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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810791313.1 (22)申请日 2018.07.18 (71)申请人 广东省农业科学院水稻研究所 地址 510000 广东省广州市天河区金颖东 一街3号 申请人 湖南农业大学 (72)发明人 顾海永 叶能辉 李浩轩 李传国 张建华 梁世胡 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569 代理人 刘奇 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) (54)发明名称 一种水稻种质资源的创制方法及在水稻制 种中的应用 (57)摘要 本发明提供了一种水。
2、稻种质资源的创制方 法， 属于种质资源的创制领域。 本发明的方法采 用籼粳来源的多种亲本进行复合杂交后再经过 世代筛选， 在自交后代中发现一个柱头不育材 料， 进一步将不育株的禾头移栽到冷灌基地种植 后发现该不育株重新抽出的穗子有部分恢复了 育性， 且收获的种子进行种植后同样在大田中表 现不育而在冷灌基地则为部分可育。 本发明中的 雌性不育新种质受生长温度的影响会发生育性 的变化， 在正常高温生长条件下， 表现出完全不 育的性状； 而在相对低温生长条件下则可部分恢 复育性， 其恢复效率在3070之间。 利用本发 明的创制方法获得一种温敏型雌性不育的水稻 新种质， 可用于水稻机械制种。 权利要求。
3、书1页 说明书6页 附图3页 CN 108967181 A 2018.12.11 CN 108967181 A 1.一种水稻种质资源的创制方法， 包括以下步骤： 1)将籼稻广超丝苗和镇恢084进行第一单杂交， 得第一亲本； 2)将粳稻02428DM和籼稻丰丝占进行第二单杂交， 得第二亲本； 3)将步骤1)得到的所述第一亲本与步骤2)得到的所述第二亲本杂交， 得F1代； 4)将步骤3)得到的所述F1代第一自交后， 得F2代筛选群体； 5)在步骤4)得到的F2代筛选群体中筛选可育单株， 以所述可育单株为亲本进行第二自 交， 得F3代筛选群体； 6)以上一次自交获得的筛选群体为筛选对象， 筛选可育单。
4、株， 以该可育单株为亲本进 行自交， 得到下一代筛选群体， 重复所述筛选可育单株、 以所述可育单株为亲本进行自交过 程67次后， 得温敏雌性不育系， 命名为水稻种质tfs1； 步骤1)与步骤2)之间并不存在时间上的限制关系。 2.根据权利要求1所述的创制方法， 其特征在于， 步骤1)所述第一单杂交， 以籼稻广超 丝苗为母本， 镇恢084为父本。 3.根据权利要求1所述的创制方法， 其特征在于， 步骤2)所述第二单杂交， 以粳稻 02428DM为母本， 籼稻丰丝占作为父本。 4.根据权利要求1所述的创制方法， 其特征在于， 步骤3)所述杂交， 以第一亲本为母本， 第二亲本为父本。 5.根据权利要。
5、求1所述的创制方法， 其特征在于， 步骤6)得到雌性不育系后， 还包括种 植， 在3035生长条件下， 所述雌性不育系表现出完全不育的性状； 而在2527生长条 件下则部分恢复育性， 其恢复效率在3070之间。 6.权利要求15任一项所述的创制方法在水稻机械制种中的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108967181 A 2 一种水稻种质资源的创制方法及在水稻制种中的应用 技术领域 0001 本发明属于种质资源创制领域， 具体涉及一种水稻种质资源的创制方法及在水稻 制种的应用。 背景技术 0002 植物雌性不育性状广泛存在于各种作物品种中， 在现有发现的雌性不育材料中， 我们可。
6、根据其不育遗传模式分为以下几种。 首先是核基因控制的雌性不育， 分为显性核基 因控制的雌性不育和隐性核基因控制的雌性不育， 这两种材料作为母本与其他可育材料杂 交都不能获得F1代杂交种子。 其中显性核基因控制的雌性不育材料作为父本的F1代种子全 部表现为不育， 因此显性核基因控制的雌性不育材料不能用于杂交制种。 而由隐性核基因 控制的雌性不育材料作为父本的F1代种子可育， 但是由于该雌性不育材料不能通过正常进 行繁种， 只能通过无性繁殖的方式来进行， 成本太高， 因此也不能应用到杂交制种上。 其次 是细胞质基因控制的雌性不育， 该种质无论是作为母本或是作为父本与可育材料杂交都不 能获得可育后代。
