抑制感染组合物及含有该组合物的饮食品.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103751223 A (43)申请公布日 2014.04.30 CN 103751223 A (21)申请号 201110313677.7 (22)申请日 2011.10.17 A61K 36/06(2006.01) A23L 1/29(2006.01) A61P 31/00(2006.01) A61K 35/74(2006.01) (71)申请人 陈双露 地址 210024 江苏省南京市江宁开发区将军 大道 20 号 (72)发明人 陈双露 (54) 发明名称 抑制感染组合物及含有该组合物的饮食品 (57) 摘要 本发明提供了经口摄入后对病原菌等的感染 显现出良好。

2、抑制效果的抑制感染组合物和含有该 组合物的饮食品。所述组合物含有作为有效成分 的异伞菌的子实懒 6/ 或菌丝体培养物的萃取物 和乳酸菌的加热处理菌体。前述乳酸菌最好为 粪肠球菌。最好含有 0.5-99.5 质量的前述异 伞菌的子实体及 / 或菌丝体培养物的萃取物和 99.5-0.5 质量的前述乳酸菌的加热处理菌体。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103751223 A CN 103751223 A 1/1 页 2 1. 抑制感染。

3、组合物， 其特征在于， 含有作为有效成分的异伞菌的子实体及 / 或菌丝体 培养物的萃取物和乳酸菌的加热处理菌体。 2. 如权利要求 1 所述的抑制感染组合物， 其中， 前述乳酸菌为粪肠球菌。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的抑制感染组合物， 其中， 含有 0.5 99.5 质量的前述异 伞菌的子实体及 / 或菌丝体培养物的萃取物和 99.5 0.5 质量的前述乳酸菌的加热处 理菌体。 4. 饮食品， 所述饮食品含有权利要求 1 3 中任一项所述的抑制感染组合物。 5. 如权利要求 4 所述的饮食品， 其中， 1 餐份含有 0.01 10g 前述抑制感染组合物。 权 利 要 求 书 CN 1。

4、03751223 A 2 1/6 页 3 抑制感染组合物及含有该组合物的饮食品 技术领域 0001 本发明涉及以异伞菌萃取物和乳酸菌的加热处理菌体为有效成分的抑制感染组 合物及含有该组合物的饮食品。 背景技术 0002 众所周知， 属于担子菌纲伞菌科真菌的异伞菌(Agaricus blazei Murill)是具有 癌症、 过敏症、 糖尿病、 高血压等的预防和治疗效果的成分， 例如， 作为抗肿瘤活性成分， 可 分别从其子实体分离出酸性多糖体 ( 日本专利公开公报昭 64-67194 号 )、 中性多糖体 ( 日 本专利公开公报昭 64-67195 号 ) 及蛋白多糖体 ( 日本专利公开公报平 。

5、2-78630 号 )， 从菌 丝体中分离出蛋白多糖体 ( 日本专利公开公报昭 61-47518 号 )， 进一步从菌丝体的培养滤 液中分离出蛋白多糖体 ( 日本专利公开公报昭 61-47519 号 )。 0003 异伞菌作为健康食品原料被广泛利用。例如， 日本专利公开公报 2001-103927 号 揭示了在加压条件下用水性溶剂对伞菌进行萃取， 然后用 50的乙醇对该萃取物进行处 理， 再将所得伞菌浸膏混入食品而制得的食用组合物。 0004 日本专利公开公报 2001-17130 号揭示了含有伞菌的健康饮料食品， 该健康饮料 食品的特征是在伞菌的煎液中混入了醋和蜂蜜。 0005 日本专利公开。

6、公报平 11-32723 号揭示了利用以半纤维素酶为主的酶对伞菌的菌 丝体、 子实体及它们的混合物或它们的培养残液进行分解处理， 获得 p 一葡聚糖， 以含有大 量这种 B 一葡聚糖的生理活性物质为主成分的健康食品。 0006 此外， 乳酸菌也已作为健康食品被广泛摄取， 具有改善肠内菌丛的平衡、 减少肠内 腐败物的产生、 改善粪便性状和免疫激活的效果。例如， 日本专利公开公报 2001-48796 号 揭示了以粪肠球菌 ADl01 菌株的死菌体为主成分的免疫调节剂。 0007 日本专利公开公报平 10-29946 号揭示了以乳酸菌或其处理物为有效成分的体液 免疫恢复剂， 该恢复剂具有使因药剂而。

