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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201080009708.3 (22)申请日 2010.03.16 FI2009A000050 2009.03.16 IT A23K 1/16(2006.01) C11C 3/02(2006.01) (73)专利权人 F坎蒂尼 地址 意大利佛罗伦萨 (72)发明人 F坎蒂尼 (74)专利代理机构 北京金之桥知识产权代理有 限公司 11137 代理人 林建军 CN 101119648 A,2008.02.06, 说明书第 1-4 页 . CN 101119648 A,2008.02.06, 说明书第 1-4 页 . CN 101331915。
2、 A,2008.12.31, 说明书第 1 页， 第 3 页 . EP 1612260 A2,2006.01.04, 全文 . CN 1867251 A,2006.11.22, 全文 . GB 2357967 A,2001.07.11, 全文 . SU 701631 A1,1979.12.05, 全文 . P. Ferreira et alEsterification of glycerol with acetic acid over dodecamolybdophosphoric acid encaged in USY zeolite.CATALYSIS COMMUNICATIONS .20。
3、09, 第 10 卷 ( 第 5 期 ), 第 481-484 页 . H.A.Schuette et alSOME PHYSICAL CONSTANTS OF MONACETIN, MONOPROPIN AND MONO-NORMAL-BUTYRIN.Journal of the American Chemical Society .1930,第52卷(第 5 期 ), 第 1978-1981 页 . (54) 发明名称 含 C1-C7有机酸甘油单酯和甘油的组合物及 其制备方法和作为抗细菌剂和抗霉菌剂的用途 (57) 摘要 本发明涉及含有大量 C1-C7有机酸甘油单酯 和甘油的抗细菌和抗霉菌。
4、组合物， 所述组合物的 制备及其在动物饲料中的应用。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2011.08.30 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/IB2010/051126 2010.03.16 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2010/106488 EN 2010.09.23 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 牛力轩 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书16页 附图3页 (10)授权公告号 CN 102340997 B (45)授权公告日 2015.03.25 CN 102340997 B 1/2 。
5、页 2 1. 一种包含 C1-C7脂肪酸甘油单酯的组合物对于对动物饲养所用的谷物、 饲料和通用 食物以及饮用水进行抗细菌和抗霉菌的用途， 其特征在于， 所述组合物的总重量计算， 所述 C1-C7脂肪酸甘油单酯的重量百分比为 41 -50， 所述组合物包含甘油， 以所述组合物的 总重量计算， 所述甘油重量百分比为 28 -50。 2. 如权利要求 1 所述的用途， 其中所述组合物包含 C1-C7脂肪酸甘油单酯和甘油， 以所 述组合物的总重量计算， 所述 C1-C7脂肪酸甘油单酯的重量百分比为 42 -45， 甘油重量 百分比为 48 -50。 3. 如权利要求 1 所述的用途， 其中所述脂肪酸选。
