导愈伤组织的植物生长调节剂组合为 MS + 6-BA 1.5 mgL-1 + 2,4-D 1.5 mgL-1；（3）继代培。

5、养：（3.1）丛生芽和不定芽增殖的培养基为： MS + 6-BA 3.5 mgL-1 + NAA 0.2 mgL-1；（3.2）三种外植体愈伤组织继代增殖培养的组合是 MS + 6-BA 1.5 mgL-1 + 2,4-D 0.75 mgL-1 + NAA 1.0 mgL-1；（3.3）早开堇菜愈伤组织分化的培养基为： MS + 6-BA 3.0 mg L-1 + NAA 0.3 mg L-1；（4）生根培养：将在不添加任何激素的 MS 培养基中培养 15 天后的试管苗进行生根培养，早开堇菜幼苗生根的培养基为： 1/2MS + 6-BA 1.0 mgL-1 ；。

6、（5）炼苗与移栽：炼苗基质以珍珠岩:河沙:腐殖质以1:2:2的比例效果最好，植株成活率达100%，且植物的长势良好。权利要求书 CN 103004611 B 2 1/19 页 3 早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法技术领域 0001 本发明涉及一种植物组织培养及快速繁殖的方法，属于植物组培工厂化快速育苗的方法技术领域。背景技术 0002 早开堇菜 ( V iola prionantha Bunge) 为堇菜科堇菜属多年生草本植物。其返青早，生长迅速，覆盖地面能力强，花期集中，一年内春秋两季均可开花，抑制杂草能力较强，作为早春野生开花地被植物，有较好。

7、的观赏效果及园林应用价值。 0003 同时早开堇菜具有较高的药用价值，民间广泛用于痈疽疮毒、毒蛇咬伤等 , 它具有较强的抗菌、消炎、清热解毒作用。 0004 早开堇菜主要靠种子繁殖和根状茎繁殖，但是两种繁殖方式的繁殖率都比较低，不能满足作为地被植物用量大的需求。种子在萌发过程中对温度十分敏感，最适发芽温度为25, 在高温下(30)种子变褐色并霉烂, 在低温下(20)萌发及生长缓慢或停止生长 , 这都限制了早开堇菜的大量繁殖。 0005 早开堇菜作为野生地被植物，尚未得到开发，药源以采挖野生资源为主，资源渐少，目前早开堇菜的组织培养尚未见报道，单纯的靠野生资源并不。

8、能满足需要。因此进行早开堇菜组织快繁体系研究具有很好的发展前景，不但能够及时保护发展这一野生资源，实现可持续利用；而且还能通过组织培养的快速繁殖满足城市园林绿化对地被植物需求量大的要求。早开堇菜作为早春地被植物被广泛应用于我国城市园林绿化之中，将进一步丰富我国的地被植物景观。发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法。 0007 本发明的技术方案如下： 0008 早开堇菜组织培养及快速繁殖的方法，其关键方法参数如下： 0009 1.1 早开堇菜外植体最佳灭菌方式 0010 1.1.1 子叶节最佳的消毒方。

9、式是 75% 乙醇消毒 30s， 0.1% 升汞消毒时间在 4min。 0011 1.1.2 叶片和叶柄最佳的消毒方式是 75% 乙醇消毒 30s、 0.1% 升汞消毒 8min。 0012 1.2 初代培养 0013 1.2.1 在光照培养条件下，早开堇菜子叶节诱导丛生芽的最适培养基为 MS + 6-BA 3.0mgL-1 + NAA 0.2 mgL-1 ；叶柄诱导不定芽的最适培养基为： MS + 6-BA 3.5mgL-1 + NAA 0.2 mgL-1，叶片不适合作为直接诱导不定芽的外植体。 0014 1.2.2 三种外植体均能诱导产生愈伤组织，子叶节诱导产生愈伤组织的时间最。

10、短，其次为叶柄，叶片最晚。 0015 1.2.3 子叶节、叶片、叶柄诱导愈伤组织的最适植物生长调节剂组合为 MS + 说明书 CN 103004611 B 3 2/19 页 4 6-BA 1.5 mgL-1 + 2,4-D 1.5 mgL-1； 0016 1.3 继代培养 0017 1.3.1 丛生芽和不定芽增殖的最佳培养基为： MS + 6-BA 3.5 mgL-1 + NAA 0.2 mgL-1。 0018 1.3.2 三种外植体愈伤组织继代增殖培养的最优组合是 MS + 6-BA 1.5 mgL-1 + 2,4-D 0.75 mgL-1 + NAA 1.0 mgL-1， 0。

