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1、(10)申请公布号 CN 103768513 A (43)申请公布日 2014.05.07 CN 103768513 A (21)申请号 201310670119.5 (22)申请日 2013.12.10 A61K 36/9066(2006.01) A61K 9/20(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 33/04(2006.01) A61K 33/06(2006.01) (71)申请人 济南新起点医药科技有限公司 地址 250001 山东省济南市市中区 288 号恒 昌大厦 2303 (72)发明人 孙波 (54) 发明名称 一种胆石通利片的制备方法及其在制备。
2、抑制 畸胎瘤细胞 P19 细胞增殖药物中的应用 (57) 摘要 本发明属于中药技术领域， 具体涉及一种胆 石通利片的制备方法及应用。本发明的胆石通利 片的制备方法， 由金钱草 225g、 茵陈 225g、 郁金 90g、 陈皮 150g、 黄芩 45g、 乳香 35g、 芒硝 80g、 白 矾 35g、 大黄 45g、 三棱 45g、 栀子 45g、 甘草 25g、 没 药 35g 作为原料药制成， 采用超微粉碎、 超临界萃 取、 微波萃取和大孔树脂吸附制备而成， 使得橙皮 苷含量有很大提高。本发明还提供了胆石通利片 在制备抑制小鼠畸胎瘤细胞 P19 细胞增殖药物中 的应用。 (51)Int.。
3、Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103768513 A CN 103768513 A 1/1 页 2 1. 一种胆石通利片的制备方法， 由金钱草 225g、 茵陈 225g、 郁金 90g、 陈皮 150g、 黄芩 45g、 乳香 35g、 芒硝 80g、 白矾 35g、 大黄 45g、 三棱 45g、 栀子 45g、 甘草 25g、 没药 35g 作为原 料药制成， 其特征在于， 所述的制备方法由下列步骤组成 ： 芒硝、 白矾超微粉碎成粒度范围 5-45m 的细粉备用。
4、 ； 取乳香、 没药， 粉碎成细粉， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹 带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 4-6%， 萃取压力 15-30MPa， 温度 30-50， CO2流 量 l-3ml/g 生药min， 萃取时间 180-220min， 得超临界萃取物， 备用 ； 萃取后的乳香、 没药 残渣与其他九味药材， 粉碎， 加入 3.6L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃 取功率 600-800W， 萃取 2 次， 每次 5-10 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 Diaion HP-10 大孔吸 附树脂柱上， 70% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体。
5、积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波 提取物， 将超微粉碎后的芒硝、 白矾、 超临界萃取物、 微波提取物混合加入淀粉， 70% 乙醇制 颗粒， 干燥， 压片， 制成 500 片， 每片重 0.3g。 2.根据权利要求l所述的胆石通利片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取中 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 5%。 3.根据权利要求l所述的胆石通利片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取中 萃取压力为 25MPa。 4.根据权利要求l所述的胆石通利片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取中 萃取温度为 60。 5.根据权利要求l所述的胆石通利片的制备方。
6、法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取中 CO2流量 2ml/g 生药min。 6.据权利要求l所述的胆石通利片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取中萃 取时间为 200min。 7. 根据权利要求 l 所述的胆石通利片的制备方法， 其特征在于， 所述微波萃取功率为 700W。 8. 根据权利要求 l 所述的胆石通利片的制备方法， 其特征在于， 所述微波萃取每次萃 取时间为 8 分钟。 9.权利要求l所述的胆石通利片在制备抑制小鼠畸胎瘤细胞P19细胞增殖药物中的应 用。 权 利 要 求 书 CN 103768513 A 2 1/5 页 3 一种胆石通利片的制备方法及其在制备抑制畸。
7、胎瘤细胞 P19 细胞增殖药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于中药技术领域， 具体涉及一种胆石通利片的制备方法及其在制备抑制 小鼠畸胎瘤细胞 P19 细胞增殖药物中的应用。 背景技术 0002 胆石通利胶囊标准号 WS-10324（ZD-0324） -2002， 记载于国家中成药标准汇编内 科肝胆分册。由金钱草 225g、 茵陈 225g、 郁金 90g、 陈皮 150g、 黄芩 45g、 乳香 35g、 芒硝 80g、 白矾35g、 大黄45g、 三棱45g、 栀子45g、 甘草25g、 没药35g作为原料药制成， 具有清热利胆， 化瘀排石的功效。用于肝胆湿热所致的急、 慢性胆囊炎，。