6、自 ： 甲酸、 乙酸、 丙酸、 乳酸、 丁酸、 柠檬 酸、 反丁烯二酸和苯甲酸。 4. 如权利要求 3 所述的用途， 其中所述脂肪酸选自丁酸和丙酸。 5. 如权利要求 1、 3 或 4 任意一项所述的用途， 其组成为 ： (a) 丁酸甘油单酯 4247 丁酸甘油二酯 58 丁酸甘油三酯 0.52 甘油 4550 ； (b) 丙酸甘油单酯 4550 丙酸甘油二酯 812 丙酸甘油三酯 13 甘油 3640 ； (c) 丁酸甘油单酯 45 丁酸甘油二酯 6 丁酸甘油三酯 1 甘油 48 ； (d) 丁酸甘油单酯 43 丁酸甘油二酯 6 丁酸甘油三酯 1 甘油 50 ； (e) 丙酸甘油单酯 49 。
7、丙酸甘油二酯 10 丙酸甘油三酯 2 甘油 39 ； 或 (f) 丙酸甘油单酯 43 丙酸甘油二酯 6 权 利 要 求 书 CN 102340997 B 2 2/2 页 3 丙酸甘油三酯 1 甘油 50。 6.如权利要求5所述的用途， 其中所述组合物还含有重量百分比为1-20的香精油 活性成分。 7. 如权利要求 1 所述的用途， 其中制备所述的组合物的方法为， 其中所述脂肪酸在大 量过量甘油存在的条件下按照已知的方法进行酯化反应， 所述甘油的量按化学当量计算不 少于得到所述甘油单酯的所需量的 200， 重量百分比为 1 -20的香精油活性成分被加 入到由上述过程得到的酯和甘油的混合物中。 8。
8、. 如权利要求 1 所述的用途， 其中所述组合物占所述饲料或饮用水总重量的 0.1-1.5。 9. 如权利要求 8 所述的用途， 其中所述组合物占所述饲料或饮用水总重量的 0.3-0.5。 10.如权利要求8或9任意一项所述的用途， 其中所述饲料是用于饲养猪、 鸡、 鱼、 牛、 羊 和伴侣动物的饲料。 11. 消除或减少动物饲料和饮用水中存在的细菌和霉菌的方法， 其中将权利要求 1-6 任意一项所述的组合物添加到所述饲料或饮用水中。 权 利 要 求 书 CN 102340997 B 3 1/16 页 4 含 C1-C7有机酸甘油单酯和甘油的组合物及其制备方法和 作为抗细菌剂和抗霉菌剂的用途 技。
9、术领域 0001 本发明涉及用于动物饲料的组合物领域。 背景技术 0002 众所周知， 影响饲养场和伴侣动物的最普遍的问题是摄取饲料时由细菌感染和霉 菌产生的霉菌毒素所引起的损伤。对于细菌感染特别是肠道感染而言， 经常会引起严重的 腹泻， 这有时甚至会严重地损害动物的健康， 从而损害农场的整体收入。 0003 对于由霉菌产生的霉菌毒素， 多年来已经知道它们会对特定器官和动物生理功能 的产生毒性效应， 并且能够导致中毒等疾病。还已知致癌霉菌毒素 ( 如由曲霉属菌株产生 的黄曲霉毒素 ) 由于其比较稳定， 且不能通过通常的加热方法清除， 从而能够从母牛和山 羊的乳液转移到人体。 如果在饲料中存在由。
10、曲霉属和青霉属菌种产生的赭曲霉毒素A， 那么 它会在猪和鸟类物种中导致严重的肾病。 0004 由镰刀霉属菌种产生的 T-2 毒素能导致动物消化道坏死。 0005 通常， 试图通过使用下列短链有机酸的一种或其混合物来克服上述缺陷， 所述 短链有机酸例如甲酸 (C1H2O2)、 乙酸 (C2H4O2)、 丙酸 (C3H5O2)、 乳酸 (C3H6O2)、 反丁烯二酸 (C4H4O4)、 丁酸 (C4H8O2)、 柠檬酸 (C6H8O7) 和苯甲酸 (C7H6O2)。 0006 使用所述有机酸的缺点之一是它们的强腐蚀作用， 这能够破坏与它们接触的任何 设备。这些有机酸与铵、 钙、 钠或钾形成的盐的腐。