7、下降的体液免疫机能恢复的作用。日本专利公开公 报平 6-80575 号揭示了以乳酸菌菌体及 / 或菌体含有物为有效成分的经口免疫激活剂。 0008 日本专利公开公报平 5-252900 号揭示了包含乳酸菌菌体的细胞质成分及 / 或细 胞质成分含有物的免疫激活组合物。 发明内容 0009 如上所述， 异伞菌和乳酸菌虽然作为健康食品被广泛利用， 但它们单独被摄取时 的生理效果并不十分理想。 0010 因此， 本发明的目的是提供经口摄取对病原菌等的感染可显现出良好的抑制效果 的抑制感染组合物及含有该组合物的饮食品。 0011 本发明者们为了达到上述目的认真研究后发现， 并用异伞菌的萃取物和乳酸菌的 。

8、加热处理菌体， 能够对病原菌的感染显现出较强的抑制作用， 从而完成了本发明。 0012 即， 本发明 1 是抑制感染组合物， 该组合物的特征是含有作为有效成分的异伞菌 说 明 书 CN 103751223 A 3 2/6 页 4 的子实体及 / 或菌丝体培养物的萃取物和乳酸菌的加热处理菌体。 0013 本发明1利用异伞菌的子实体及/或菌丝体培养物的萃取物及乳酸菌的加热处理 菌体所具备的免疫赋活活性的协同效果， 提供了对病原菌等的感染显现出较强抑制作用的 抑制感染组合物。 0014 本发明 1 中的乳酸菌较好为粪肠球菌 (EnterococCUS faecalis)， 此外， 最好含有 0.5 。

9、99.5 质量的前述异伞菌 (Agaricus blazei Murill) 的子实体及 / 或菌丝体培养 物的萃取物和 99.5 0.5 质量的前述乳酸菌的加热处理菌体。这样可提供能够更有效 地对病原菌等的感染进行抑制的抑制感染组合物。 0015 发明 2 是提供含有上述抑制感染组合物的饮食品。 0016 本发明 2 中， 前述抑制感染组合物对应于 1 餐份的含量最好为 0.01 10g。 0017 本发明的抑制感染组合物中由于含有作为食品摄入的异伞菌的子实体及 / 或菌 丝体培养物的萃取液和乳酸菌的加热处理菌体作为有效成分， 所以比以往安全性高， 通过 摄入上述萃取液和加热处理菌体， 可对。

10、病原菌等产生良好的感染预防效果。将本发明的抑 制感染组合物添加到饮食品中， 可提供能够预防病原菌等的感染的饮食品。 0018 虽然目前还未明确本发明的抑制感染组合物的抑制感染效果的作用机理， 但通过 同时摄入异伞菌的子实体及 / 或菌丝体培养物的萃取液和乳酸菌的加热处理菌体， 可使以 巨噬细胞、 NK 细胞及 T 细胞为中心的细胞免疫系统活化， 有效排除病原菌等。 附图说明 0019 图 1 表示感染单核细胞增生利斯特氏菌后的小鼠生存率。 0020 图 2 表示感染单核细胞增生利斯特氏菌后的小鼠脾脏中的单核细胞增生利斯特 氏菌数的测定结果。 0021 图 3 表示通过 ELISA 法测定的肠系。

11、膜淋巴结细胞 (MLN) 培养液的上清液中的细胞 因子量 (IL-2、 IL-10、 IL-12、 IFN-Y)。 具体实施方式 0022 作为本发明的抑制感染组合物的有效成分之一的异伞菌的子实体萃取物可由水、 乙醇等溶剂直接萃取获得， 也可用水、 乙醇等溶剂萃取其干燥物而获得。例如， 加入干燥异 伞菌子实体质量的约 20 倍的水， 于 120进行 30 分钟萃取， 然后对所得萃取液进行适当浓 缩和干燥。 0023 此外， 可在含有碳源及氮源的培养基中对异伞菌的种菌进行培养， 然后直接萃取 而获得异伞菌的菌丝体培养物的萃取物， 或者如前所述对其干燥品进行萃取。 0024 本发明还可使用市售的异。

12、伞菌子实体及 / 或菌丝体培养物的萃取物。 0025 作为本发明的抑制感染组合物的另一有效成分的乳酸菌的加热处理菌体是对乳 酸菌体进行加热处理而获得的死菌体， 例如可通过以下方法获得。 0026 在培养基中， 于 30 45对乳酸菌培养 12 72 小时后， 通过离心分离等适当手 段回收菌体。对回收的菌体进行水洗和浓缩， 在 80 115对该浓缩的菌体悬浮液进行 30 分钟 3 秒钟的加热处理后， 通过喷雾干燥和冷冻干燥等适当手段进行干燥而获得上述死 菌体。上述乳酸菌包括粪肠球菌、 屎肠球菌、 嗜酸乳杆菌、 干酪乳杆菌、 德氏乳杆菌、 瑞士乳 说 明 书 CN 103751223 A 4 3/。