8、 胆结石等。 0003 现有技术中， 尚未有胆石通利胶囊在提取制备方面采用超微粉碎、 CO2超临界萃 取、 微波技术和大孔树脂吸附技术提取的报道， 而中药直接打粉取、 水煎煮的方法， 工艺粗 糙、 落后， 杂质多， 导致患者用量过大， 不方便服用， 严重影响了本品在临床上应用。 发明内容 0004 为了解决上述的技术问题， 本发明提供了一种胆石通利片的制备方法。 0005 本发明的另一个目的在于提供一种胆石通利片在制备抑制小鼠畸胎瘤细胞 P19 细胞增殖药物中的应用。 0006 本发明的目的是通过如下的方案实现的 ： 0007 一种胆石通利片的制备方法， 由金钱草 225g、 茵陈 225g、。
9、 郁金 90g、 陈皮 150g、 黄 芩 45g、 乳香 35g、 芒硝 80g、 白矾 35g、 大黄 45g、 三棱 45g、 栀子 45g、 甘草 25g、 没药 35g 作 为原料药制成， 所述的制备方法由下列步骤组成 ： 芒硝、 白矾超微粉碎成粒度范围 5-45m 的细粉备用 ； 取乳香、 没药， 粉碎成细粉， 加入到CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带 剂占总萃取溶剂的体积百分比为 4-6%， 萃取压力 15-30MPa， 温度 30-50， CO2流量 l-3ml/ g 生药min， 萃取时间 180-220min， 得超临界萃取物， 备用 ； 萃取后的乳香、 没药残。
10、渣与其 他九味药材， 粉碎， 加入 3.6L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 600-800W， 萃取 2 次， 每次 5-10 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 Diaion HP-10 大孔吸附树脂 柱上， 70% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 将超微粉碎后的芒硝、 白矾、 超临界萃取物、 微波提取物混合加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干 燥， 压片， 制成 500 片， 每片重 0.3g。 0008 上述的胆石通利片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂的 体积百分比为 5%。
11、。 0009 上述的胆石通利片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中萃取压力为 25MPa。 0010 上述的胆石通利片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中萃取温度为 60。 0011 上述的胆石通利片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中 CO2流量 2ml/g 生 药min。 说 明 书 CN 103768513 A 3 2/5 页 4 0012 上述的胆石通利片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中萃取时间为 200min。 0013 上述的胆石通利片的制备方法中， 所述微波萃取功率为 700W。 0014 上述的胆石通利片的制备方法中， 所述微波萃取每次萃取时间为 8 分钟。。
12、 0015 上述的胆石通利片在制备抑制小鼠畸胎瘤细胞 P19 细胞增殖药物中的应用。 0016 现有技术中， 胆石通利胶囊口服， 一次5粒， 一日3次。 胆石通利胶囊服药量大。 采 用本发明方法制备成的胆石通利片每片重0.3g， 每次仅需2片， 一日服用3次。 在具有更多 活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。 0017 试验一、 不同方法制备的胆石通利片中橙皮苷含量的比较 0018 l、 仪器及试药本发明胆石通利片 ： 按实施例 1 方法制备， 使用 1080g 原料药， 经提 取制成 500 片， 每片重 0.3g。原胆石通利胶囊， 按照 WS-10324（ZD-0。
13、324） -2002 标准方法 制备， 作为对照。Agilent1200 高效液相色谱仪 ； AE240 电子分析天平 ； 橙皮苷对照品 （中国 药品生物制品检定所） 。 0019 2、 方法 0020 照高效液相色谱法 ( 中国药典 2010 年版一部附录 V D) 测定。 0021 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂 ； 甲醇水 （40 60） 为流动相 ； 检测波长为 284nm ； 理论板数按橙皮苷峰计算应不低于 3000。 0022 对照品溶液的制备精密称取橙皮苷对照品适量， 加甲醇制成每 1ml 含 38g 的溶 液， 即得。 0023 本发明产品供试品溶液的制。
14、备取本发明的胆石通利片， 研细， 取 0.06g， ， 精密称 定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入稀乙醇 25ml， 称定重量， 密塞， 超声处理 （功率 250w， 频率 30kHz） 40 分钟， 放冷， 称定重量， 并用稀乙醇补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。 0024 对照品供试品溶液的制备取本对照的胆石通利胶囊， 混匀， 研细， 取 0.15g， 精密 称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入稀乙醇 25ml， 称定重量， 密塞， 超声处理 （功率 250w， 频率 30kHz） 40 分钟， 放冷， 称定重量， 并用稀乙醇补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。