11、蚀作用虽然有所降低， 但也仍然存在。 0007 当所述有机酸本身或者其盐形式在动物饮食中被用作抗细菌剂时， 对所述有机酸 或者其盐形式的功能也有某些生理学上的限制 ； 在这方面， 所熟知的是有机酸为了完成实 际的抗细菌功能需要酸性环境， 因为在这种条件下它们以未解离的 RCOOH 形式存在。这种 未解离的 RCOOH 形式通过微生物的细胞壁， 并且一旦进入其中， 就会根据细胞内的 pH 进行 解离。为了维持细胞内的 pH， 微生物会排出 H+， 从而解离的有机酸水平增加， 并且由于解离 的有机酸不离开微生物体， 由此而消灭微生物。 0008 然而， 肠中的 pH 是弱碱性的 (7 左右 )， 。
12、所以以未解离形式存在的有机酸非常 有 限， 从而抗细菌的功能也是非常有限的。 0009 综上所述， 因此明显需要开发一种新组合物， 该组合物能够对抗动物饲料中存在 的霉菌和细菌的影响， 但又不存在上述缺陷。 0010 已开发了一种使用脂类物质将有机酸微胶囊化的技术， 该技术作为将有机酸送递 到肠并且降低其中的 pH 的一种方法， 但是由于作为肠 pH 调节器的胰腺释放的碳酸氢钠的 缓冲作用， 这种方法的效果难以令人满意。而且， 除了难以获得满意的效果外， 这种技术还 非常昂贵。 0011 某些脂肪酸甘油单酯的抗细菌功能在许多研究中已经被研究， 所述研究例如 ： 0012 1.J.Kabara，。
13、 Dennis M.Swieczkowski， Anthony J， Conley， Joseph P.Truant 1972FATTY ACIDS AND DERIVATES AS ANTIMICROBIAL AGENTS. 说 明 书 CN 102340997 B 4 2/16 页 5 0013 2.G.Bergsson， J.Arnfinnsson S.Karlsson， O.Steingrimsson， H.Thormar 1998.IN VITRO INACTIVATION OF CHLAMYDIA TRACHOMATIS BY FATTY ACIDSAND MONOGLYCERID。
14、ES. 0014 3.G.Bergsson， J.Arnfinnsson， O.Steingrimsson， H.Thormar 2001.IN VITRO KILLING OF CANDIDA ALBICANS BY FATTY ACIDS AND MONOGLYCERIDES. 0015 4.H.Thormar， H.Hilmarsson， G.Bergsson 2005.STABLE CONCENTRATED EMULSIONS OF THE 1-MONOGLYCERIDE OF CAPRIC ACID (MONOCAPRIN)WITH MICROBICIDAL ACTIVITIES A。
15、GAINST THE FOOD-BORNE BACTERIA CAMPYLOBACTER JEJUNI， SALMONELLA SPP AND ESHERICHIA COLI ； 0016 PCT/IS2005/000026“STABLE CONCENTRATED ANTI-BACTERIAL EMUL SIONS OF MONOCAPRIN IN WATER” . 0017 5.Hilmarsson， H.Thormar， J.H.Thrainsson， E.Gunnarsson 2006EFFECT OF GLYCEROL MONOCAPRATE(MONOCAPRIN)ON BROILER。
16、 CHICKENS ： ANATTEMPT AT REDUCING INTESTINAL CAMPYLOBACTER INFECTION. 0018 这些研究已经展示了一个有前景但还不全面的研究方向， 就目前的现有技术而 言， 还没有研究证实短链脂肪酸甘油单酯与甘油组合的组合物具体的抗细菌以及抗霉菌作 用。 附图说明 0019 图 1 是通过电子显微镜显示的本发明组合物的水性悬浮液 ； 0020 图 2 展示的是用镰刀霉接种过的未经处理的饲料 ； 0021 图 3 展示的是用镰刀霉接种过并用 0.7的 Monopropionin 43 处理过的饲料。 发明内容 0022 本发明涉及含 C1-C。