11、019 1.3.3早开堇菜愈伤组织分化的最佳培养基为： MS + 6-BA 3.0 mg L-1 + NAA 0.3 mgL-1； 0020 1.4 生根培养 0021 将在不添加任何激素的 MS 培养基中培养 15 天后的试管苗进行生根培养，最适合早开堇菜幼苗生根的培养基为： 1/2MS + 6-BA 1.0 mgL-1 。 0022 1.5 炼苗与移栽 0023 炼苗基质以珍珠岩:河沙:腐殖质以1:2:2的比例效果最好，植株成活率达100%，且植物的长势良好。 0024 通过本发明培育出来的早开堇菜繁殖系数大、适合大规模生产，能够解决该物种资源匮乏的问题，实现可持续利用。

12、；此外早开堇菜快速繁殖，短期内获得大量规格一致的苗木，能够满足园林绿化对其需求量大的要求，这对园林、医药都有重大意义。具体实施方式 0025 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。 0026 1.2.1 培养基 0027 （1）培养基的配置 0028 培养基配方：基本培养基（MS）添加不同种类和浓度的生长素和细胞分裂素。 0029 蔗糖浓度为 25g/L，琼脂为 6g/L , pH 值用 1mol/L 的 HCl 或者 1mo1/L 的 NaOH 调至 6.0-6.2，使用前在 121高压灭菌 20min。 0030 (2) 培养条件 0031 培养温度为。

13、 (25 士 1)，光照强度为 20-30 umol/m2s，丛生芽诱导、增殖和愈伤组织分化培养采用每日光培养 16h 和暗培养 8h 的光周期。愈伤组织诱导、增殖采用每日黑暗培养 24 小时，培养 7 天后转入上述每日光培养 12h 和暗培养 12h 的光周期。 0032 1.2.2 主要试剂 0033 (1) 主要试剂及药品 0034 植物生长调节剂 6-BA、 2,4-D、 NAA、 IBA 均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；基本培养基配方中所有试剂、蔗糖、琼脂粉、维生素以及消毒试剂等均为国产分析纯。 0035 1.2.3 仪器设备 0036 (1) 高压。

14、灭菌锅 : 主要用于植物组织培养操作中的培养基及其它多种需要无菌用品的灭菌。高压灭菌锅有多种类型，通常使用的多为手提式高压灭菌锅和大型高压灭菌锅。高压灭菌时，要求的最低压力为 1.06kg/cm2, 温度为 121 , 灭菌时间为不少于 15min, 并需要根据培养基容量的增大相应地增加灭菌时间，但最高不超过30min。本发明所用的灭菌锅为 TOMY Autoclave SS-325。说明书 CN 103004611 B 4 3/19 页 5 0037 (2) 超净工作台 : 超净工作台又称净化工作台，主要用十培养材料的接种等无菌操作过程。由于它具有机动的滤菌装置。

15、，可以在工作人员与操作对象之间形成风幕，使工作台面处于基本无菌的状态。在使用超净工作台前应先用 70% 的酒精棉将台面及周围擦净，再用紫外灯照射 3Omin 左右对台面进行灭菌，同时启动风机把贮存于机体内的含菌空气排出。经常使用的超净工作台每隔半年左右要把滤料清洗一次，否则会因滤料附着太多的灰尘而影响正常的工作。滤料清洗后，超净工作台必须启动一个小时后才能进行正常的无菌操作。由于从超净工作台中吹出的空气也不是绝对无菌的，因此操作时要借助于酒精灯进行无菌操作，否则难以达到完全无菌的效果。本发明所用的超净工作台型号为苏州安泰空气技术有限公司生产 SW-CJ-ZFD。 0。

16、038 (3) 智能人工气候箱：具有光照、加湿功能的高精度冷热恒温设备。主要用于植物材料的恒温培养、光照培养以及用于愈伤组织分化和植株再生过程的培养。气候箱的温度变化范围为 5-50（无光照）、 10 -50（有光照） , 组织培养时的使用温度常为 20-30。气候箱内通常有四层活动的金属网格，每层网格都可以放满培养瓶，但上下层培养物之间必须保留一定的空隙，以保证箱内空气的流动和温度的恒定。本研究所用的是宁波江南仪器厂制造的 RXZ 型智能人工气候箱。 0039 除了上述仪器设备以外，还用到电子天平、电炉、冰箱、容量瓶、烧杯、玻璃棒、移液管、洗耳球、。