15、。 0025 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。 0026 3、 结果 0027 结果表明， 本发明胆石通利片中橙皮苷的含量为 6-10mg/ 片 ； 而原胆石通利胶囊 中橙皮苷的含量为1.45mg/粒， 每片橙皮苷含量相当于原胶囊剂含量的4-6倍， 在服用量减 少的情况下， 橙皮苷含量有很大提高。 0028 上述研究表明， 采用本发明制备方法制备的胆石通利片， 有效成分含量远远高于 WS-10324（ZD-0324） -2002 标准记载的方法制备的胆石通利胶囊。 具体实施方式 0029 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明， 以便本。
16、领域的技术人员更了解 本发明， 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述 内容所实现的技术均属于本发明的范围。 0030 实施例 1 0031 取金钱草 225g、 茵陈 225g、 郁金 90g、 陈皮 150g、 黄芩 45g、 乳香 35g、 芒硝 80g、 白 说 明 书 CN 103768513 A 4 3/5 页 5 矾 35g、 大黄 45g、 三棱 45g、 栀子 45g、 甘草 25g、 没药 35g ： 将芒硝、 白矾超微粉碎成粒度范 围 5-45m 的细粉备用 ； 取乳香、 没药， 粉碎成细粉， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为 夹。
17、带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%， 萃取压力25MPa， 温度40， CO2流量2ml/ g 生药min， 萃取时间 200min， 得超临界萃取物， 备用 ； 萃取后的乳香、 没药残渣与其他九 味药材， 粉碎， 加入 3.6L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 700W， 萃取 2 次， 每次 8 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 Diaion HP-10 大孔吸附树脂柱上， 70% 乙醇 洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 将超微粉碎后 的芒硝、 白矾、 超临界萃取物、 微波提取物混合加入淀粉， 7。
18、0% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 500 片， 每片重 0.3g。 0032 经检测， 成品中橙皮苷的含量为 9.86mg/ 片。 0033 实施例 2 0034 取金钱草 225g、 茵陈 225g、 郁金 90g、 陈皮 150g、 黄芩 45g、 乳香 35g、 芒硝 80g、 白 矾 35g、 大黄 45g、 三棱 45g、 栀子 45g、 甘草 25g、 没药 35g ： 将芒硝、 白矾超微粉碎成粒度范 围 5-45m 的细粉备用 ； 取乳香、 没药， 粉碎成细粉， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为 夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%， 萃取压力30MPa。
19、， 温度50， CO2流量3ml/ g 生药min， 萃取时间 180min， 得超临界萃取物， 备用 ； 萃取后的乳香、 没药残渣与其他九 味药材， 粉碎， 加入 3.6L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 600W， 萃取 2 次， 每次 8 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 Diaion HP-10 大孔吸附树脂柱上， 70% 乙醇 洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 将超微粉碎后 的芒硝、 白矾、 超临界萃取物、 微波提取物混合加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 500 片， 每片重 0。
20、.3g。 0035 经检测， 成品中橙皮苷的含量为 6.42mg/ 片。 0036 实施例 3 0037 取金钱草 225g、 茵陈 225g、 郁金 90g、 陈皮 150g、 黄芩 45g、 乳香 35g、 芒硝 80g、 白 矾35g、 大黄45g、 三棱45g、 栀子45g、 甘草25g、 没药35g ： 将芒硝、 白矾超微粉碎成粒度范围 5-45m 的细粉备用 ； 取乳香、 没药， 粉碎成细粉， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹 带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 6%， 萃取压力 15MPa， 温度 30， CO2流量 1ml/g 生药min， 萃取时间 220mi。
21、n， 得超临界萃取物， 备用 ； 萃取后的乳香、 没药残渣与其他九味 药材， 粉碎， 加入 3.6L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 800W， 萃 取 2 次， 每次 10 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 Diaion HP-10 大孔吸附树脂柱上， 70% 乙醇 洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 将超微粉碎后 的芒硝、 白矾、 超临界萃取物、 微波提取物混合加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 500 片， 每片重 0.3g。 0038 经检测， 成品中橙皮苷的含量为 8.26mg/ 片。