17、7脂肪酸甘油单酯和甘油的组合物， 以组合物的总重量计， C1-C7 脂肪酸甘油单酯的重量百分比为10-90， 甘油的重量百分比为10-90， 所述组合物 作为抗细菌剂和抗霉菌剂添加到用于动物饲养的谷物、 饲料以及通用食物和饮用水中。 具体实施方式 ： 0023 出人意料地发现含 C1-C7有机酸甘油单酯与甘油的组合物在酸性 pH(4.5) 和中性 pH 条件下， 比如说动物肠道的 pH( 即 pH 7) 条件下， 都有很强的抗细菌能力。 0024 在本发明的组合物中， 以所述组合物的总重量计， 所述有机酸甘油单酯的重量 百分比为 10 -90、 优选地为 40 -90， 甘油重量百分比为 10。
18、 -90、 优选地为 10 -60。 0025 本发明中的术语 “C1-C7的有机酸” 优选指下列酸 ： 甲酸、 乙酸、 丙酸、 乳酸、 丁酸、 柠 檬酸、 反丁烯二酸和苯甲酸。 0026 特别优选的有机酸为丁酸和丙酸。 0027 根据本发明的组合物的实例是含有以下组分的组合物 ： 0028 (a) 说 明 书 CN 102340997 B 5 3/16 页 6 0029 0030 (b) 0031 0032 根据本发明的组合物的具体实例是含有以下组分的组合物 ： 0033 (c) 0034 0035 (d) 0036 0037 (e) 0038 0039 (f) 0040 说 明 书 CN 。
19、102340997 B 6 4/16 页 7 0041 单独有机酸的抗细菌能力分值同本发明组合物的抗细菌能力分值比较的结果如 下表 1 所示。 0042 表 1 0043 0044 0045 注释 ： Monopropionin 43 的组成为 ： 0046 43丙酸甘油单酯 0047 6丙酸甘油二酯 0048 1丙酸甘油三酯 0049 50甘油 0050 注释 ： Monobutyrin 43 的组成为 ： 0051 43丁酸甘油单酯 0052 6丁酸甘油二酯 0053 1丁酸甘油三酯 0054 50甘油 0055 表 2 是比较纯丁酸、 不含游离甘油的丁酸甘油单酯和丁酸甘油单酯与游离甘油的。
20、 混合物在生物体外对产气荚膜梭菌 (Clostridium pefringens) 的抗细菌能力。丁酸甘油 单酯和甘油的混合物在浓度为 1000ppm 的三次重复实验中都已经表现出抑制功能 ( 即无 生长 )， 丁酸甘油单酯没有表现出任何抑制细菌功能， 丁酸从浓度 3000ppm 才表现出抑制作 用。 0056 表 2 0057 细菌 ： 产气荚膜梭菌 CP27 说 明 书 CN 102340997 B 7 5/16 页 8 0058 接种浓度 ： 105 0059 培养基 ： 脑心浸液 0060 孵育时间和生长表现 ： + 表示 24 小时， + 表示 37 小时， + 表示 96 小时 -。
21、 每个浓 度重复三次 0061 0062 说 明 书 CN 102340997 B 8 6/16 页 9 0063 表 3 是比较纯乙酸、 不含游离甘油的乙酸甘油单酯和乙酸甘油单酯与游离甘油的 混合物在生物体外对猪鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 的抗细菌能力。乙酸 甘油单酯和甘油的混合物 (Monoacetin 42) 在浓度为 10,000ppm 的三次重 复实验中都已 经表现出抑制功能 ( 即无生长 )， 乙酸甘油单酯从浓度 25,000ppm 表现出抑制细菌功能， 乙 酸从浓度 20,000ppm 才表现出抑制作用。 说 明 书 CN 102340997。