17、量筒、酒精灯、试管、组培瓶、解剖刀、镊子、封口膜等。 0040 1.2.4 初代培养 0041 (1) 外植体的预处理和灭菌 0042 a. 子叶节处理方式 0043 采收的早开堇菜新鲜种子，挑选颜色较深、子粒饱满者摆放于培养皿中，并置于 25恒温箱中进行催芽。待胚根长出 1cm 左右，子叶恰好脱离种皮，此时发芽得到的幼苗，先用流水冲洗 3h, 然后在 1.0g/l 的多菌灵溶液中浸泡 20 分钟。冲洗干净之后的幼苗置于超净工作台上放入 75% 的乙醇中消毒 (15s、 30s、 45s) 后，用无菌水冲洗 2 次，再放入 0.1% 的升汞中消毒 (4min、。

18、6min、 8mim)，无菌水冲洗 5 次，以尽可能冲洗干净残留在外植体上的消毒液，每次 2min 以上，过程中不断摇晃。用无菌纱布吸干幼苗表面的水分，再用解剖刀切取整个子叶节，下胚轴留约 0.3cm, 接种于基本培养基（MS）中。 0044 表 1-1 子叶节消毒处理结果 0045 说明书 CN 103004611 B 5 4/19 页 6 0046 注 : 显著性测验，字母相同者差异不显著。字母不同者表示在 5%( 小写字母 ) 或 1%( 大写字母 ) 水平上差异显著。( 下同 )。 0047 实验结果表明：子叶节最佳的消毒方式是75%乙醇消毒30s， 0.。

19、1%升汞消毒时间在 4min。 0048 b. 叶片、叶柄处理方式 0049 选择健壮、无病虫害的优良植物，用剪刀剪取带叶柄的幼嫩叶片，在洗衣粉中浸泡 15min, 用毛刷轻轻刷去叶片、叶柄上残留的脏物，再用流水冲洗 3h, 然后在 1g/l 的多菌灵溶液中浸泡 30 分钟，流水冲干净残留的多菌灵。叶片、叶柄冲洗干净之后置于超净工作台上放在 75% 的乙醇中消毒 (15s、 30s、 45s) 后，用无菌水冲洗 2 次，再放入 0.1% 的升汞中消毒 (6min、 8min、 10mim)，无菌水冲洗 5 次，以尽可能洗掉残留在外植体上的消毒液，每次 2min 。

20、以上，过程中不断摇晃。用无菌纱布吸干叶片、叶柄表明的水分，叶柄剪成 0.5-1cm 左右的节段，叶片剪成 1.01.0cm2 大小接种于基本培养基（MS）中。 0050 表 1-2 叶片消毒处理结果说明书 CN 103004611 B 6 5/19 页 7 0051 0052 表 1-3 叶柄消毒处理结果说明书 CN 103004611 B 7 6/19 页 8 0053 0054 实验结果表明：叶片和叶柄最佳的消毒方式是 75% 乙醇消毒 30s、 0.1% 升汞消毒 8min。 0055 (2) 子叶节丛生芽的诱导 0056 将预处理后的子叶节接种于丛生芽诱导。

21、培养基中。基本培养基为 MS 培养基，处理激素为 :6-BA (1.5 mgL-1、 2.5 mgL-1、 3.0mgL-1), NAA（0.05 mgL-1、 0.2mgL-1、 0.8mgL-1), 进行完全实验，筛选出丛生芽诱导的最佳配方。 0057 所有的培养基均添加 25g/L 蔗糖， 6g/L 琼脂， PH 6.0-6.2， 121高压蒸汽灭菌 20min。培养温度为 (25 士 1)，光照强度为 20-30 umol/m2s，光照时间 12 h/d。没有对培养基（选择的就是基本培养基： MS）以及培养条件进行筛选，蔗糖、琼脂含量是查询了一些参考文件后确定。

22、的，本实验中仅仅对植物生长调节剂的种类和浓度进行了对照试验 0058 表 2 子叶节丛生芽诱导试验结果说明书 CN 103004611 B 8 7/19 页 9 0059 0060 实验结果表明：在光照培养条件下，早开堇菜子叶节诱导丛生芽的最适培养基均为 MS + 6-BA 3.0mgL-1 + NAA 0.2 mgL-1 。 0061 (3) 叶片、叶柄不定芽的诱导 0062 将预处理后的幼嫩叶片、叶柄接种于不定芽诱导培养基中。基本培养基 :MS，处理激素 : 6-BA (1.5 mgL-1、 3.5 mgL-1、 4.0mgL-1), NAA（0.05 mgL-1、。