13、6 页 5 杆菌、 长双歧杆菌、 短双歧杆菌、 唾液链球菌嗜热亚种等。本发明最好使用具有更强的免疫 赋活活性的粪肠球菌 (ATCC 19433， ATCC 14508， ATCC 23655)。可使用的粪肠球菌的加热 处理菌体包括 EFPOWER、 EF-2001( 商品名， 康贝株式会社制 ) 和 FK-23( 商品名， koqikoqi 制药株式会社制 ) 等市售品。 0027 发明的抑制感染组合物中最好包含 0.5-99.5 质量的前述异伞菌的子实体及 / 或菌丝体培养物的萃取物和 99.5 0.5 质量的前述乳酸菌的加热处理菌体。更好是包 含 10 90 质量的异伞菌的子实体及 / 或。

14、菌丝体培养物的萃取物和 90 10 质量的乳 酸菌的加热处理菌体。各有效成分的含量如果在上述范围之外， 则协同抑制感染效果不理 想。 0028 本发明的抑制感染组合物中除了包含上述基本成分之外， 还可包含赋形剂、 甜味 剂、 酸味剂、 维生素和矿物质。 此外， 对其形态无特别限定， 可以是粉末、 颗粒、 片剂、 胶囊剂、 溶液剂等， 可根据使用目的的不同作适当选择。 0029 本发明的抑制感染组合物的有效摄入量是成人 1 天 0.01 10g， 更好为 0.05 2g。 0030 本发明的抑制感染组合物可添加到各种饮食品中， 例如， 饮料、 冻胶、 糖果、 口香 糖、 可加热食品、 快餐食品等。

15、。上述抑制感染组合物的添加量对应于 1 餐份较好为 0.01 10g， 更好为 0.05 2g。抑制感染组合物的添加量如果不足 0.01g， 则即使摄入也不能够获 得足够的抑制感染效果， 如果超过 10g， 则成本过高。 0031 以下， 通过实施例对本发明进行具体说明。以下例子中的试样使用作为异伞菌的 子实体萃取物的 “仙生露” (商品名， 协和工程株式会社制)和作为粪肠球菌(Enterococcus faecalis) 的加热处理菌体的 “EF-2001” ( 商品名， 康贝株式会社制 )。 0032 试验例 ( 粪肠球菌的加热处理菌体的急性口服毒性试验 ) 0033 以 OECD Gui。

16、de“nes for the Chemicals 401(1981) 为基准， 用小鼠进行急性口 服毒性试验。 0034 具体来讲， 将粪肠球菌的加热处理菌体悬浮于精制水中， 调制出试验溶液 (250mg/ mL)。灌入上述试验溶液和精制水后， 1 天观察 1 次 ( 观察期为 14 天 )， 两组都未出现死亡 例。观察期结束后对所有小鼠进行解剖， 其主要脏器也未见异常。 0035 此外， 灌入试验溶液和精制水后第 7 天和第 14 天测定小鼠体重， 通过 t 检验法以 显著性水平 5进行组间的比较， 其结果如表 1 所示 . 0036 表 1 0037 说 明 书 CN 103751223 。

17、A 5 4/6 页 6 0038 用平均值 标准差 (n 10) 表示体重 0039 从表 1 可看出， 不论雌雄各组均未见体重增加有差异。从上述结果可看出， 一次经 口摄入粪肠球菌的加热处理菌体的小鼠的 LD50值在 5000mg/kg 体重以上。 0040 实施例 1 0041 将 40 只 7 周龄的 BALB/c 雌性小鼠分为 4 组 ( 每组 10 只 )， 分别用胃探子给试验 组的小鼠强行经口服用异伞菌的子实体萃取浸膏 ( 干燥子实体 0.3mg/ 只 ) 和粪肠球菌的 加热处理菌体 (10ug/ 只 ) 的混合物， 给比较组 1 的小鼠强行经口服用粪肠球菌的加热处理 菌体 (20。

18、ug/ 只 )， 给比较组 2 的小鼠强行经口服用异伞菌的子实体萃取浸膏 ( 干燥子实体 0.6mg/ 只 )， 给对照组的小鼠强行经口服用 PBS(0.2mL/ 只 )， 1 周内每天 1 次。 0042 然后， 在小鼠腹腔内注射单核细胞增生利斯特氏菌 (Listeriamonocytogenes)， 达 到 2105CFU/ 只， 观察各组小鼠的生存率。试验期间， 小鼠可自由摄入水及饲料 ( 商品名 “粉末饲料 CE-2” ， 日本夕 kenea 株式会社制 )。 0043 其结果如图 1 所示。从图 1 可看出， 试验组、 比较组 1 和 2 与对照组相比， 显现出 非常高的生存率。特别。