22、 B 9 7/16 页 10 0064 表 3 0065 细菌 ： 猪鼠伤寒沙门氏菌 (Sllmonella typhimurium) 0066 接种浓度 ： 105 0067 培养基 ： 脑心浸液 0068 孵育时间和生长表现 ： + 表示 24 小时， + 表示 37 小时， + 表示 96 小时 - 每个浓 度重复三次 0069 pH 6 0070 0071 说 明 书 CN 102340997 B 10 8/16 页 11 0072 注释 ： Monoacetin 42 的组成为 ： 0073 42乙酸甘油单酯 0074 7乙酸甘油二酯 0075 1乙酸甘油三酯 0076 50甘油 0。
23、077 表 4 是比较纯甲酸、 不含游离甘油的甲酸甘油单酯和甲酸甘油单酯与游离甘油的 混合物在生物体外对鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 的抗细菌能力。甲酸甘 油单酯和甘油的混合物 (Monoformin 42) 在浓度为 5,000ppm 的三次重复实验中都已经表 现出抑制功能 ( 即无生长 )， 甲酸甘油单酯从浓度 25,000ppm 表现出抑制细菌功能， 甲酸从 浓度 15,000ppm 才表现出抑制作用。 0078 表 4 0079 细菌 ： 猪鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 0080 接种浓度 ： 105 0081 培。
24、养基 ： 脑心浸液 0082 孵育时间和生长表现 ： + 表示 24 小时， + 表示 37 小时， + 表示 96 小时 - 每个浓 度重复三次 0083 pH 6 0084 0085 说 明 书 CN 102340997 B 11 9/16 页 12 0086 注释 ： Monoformin 42 的组成为 ： 0087 42甲酸甘油单酯 0088 7甲酸甘油二酯 0089 1甲酸甘油三酯 说 明 书 CN 102340997 B 12 10/16 页 13 0090 50甘油 0091 表 5 是比较纯反丁烯二酸、 不含游离甘油的反丁烯二酸甘油单酯和反丁烯二酸甘 油单酯与游离甘油的混合物。
25、(Monofumarin 41)在生物体外对大肠杆菌(E.coli)的抗细菌 能力。反丁烯二酸甘油单酯和甘油的混合物在浓度为 20,000ppm 的三次重复实验中都已经 表现出抑制功能 ( 即无生长 )， 反丁烯二酸甘油单酯从浓度 60,000ppm 表现出抑制细菌功 能， 反丁烯二酸从浓度 90,000ppm 表现出抑制作用。 0092 表 5 0093 细菌 ： 大肠杆菌 (E.coli) 0094 接种浓度 ： 105 0095 培养基 ： 脑心浸液 0096 孵育时间和生长表现 ： + 表示 24 小时， + 表示 37 小时， + 表示 96 小时 - 每个浓 度重复三次 0097 。
26、pH 5 0098 0099 说 明 书 CN 102340997 B 13 11/16 页 14 0100 注释 ： Monofumarin 41 的组成为 ： 0101 41反丁烯二酸甘油单酯 0102 8反丁烯二酸甘油二酯 0103 1反丁烯二酸甘油三酯 0104 50甘油 0105 优选地， 本发明的组合物还可以含有百分比为1-20(以其他组分的混合物重 量计算 ) 的香精油 ( 肉桂醛、 麝香草酚、 香芹酚 ) 活性成分， 这些成分通常会添加到用于饲 养动物的此类产品中， 因为这些活性成分能够溶解于脂质中却不能溶解于甘油中。 0106 应该注意的是当本发明的的组合物分散在水中时， 甘。