23、 0.2mgL-1、 0.8mgL-1), 进行完全实验，筛选出不定芽诱导的最佳配方。 0063 所有的培养基均添加 25g/L 蔗糖， 6g/L 琼脂， PH 6.0-6.2， 121高压蒸汽灭菌 20min。培养温度为 (25 士 1)，光照强度为 20-30 umol/m2s，光照时间 12 h/d。没有对培养基（选择的就是基本培养基： MS）以及培养条件进行筛选，蔗糖、琼脂含量是查询了一些参考文件后确定的，本实验中仅仅对植物生长调节剂的种类和浓度进行了对照试验 0064 表 3 叶柄不定芽诱导试验结果 0065 说明书 CN 103004611 B 9 8/。

24、19 页 10 0066 将早开堇菜的叶片接种于培养基中，光照 15d 后观察发现从叶片切口处开始膨大， 25 天后在极少数处理中叶脉处或叶片四周开始有少量芽的分化，但生长一段时由叶片分化而来的少量不定芽很快就褐化死亡；剩下的其它处理中叶片并未分化出不定芽，并且全部褐化死亡，因此叶片不适合作为外植体直接诱导产生不定芽。 0067 实验结果表明：在光照培养条件下，早开堇菜叶柄诱导不定芽的最适培养基为 MS + 6-BA 3.5mgL-1 + NAA 0.2 mgL-1 ，叶片不适合作为直接诱导不定芽的外植体。 0068 (4) 子叶节、叶片、叶柄的愈伤组织诱导 00。

25、69 将预处理后幼嫩的叶片、叶柄、子叶节接种于愈伤组织诱导培养基中。基本培养基 :MS，处理激素 :6-BA (1.0 mgL-1、 1.5 mgL-1、 2.0 mgL-1), 2,4-D (0.5 mgL-1、 0.75 mgL-1、 1.5 mgL-1), NAA (0 mgL-1、 0.5 mgL-1、 1.0 mgL-1)，进行正交实验，筛选出愈伤组织诱导的最佳配方。 0070 所有的培养基均添加 25g/L 蔗糖， 6g/L 琼脂， PH 6.0-6.2， 121高压蒸汽灭菌说明书 CN 103004611 B 10 9/19 页 11 20min。在培养温度为。

26、 (25 士 1)天条件下暗培养 3 周，再移到同温度下光培养，光照强度为 20-30 umol/m2s，光照时间 8h/d。 0071 表 4 子叶节愈伤组织诱导培养试验结果 0072 说明书 CN 103004611 B 11 10/19 页 12 0073 表 5 叶片愈伤组织诱导诱导试验结果 0074 说明书 CN 103004611 B 12 11/19 页 13 0077 实验结果表明：子叶节、叶片、叶柄诱导愈伤组织的最适植物生长调节剂组合为 MS + 6-BA 1.5 mgL-1 + 2,4-D 1.5 mgL-1。 0075 表 6 叶柄愈伤组织诱导试验。

27、结果 0076 说明书 CN 103004611 B 13 12/19 页 14 0078 1.2.5 继代培养 0079 (1) 丛生芽和不定芽的增殖培养 0080 将由愈伤组织分化而来的不定芽、由外植体直接诱导产生的丛生芽和不定芽切割成单芽，在增殖培养基上进行继代培养， 40d 继代一次。基本培养基： MS，处理激素 :6-BA (1.5 mgL-1、 3.0 mgL-1、 3.5mgL-1),NAA（0.15 mgL-1、 0.2mgL-1、 0.4mgL-1)，进行完全实验，筛选出丛生芽和不定芽增殖的最佳培养基。 0081 所有的培养基均添加 25g/L 蔗糖， 6。

28、g/L 琼脂， PH 6.0-6.2， 121高压蒸汽灭菌 20min。培养温度为 (25 士 1)，光照强度为 20-30 umol/m2s，光照时间 12 h/d。 0082 表 7 芽的继代增殖培养试验结果 0083 说明书 CN 103004611 B 14 13/19 页 15 0084 实验结果表明：丛生芽和不定芽增殖的最佳培养基为： MS + 6-BA 3.5 mgL-1 + NAA 0.2 mgL-1。 0085 (2) 愈伤组织的增殖培养 0086 以初代培养的愈伤组织为外植体，接种在增殖培养基上使其体积长大、数量 0087 增加， 30d继代一次。基本培。