22、。 0039 实施例 4 ： 胆石通利片抑制小鼠畸胎瘤细胞 P19 细胞增殖的实验研究资料 0040 1. 实验材料 0041 1.1 实验用细胞株 0042 小鼠畸胎瘤细胞 P19 细胞， 山东大学实验室细胞库， DMEM+10%FBS 常规培养。 0043 1.2 实验药物 说 明 书 CN 103768513 A 5 4/5 页 6 0044 研究药物 ： 本发明胆石通利片 ： 按实施例 1 方法制备。 0045 药液储液 ： 称取 100mg 胆石通利片， 溶于 5ml 无水乙醇中， 0.2m 滤器过滤， 500ldoff 管分装， -20存储， 同时 0.2m 滤器过滤无水乙醇以备对。
23、照组之用。 0046 1.3 实验试剂 0047 DMEM(GIBCO 公司 Cat.No.12100-061 Lot.No.758137) ； 胎牛血清 （浙江天杭生物 科技有限公司 Lot.No.100419） ； NaHCO3( 上海久亿化学试剂有限公司 Cat.No.11810-033 Lot.No.1088387) ； Trypsin（AMRESCO 公司） ； EDTA（AMRESCO 公司） ； Penicillin G Sodium Salt （AMRESCO公司1） ； Streptomycin Sulfate(AMRESCO) ； 无水乙醇 （淄博亚杜兰经贸有限 公司） ；。
24、 MTT(Biosharp 批号 ： 0793) ： PBS（实验室自配） ； 0048 1.4 实验器材 0049 莱卡倒置显微镜 （德国 Leica 型号 ： DMIL） ； 可见 - 紫外光微孔板检测仪 （美国 MD 公 司型号 ： SPECTRAMAX190） ； CO2培养箱 （FORMA型号 ： 3111） ； 超净台 （苏净集团安泰公司制造型 号 ： SW-CJ-ZFD） ； 纯水仪 （美国 Sprlng 公司型号 ： S/N020579） ； 精密移液器 （法国吉尔森公司 型号 ： P2） ； 电子天平 （德国赛多利斯有限公司型号 ： BT323S） ； 全自动高压灭菌锅 （日。
25、本 SANYO 公司型号 ： MLS-3020） ； 台式电热鼓风干燥箱 ( 上海精密实验设备公司型号 ： DHG9123A) ； 冰 箱 ( 西门子公司型号 ： KG18V21TI) ； 液氮罐 （CBS 型号 ： 2001） ； 低速离心机 （上海安亭科学仪 器厂型号 ： KA-1000） ； 0.2m 滤器 （MILLIPORE 型号 ： SLGP033RB） ； 1cm 培养皿 (NEST 公司 )、 96 孔培养板 （NEST 公司） ； 细胞计数板 ； 离心管、 移液管、 Tips 若干。 0050 2. 实验方法 0051 1)P19 细胞用 DMEM+10%FBS 于 37、 。
26、5%CO2进行常规培养 （10cm 培养皿） ， 当细胞生 长至对数期时， 收集细胞， 弃去培养液， PBS 轻洗 3 遍， 加入 3ml0.25% 胰蛋白酶 -0.04%EDTA， 37消化 2min 后， 向其中加入 5ml 完全培养基中和反应， 吹打细胞后将其转入离心管中， 1000rpm 离心 5min， 调整细胞悬液浓度 3104个 /ml。 0052 2)将细胞种入96孔培养板中， 每孔加入细胞悬液180l， 培养板放入细胞培养箱 中 (37， 5%CO2) 常规培养。 0053 3) 根据细胞生长情况， 一般长至 50%-70%， 加入胆石通利片溶液， 继续培养 24h。 005。
27、4 4)24h 后加入 20l MTT 溶液 （5mg/ml， 即 0.5%MTT） ， 继续培养 4h。 0055 5)4h 后扣板法倒去上清， 用吸水纸轻轻拍干， 每孔如入 200l 二甲基亚砜， 置摇 床上低速振荡10min， 使结晶物充分溶解。 在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。 0056 6) 同时设置本底 （不加细胞， 只加培养液） ， 对照孔 （细胞、 相同浓度的药物溶解介 质、 培养液、 MTT、 二甲基亚砜） ， 每组设定 6 个复孔。 0057 7) 结果以药物对细胞的抑制率表示 ： 细胞增值抑制率 (%)=（对照孔 OD 值 - 给药 孔 OD 值） 、 对照。
28、孔 OD 值 100%。实验重复 3 次。 0058 3. 统计处理 0059 采用Microsoft Excel2007软件中的相关分析和Studentt检验， 数据以meanS. D. 表示。 0060 4. 实验结果 0061 MTT 法实验后统计结果显示， 与对照组比较， 当剂量达到 5mg/ml 时， 对 P19 细胞 增殖抑制有差异 (P0.05)， 剂量在 10mg/ml 时该差异具有显著性 (P0.01)， 当剂量达到 说 明 书 CN 103768513 A 6 5/5 页 7 15-20mg/ml 时有极显著性差异 (P0.001)。 0062 表 1 胆石通利片对 P19 细胞增殖抑制影响研究 (XSD) 0063 组别药物浓度 （mg/ml）抑制率 （%） 对照组00 158.426.57 21016.849.07* 31533.4510.52* 42042.0515.48* 0064 注 ： 与对照组比较， *P0.01 ； *P0.001。 0065 5. 实验结论 0066 胆石通利片可以抑制P19细胞增殖， 减少P19细胞的细胞生长数目， 该作用呈剂量 依赖性。 说 明 书 CN 103768513 A 7 。