27、油包围着甘油单酯本身形成 液滴， 所述液滴中包含所述甘油单酯， 他们在水中保持悬浮 ( 其他任选加入的活性成分溶 解于在所述甘油单酯中， 它们也被包含在所述甘油液滴中 )( 见图 1)。 0107 本发明的组合物能够通过文献中详细描述的常规的脂肪酸酯化过程制备， 但是为 了得到含有大量游离甘油的大量甘油单酯， 需要使用过量的大量甘油 ( 以使用的脂肪酸的 重量比计算不少于 200 )。 0108 以饲料量或饮水量计， 本发明的组合物能够以 0.1-1.5、 优选 0.3-0.6的量加 入到动物饲料和 / 或它们的饮用水中。 0109 本发明的组合物特别适用于指猪、 鸡、 鱼、 牛、 羊和伴侣动。
28、物的日常食物。 0110 实施例一 0111 在 10,000kg 的批次中发生的酯化反应。 说 明 书 CN 102340997 B 14 12/16 页 15 0112 室温下， 将 3000kg 的丁酸和 7000kg 的甘油加入反应器中。 0113 将温度升高到 140， 蒸发的丁酸通过回流冷凝管在反应器内循环。 0114 将温度从 140进一步升高到 170， 为了蒸发掉酯化反应生成的水， 同时使丁酸 继续在反应器中循环， 此升温过程必须非常慢 (4 小时以上 )， 并且回流冷凝管的温度必须 保持在 120。 0115 此时可将温度升高到 180 ( 但是冷凝管的温度仍然是 120 。
29、)， 并且在升高到此 温度后， 预期混合物的酸值将达到一个小于 1的值。 0116 在真空条件下蒸馏掉未反应的丁酸直到最终的酸值小于 0.2。 0117 将混合物通过冷却器排出， 以使其温度降至室温。 0118 所得到的混合物含有 43的甘油单酯、 6的甘油二酯、 1的甘油三酯和 50的 甘油。 0119 在酯化反应进行完全后， 如果需要， 就通过蒸馏从所得到的甘油单酯、 甘油二酯和 甘油三酯中分离甘油， 以达到 90的甘油单酯浓度。 0120 实施例 2 0121 将 60 头 5 周大的 DanBred 小猪分成两组， 每组 30 头小猪 ： 其中 A) 组为对照 组， B) 组为处理组，。
30、 再将其分到六个圈中， 每个圈中 10 只动物。在圈中适应 10 天以后， 所有动物通过口服方式接种鼠伤寒沙门氏菌， 所述鼠伤寒沙门氏菌分离自弗利 (Forl) Zooprofi lattico研究所(Istituto Zooprofi lattico of Forl)(Italy)的被感染猪的粪便 样品， 接种剂量等于 7107cfu。 0122 接下来的时间里每个圈中的一些受试者都出现了腹泻。 在接下来三天的继续感染 后， 这种症状恶化并且感染了所有的受试者。 0123 在感染后的第三天收集粪便样品， 在对照组 A) 中发现细菌计数等于 165,000cfu， 在处理组 B) 中发现细菌计。
31、数等于 160,000cfu。B) 组从感染后的第三天用具有如下组成的 混合物进行处理， 所述混合物组成为 ： 0124 - 丁酸甘油单酯 45 0125 - 丁酸甘油二酯 6 0126 - 丁酸甘油三酯 1 0127 - 甘油 48 0128 连续三天在饮用水中加入 0.5重量比的上述组合物， 处理后的第三天， 再次收集 粪便样品以进行细菌计数分析。对照组 A) 表现的平均 cfu 值为 160,000， 而处理组 B) 的 cfu 为 900。上述比例的 “丁酸酯和甘油” 混合物在施用三天后就能够将沙门氏菌的 cfu 减 少 3 个数量级。这一事实证明了所述混合物的杀细菌效果。 0129 。
32、实施例 3 0130 本田间试验是在意大利的农场实施的， 该农场有严重的卫生问题， 例如由胞内劳 森氏菌 (Lawsonia Intracellularis) 感染所引起的非常明显的回肠炎， 短螺旋体属种 (Brachyspira Spp)引起的小肠炎以及由舌骨痢疾密螺旋体(Treponema hyodysenteriae) 感染引起的坏死性肠炎。将 1,027 头重约 25kg(71 天大 ) 的 DanBred 猪分成两组 ： 对照组 A) 和处理组 B)， 分别由 511 只和 516 只动物组成。 0131 两组动物的饲料除了以下组分之外其他制作方法均相同， 在试验的前 14 天， 对。