19、是试验组的小鼠没有 1 只死亡， 这说明单核细胞增生利斯特氏菌的 感染和增殖得到了抑制实施例 2 与实施例 1 同样， 从试验前 1 周开始每天 1 次使各组小鼠 强行经口服用试样， 然后使小鼠感染单核细胞增生利斯特氏菌。然后， 摘取小鼠的脾脏， 测 定脾脏感染的单核细胞增生利斯特氏菌数的变化。具体来讲， 在感染后的第 1、 3、 5、 7 天摘 取脾脏， 将脾脏磨碎后， 悬浮于 PBS 中， 对悬浮液进行逐步稀释后， 将其移入 “单核细胞增生 利斯特氏菌的增菌培养基” ( 商品名， MERCK 公司制 ) 中进行培养 (25， 48 小时 )， 测定出 现的菌落数， 其结果如图 2 所示。 。

20、0044 从图2可看出， 感染后第3天以后对照组的单核细胞增生利斯特氏菌数量增加， 而 试验组、 比较组 1 和 2 的菌数减少， 特别是试验组的菌数减少比例较大。 0045 从这些结果可看出， 经口同时摄入异伞菌的子实体萃取浸膏和粪肠球菌的加热处 理菌体与它们分别单独摄入相比， 前者显现出更好的抑制感染效果。 0046 实施例 3 0047 通过以下方法对经口同时摄入异伞菌的子实体萃取浸膏和粪肠球菌的加热处理 菌体时的抑制感染作用机理进行探讨。 0048 (1)CD3 阳性 d p 型 T 细胞的表面抗原解析检疫验收结束后， 将经过了 1 周预备饲 养的 BALB/c 小鼠 ( 雌性 7 周。

21、龄， qiluniba 一株式会社购入 ) 分为 2 组 ( 每组 3 只 )， 分别 用胃探子给试验组的小鼠强行经口服用异伞菌的子实体萃取浸膏(干燥子实体0.2mg/只) 说 明 书 CN 103751223 A 6 5/6 页 7 和粪肠球菌的加热处理菌体 (20ug/ 只 ) 的混合物 (0.2mL/ 只 )， 给对照组的小鼠强行经口 服用 PBS(0.2mL/ 只 )， 1 周内每天 1 次。然后， 从小鼠的尾静脉注射入单核细胞增生利斯 特氏菌， 达到 1.4104CFU/ 只。在饲养期间， 小鼠可自由摄入水和饲料 ( 商品名 “粉末饲料 CE-2” ， 日本夕 L 丁株式会社制 )。。

22、 0049 接种单核细胞增生利斯特氏菌后的第 5 天杀死各组的小鼠， 摘取其肠系膜淋巴 结， 用毛玻璃夹住肠系膜淋巴结， 使其悬浮于含有 10 FBS 的 RPMI-1640 培养液 ( 商品名， Invitrogen 制 )， 洗涤后用不锈钢筛网除去多余的组织片， 分别调制试验组及对照组的肠 系膜淋巴结细胞 ( 以下称为 MLN)。 0050 使各 MLN 悬浮于含有 10的 FBS 的 RPMI-1640 培养液中， 达到 5105个 /mL， 在 6 孔板 (Corning Costar Co. 制 ) 的每 1 个孔中加入 1mL 培养液。然后， 0051 在每 1 个孔中混入经过作为。

23、刺激物的丝裂霉素 C( 协和发酵工业制 ) 处理过的来 自未经处理的 BALB/c 小鼠的脾细胞 (5105个 ) 及单核细胞增生利斯特氏菌的加热死菌 体 (1.0106CFU)， 于 37在 5的 CO2存在下培养 48 小时。 0052 上述未经处理的小鼠是指未服用过供试物质且未经过细菌接种的小鼠。 0053 用以下的 3 种标记抗体 ( 抗体全部由 Becton Dickinson PharMingen 公司购入 ) 对各 MLN 进行染色， 进行细胞表面抗原的解析。 0054 1)Cy-chrome(Cy) 标记抗 CD3mAb/FITC 标记抗 TCRmAb/PE 标记抗 CD4mA。