29、养基： MS，处理激素: 6-BA (1.0 mg L-1、 1.5 mg L-1、说明书 CN 103004611 B 15 14/19 页 16 2.0 mgL-1), 2,4-D (0.5 mgL-1、 0.75 mgL-1、 1.5 mgL-1), NAA (0.1mgL-1、 0.5 mgL-1、 1.0 mgL-1)，进行正交实验，筛选出愈伤组织增殖的最佳培养基。 0088 所有的培养基均添加 25g/L 蔗糖， 6g/L 琼脂， PH 6.0-6.2， 121高压蒸汽灭菌 20min。在培养温度为 (25 士 1)天条件下暗培养 3 周，再移到同温度下光培养，光。

30、照强度为 20-30 umol/m2s，光照时间 8h/d。没有对培养基（选择的就是基本培养基： MS）以及培养条件进行筛选，蔗糖、琼脂含量是查询了一些参考文件后确定的，本实验中仅仅对植物生长调节剂的种类和浓度进行了对照试验 0089 表 8 愈伤组织继代增殖培养试验结果 0090 0091 注 : 愈伤组织增殖倍数是以最初接入直径为 1.0cm 左右的愈伤为基数，根据其体积的增大来计算其增殖倍数。( 下同 ) 0092 实验结果表明：三种外植体愈伤组织继代增殖培养的最优组合是 MS + 6-BA 1.5 mgL-1 + 2,4-D 0.75 mgL-1 + NA。

31、A 1.0 mgL-1。 0093 (3) 愈伤组织不定芽的分化说明书 CN 103004611 B 16 15/19 页 17 0094 将诱导形成的愈伤组织转接到分化培养基上，使愈伤组织分化成苗。基本培养基： MS，处理激素 : 6-BA (0 mgL-1、 2.5 mgL-1、 3.0 mgL-1、 3.5mgL-1), NAA（0mgL-1、 0.05 mgL-1、 0.15mgL-1、 0.3mgL-1), 进行完全实验，筛选出丛生芽诱导的最佳配方。 0095 所有的培养基均添加 25g/L 蔗糖， 6g/L 琼脂， PH 6.0-6.2， 121高压蒸汽灭菌 20m。

32、in。培养温度为 (25 士 1)，光照强度为 20-30 umol/m2s，光照时间 12 h/d。 0096 表 9 愈伤组织分化试验结果 0097 说明书 CN 103004611 B 17 16/19 页 18 0098 实验结果表明：早开堇菜愈伤组织分化的最佳培养基为： MS + 6-BA 3.0 mgL-1 + NAA 0.3 mgL-1。 0099 1.2.6 生根培养 0100 将健壮的单苗进行生根诱导培养。生根基本培养基 (MS、 1/2MS、 1/4MS)， 6-BA(0.5 说明书 CN 103004611 B 18 17/19 页 19 mgL-1、。

33、0.75 mgL-1、 1.0mgL-1)、 NAA（0 mgL-1、 0.5mgL-1、 1.0 mgL-1), 进行正交实验，筛选出单苗诱导生根的最佳配方。 0101 所有的培养基均添加 25g/L 蔗糖， 6g/L 琼脂， PH 6.0-6.2， 121高压蒸汽灭菌 20min。培养温度为 (25 士 1)，光照强度为 20-30 umol/m2s，光照时间 12 h/d。 0102 表 10 不同培养基和植物植物生长调节剂组合对试管苗生根的影响 0103 说明书 CN 103004611 B 19 18/19 页 20 0104 实验结果表明：最适合早开堇菜幼苗生根的培。

34、养基为： 1/2MS + 6-BA 1.0 mgL-1 。 0105 1.2.7 炼苗与移栽说明书 CN 103004611 B 20 19/19 页 21 0106 待生根苗根长 2cm，苗高 5-6cm 时，在封口膜上密刺小孔，于温室散射光下培养，第 4d 揭开 1/4 的封口膜，第 7d 揭开 1/2 封口膜，第 10d 将封口膜全部揭开，第 13d 将试管苗轻轻取出来，洗净根部的培养基，移栽在用珍珠岩、河沙、腐殖质按一定比例配成的基质中。 0107 炼苗前，使用 0.1% 的高锰酸钾对基质进行消毒处理。苗栽后浇透水一次，初期可加盖遮阳网，注意遮荫保温保湿，温度保持 20-30，湿度保持 80% 以上。 0108 实验结果表明：炼苗基质以珍珠岩:河沙:腐殖质以1:2:2的比例效果最好，植株成活率达 100%，且植物的长势良好。 0109 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。说明书 CN 103004611 B 21 。

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