33、照 说 明 书 CN 102340997 B 15 13/16 页 16 组的饲料中添加了林可霉素 200ppm 和强力霉素 250ppm， 14 天以后只加入林肯霉素。在处 理组 B) 的饲料中未添加抗生素， 仅仅添加了一种具有如下组成的 “丁酸酯和甘油” 混合物 ： 0132 - 丁酸甘油单酯 45 0133 - 丁酸甘油二酯 6 0134 - 丁酸甘油三酯 1 0135 - 甘油 48 0136 上述组合物以 0.5的量添加到饲料中， 代替 0.5的大豆油。 0137 试验持续了 63 天。生长和饲养效果总结在下表中。 0138 表 0139 A) 组 - 对照组 B) 组 - 丁酸酯和。
34、甘油 动物数量 511 516 试验开始时的年龄 ( 天 ) 71 71 试验结束时的年龄 ( 天 ) 134 134 试验开始时的平均重量 (kg) 25 25 实验结束时的平均重量 (kg) 62.13 63.61 死亡动物的数量 5 2 -3 被排除的动物的数量 3 2 -1 平均每天体重增长量 (kg) 0.59 0.61 +0.02 消耗的总饲料量 (kg) 53.570 53.250 -320 产肉量 (kg) 19.340 20.200 +860 饲料转化指数 2.76 2.64 -0.12 0140 虽然对照组A)的粪便分析显示存在劳森氏菌， 但在处理组B)中没有发现其存在。 。
35、在处理组 B) 中腹泻的发作也减少了很多。处理组 B) 的生长参数、 饲料转化指数与日常饮 食中含有所述抗生素的对照组 A) 的所述参数相近， 并稍微优于对照组 A)。所述 “丁酸酯和 甘油” 混合物在不使用抗生素情况下能使严重的疾病得到控制， 试验证实了所述 “丁酸酯和 甘油” 混合物的抗细菌效果以及随后对于肠道健康的改善。 0141 实施例 4 0142 对于鸡的鼠伤寒沙门氏菌效果测试 0143 沙门氏菌菌株 0144 该试验用的是由弗利 IZSLER 部门分离和识别的一种鼠伤寒沙门氏菌菌株。 0145 动物 0146 使用 SPC( 无特异病原的 ) 鸡， 每次试验 30 只。这些鸡 (。
36、 受试者 ) 在弗利 IZSLER 部门被孵化后， 立即被放进隔离单元。 0147 日常饮食 0148 所述动物随意饮用自来水和市售的雏鸡饲料。所述饲料中添加 Monobutyrin43。 0149 实验方案 0150 先准备好受试者， 每组 30 只， 共 4 组。从其生命第一天开始在饲料中添加不同量 的 Monobutyrin 43， 各组的饲料中含有 Monobutyrin 43 的量如下所述 ： 未处理的对照组 ： 0 ； 第一组 ： 饲料中含 1 ； 第二组 ： 饲料中含 0.3 ； 第三组 ： 前第 14 天与对照组的饲料 相同， 即， 直到感染后第 7 天， 并且从那天后仅喂食仅。
37、添加有 1.4的 Monobutyrin 43 的饲 料。 说 明 书 CN 102340997 B 16 14/16 页 17 0151 在 7 天大时， 所有的受试者通过食道途径感染鼠伤寒沙门氏菌 107cfu。感染后 24 小时， 所有的受试者都要进行泄殖腔拭子化验， 以确保感染了鼠伤寒沙门氏菌。 在其生命的 第 14 天、 24 天、 35 天， 每组杀死 10 只受试者。收集每只动物的盲肠， 测定鼠伤寒沙门氏菌 载量 ( 以 cfu/g 表示 )。 0152 实验室试验 0153 用酶联免疫吸附测试 (ELISA) 证实鼠伤寒沙门氏菌抗体的存在。将泄殖腔拭子直 接接种到肠道病菌培养用。