24、b/ biotin 标十己抗 CD8mAb 0055 2)Cy 标 己抗 CD3mAb/FITC 标 己抗 TCR d mAb/PE 标记抗 CD69mAb/biotin 标 记抗 CD8mAb 0056 3)Cy 标记抗 CD3mAb/FITC 标 己抗 TCR Q mAb/PE 标记抗 CD122mAb/biotin 标 记抗 CD8mAb 即， 在调制成 1.0*105个 MLN 的悬浮液中添加 5uL 上述 1) 表示的标记抗体， 于 4保温45分钟后， 用含有5FBS的Hank s缓冲液洗涤2次， 再添加5uL的SA-RED613(商 品名， Invitrogen 公司制 )， 于 。

25、4保温 45 分钟后， 用含有 5 FBS 的 Hank s 缓冲液洗涤 3 次。接着， 通过流动细胞测定仪 (EpicsXL， Beckman Coulter lnc. 制 ) 进行 MLN 的表面抗 原解析， 求得 CD4-CD8+细胞与 CD4-CD8+ 细胞的比例， 比较 CD8 阳性率， 其结果如所示。 0057 表 2 0058 0059 从表 2 可看出， 试验组的 CD8 阳性率比对照组的约高 2 倍左右， 这说明摄入异伞菌 的子实体萃取浸膏和粪肠球菌的加热处理菌体提高了 CD8 阳性率。 0060 此外， 以 CD69( 初期活性标记 ) 及 CDl22(1L-2 受体 链 。

26、) 为指标研究 CD8 阳性 T 细胞活化的有无。即， 使用上述 2) 和 3) 表示的标记抗体， 通过与上述同样的方法进行细 胞的表面抗原解析， 其结果如表 3 所示。 说 明 书 CN 103751223 A 7 6/6 页 8 0061 从表 3 可看出， 试验组的 CD69 及 CDl22 阳性率都比对照组的高， 这说明摄入异伞 菌的子实体萃取浸膏和粪肠球菌的加热处理菌体促进了 CD8 阳性 T 细胞的活化。 0062 表 3 0063 0064 (2) 细胞因子的产量 0065 与上述同样调制对照组及试验组的 MLN， 添加刺激物， 于 37在 5 CO2存在下进 行 48 小时的培。

27、养。 0066 培养结束后回收培养上清液， 用 ELISA 法测定培养上清液中的细胞因子量 (IL-2、 IL-10、 IL-12、 IFN-Y)。用从 Endogen lnc. 公司购入的测定盒测定 IL-2、 IL-12 和 IFN-Y， 用从州 ALYZA TECHNE Co. 公司购入的测定盒测定 IL-10， 其结果如图 3 所示。 0067 从图 3 可看出， 试验组的作为 T 辅助细胞 1(Th-1) 型细胞因子的 IFN-Y 及 IL-12 的产量非常高， 作为 T 辅助细胞 2(Th-2) 型细胞因子的 IL-10 的产量非常低。 0068 用 RT-PCR 法研究细胞因子特。

28、异性 mRNA 的表达量， 结果发现试验组的 Th-1 型细胞 因子 Il-12、 IFN-Y 及 TNF-d 的 mRNA 的表达量增加。Th-2 型细胞因子儿 -10 的 mRNA 的表 达量无差别。 0069 一般， 被单核细胞增生利斯特氏菌等细胞内寄生细菌感染的机体内巨噬细胞和 NK 细胞被活化， 分别产生 IL-12 及 IFN-Y。这些细胞因子又使细菌抗原 0070 特异性的 CD8 阳性 T 细胞活化， 其结果是具有细胞毒性 (CTL) 的 CD8 阳性 T 细胞 完成细菌排除。此外， 由 T 细胞产生的 TNF-Q 具有使中性粒细胞和巨噬细胞等吞噬细胞聚 集在感染部位的作用。 。

29、0071 即， 从上述结果可看出， 通过并用异伞菌的子实体浸膏和粪肠球菌， 更促进了巨噬 细胞和 NK 细胞的活化， 使 IL-12 及 IFN-Y 等的产量增加， 同时还促进了单核细胞增生利斯 特氏菌特异性 CD8 阳性细胞的活化， 细菌排除也较对照组快。 0072 如上所述， 本发明提供了具有良好抑制感染效果的组合物， 该组合物含有异伞菌 的子实体及 / 或菌丝体培养物的萃取物和粪肠球菌的加热处理菌体作为有效成分。此外， 还提供了可预防病原菌等的感染的饮食品， 该饮食品中添加了本发明的抑制感染组合物。 0073 本发明的抑制感染组合物由于来源于食品， 所以安全性较高， 摄入后预期可促进 以细胞免疫为中心的机体防御系统的活化， 具有预防病原菌等的感染的效果。 说 明 书 CN 103751223 A 8 1/2 页 9 图 1图 2 说 明 书 附 图 CN 103751223 A 9 2/2 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 103751223 A 10 。