38、琼脂(Hetoken Enteric Agar)上， 在37下孵育24小时。 将一克 肠内容物溶于 9ml 的乳酸林格氏液中， 并且接种到肠道病菌培养用琼脂 (Hetoken Enteric Agar) 上 ( 接种体积 ： 0.1ml)。在 37孵育 24 小时后进行菌落计数。对每次收集， 计算 10 只被杀死的受试者细菌载量的几何平均值。 0154 发现所有的受试者在生存一天后对鼠伤寒沙门氏菌的血清反应呈阴性。感染 24 小时后， 发现所有的泄殖腔拭子均为鼠伤寒沙门氏菌阳性。测定的盲肠细菌载量的结果如 下表所示。 0155 表 0156 用 107的鼠伤寒沙门氏菌感染的鸡盲肠中的 CFU 。
39、0157 0158 实施例 5 0159 对丝状真菌 ( 霉菌 ) 的体外敏感性试验 0160 材料和方法 0161 本试验使用了曲霉菌属种(Aspergillus spp)、 青霉属种(Penicillium spp)和镰 刀酶属种(Fusarium spp)的菌株， 所述菌株是在弗利的IZSLER部门的诊断活动中从 养鸡 工业使用的完全饲料中被分离和识别的。为了准备接种物， 用拭子收集试验所用菌株的纯 培养物菌丝体。用这种方式收集的材料被溶解于肉汤培养基 (BHI- 脑心浸液 ) 中。5ml 的 真菌悬液和等量的待测产品一起放在一支试管中， 将所述试管在 204孵育 24 小时。 0162。
40、 24 小时后， 此真菌悬浮液被接种和计数。将 5ml 真菌悬浮液和 5ml 稀释剂 ( 乳酸 林格氏液 ) 放入一支试管作为对照悬浮液。在 204孵育五天后进行试验的计数。 0163 结果如下表所示， 用 cfu/ml 表示 说 明 书 CN 102340997 B 17 15/16 页 18 0164 表 0165 产品 曲霉菌属种 青霉属种 镰刀霉属种 对照 450000 97000 310000 Monopropionin 43 20000 1500 90000 Monobutyrin 43 1000 700 3000 丙酸 300 100 300 丙酸铵 1000 100 500 0。
41、166 注释 ： Monopropionin 43 的组成为 ： 0167 43的丙酸甘油单酯 0168 12的丙酸甘油二酯 0169 1的丙酸甘油三酯 0170 28的游离甘油 0171 16的水 0172 注释 ： Monobutyrin 43 的组成为 ： 0173 43丁酸甘油单酯 0174 6丁酸甘油二酸酯 0175 1丁酸甘油三酸酯 0176 50甘油 0177 实施例 6 0178 对青霉属种和镰刀霉属种的体外效力测试 0179 材料和方法 0180 菌株 ： 用作试验的是由弗利IZSLER部门分离和识别的霉菌菌株。 所述菌株 在BHI 肉汤培养基中活化， 然后 ( 在 20孵育。
42、 5 天后 ) 在 OGYE 琼脂上计数。 0181 培养基 ： 使用一份在烘箱里 100灭菌 4 小时完全鸡饲料。 0182 效力测试 ： 将 2ml 的真菌悬浮液 ( 悬于蒸馏水中 ) 接种到 10g 饲料， 然后将 70l 的待测产品加入到其中。将这样得到的混合物在室温下保存。同时准备阳性对照 ( 感染但 未经处理 ) 和阴性对照 ( 仅饲料 + 蒸馏水 )。 0183 在感染后的第 7 天和第 14 天， 对经处理样品和对照样品中的真菌浓度进行测定。 0184 结果如下表所示。 0185 表 0186 说 明 书 CN 102340997 B 18 16/16 页 19 0187 注释 ： Monopropionin 43 的组成为 ： 0188 43丙酸甘油单酯 0189 12丙酸甘油二酯 0190 1丙酸甘油三酯 0191 28游离甘油 0192 16水 说 明 书 CN 102340997 B 19 1/3 页 20 图 1 说 明 书 附 图 CN 102340997 B 20 2/3 页 21 图 2 说 明 书 附 图 CN 102340997 B 21 3/3 页 22 图 3 说 明 书 附 图 CN 102340997 B 22 。