7、， 因此无法开展后续的研究和应用。 此外， 黄祯等于2010年发现了一株具有 10左右育性的雌性不育水稻材料FSV1， 该材料所产生的少量种子均为纯合雌性不育种 子， 可用于后续的机理研究， 但是由于该材料能够自交产生少量种子， 也不适合作为恢复系 用于杂交水稻制种。 0003 现有杂交水稻体系中最为核心的种质材料为雄性不育系材料， 可分为普通的雄性 不育系和温敏雄性不育系， 后者为两系杂交的实现提供了必要条件。 水稻温敏雄性不育材 料的来源主要是通过杂交转育然后系统选择来获得， 此外还可以通过花药培养和辐射诱变 的方法来创造新的雄性不育材料。 与水稻雄性不育系不同的是， 虽然水稻雌性不育材料。
8、时 有发现， 但是利用人工行为所创造出来的雌性不育系尤其是温敏水稻雌性不育材料迄今为 止仍没有成功的实例。 尽管普通水稻雌性不育在生产实践上难以应用， 水稻温敏雌性不育 材料确可应用于杂交水稻制种， 实现全程机械化制种， 从而大大降低了杂交水稻的制种成 本。 因此， 育种家们不遗余力地尝试各种方法试图获得温敏特性的水稻雌性不育材料， 包括 杂交后代的筛选、 花药培养以及化学物理诱变方法等技术， 但是结果都以失败告终， 没有获 得一株温敏雌性不育水稻材料。 发明内容 0004 有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种水稻种质资源的创制方法， 尤其是获得一 种温敏特性的水稻雌性不育材料。 0005 为。
9、了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案： 0006 本发明提供了一种水稻种质资源的创制方法， 包括以下步骤： 0007 1)将籼稻广超丝苗和镇恢084进行第一单杂交， 得第一亲本； 0008 2)将粳稻02428DM和籼稻丰丝占进行第二单杂交， 得第二亲本； 0009 3)将步骤1)得到的所述第一亲本与步骤2)得到的所述第二亲本杂交， 得F1代； 说 明 书 1/6 页 3 CN 108967181 A 3 0010 4)将步骤3)得到的所述F1代第一自交后， 得F2代筛选群体； 0011 5)在步骤4)得到的F2代筛选群体中筛选可育单株， 以所述可育单株为亲本进行第 二自交， 得F3代。
10、筛选群体； 0012 6)以上一次自交获得的筛选群体为筛选对象， 筛选可育单株， 以该可育单株为亲 本进行自交， 得到下一代筛选群体， 重复所述筛选可育单株、 以所述可育单株为亲本进行自 交过程67次后， 得雌性不育系， 命名为水稻种质tfs1； 0013 步骤1)与步骤2)之间并不存在时间上的限制关系。 0014 优选的， 步骤1)所述第一单杂交， 以籼稻广超丝苗为母本， 镇恢084为父本。 0015 优选的， 步骤2)所述第二单杂交， 以粳稻02428DM为母本， 籼稻丰丝占作为父本。 0016 优选的， 步骤3)所述杂交， 以第一亲本为母本， 第二亲本为父本。 0017 优选的， 步骤6。
11、)得到雌性不育系后， 还包括种植， 在3035生长条件下， 所述雌 性不育系表现出完全不育的性状； 而在2527生长条件下则部分恢复育性， 其恢复效率 在3070之间。 0018 本发明提供了一种上述创制方法在水稻机械制种中的应用。 0019 本发明提供了一种水稻种质资源的创制方法， 采用多亲本复合杂交法构建具有丰 富遗传基础的筛选群体， 借此提高温敏雌性不育株出现的概率， 尤其是所用4个亲本的表型 差异较大， 可确保杂交亲本的遗传多样性且有利于不育株的出现概率。 且利用本发明创制 方法获得的tfs1材料作为母本完全不能产生F1杂交种子， 而作为父本则可产生可育的F1代 种子， 这些可育的F1。
12、代杂交种子自交后分离比例完全按照3:1的规律进行， 且tfs1材料颖壳 不闭合的表型与雌性不育表型完全连锁。 回交试验表明， 利用可育材料作为回交亲本， 则回 交1代(B1)全部为颖壳闭合可育株， 而以tfs1材料作为回交亲本则颖壳闭合可育株和颖壳 开裂不育株的比例为1:1， 说明这一对紧密连锁的性状受一个隐性核基因所控制。 在3035 生长条件下， 所述雌性不育系表现出完全不育的性状； 而在2527生长条件下则部分 恢复育性， 其恢复效率在3070之间。 附图说明 0020 图1温敏型雌性不育材料筛选群体的构建路线； 0021 图2为tfs1在正常高温和相对低温生长温度下的育性恢复结果图； 。
13、0022 图3为tfs1不育材料颖花在不同发育时期的表型图； 0023 图4为tfs1材料的雌蕊表型图； 0024 图5为tfs1的雄蕊表型观察及花粉活力测定结果图。 具体实施方式 0025 本发明提供了一种水稻种质资源的创制方法， 包括以下步骤： 0026 1)将籼稻广超丝苗和镇恢084进行第一单杂交， 得第一亲本； 0027 2)将粳稻02428DM和籼稻丰丝占进行第二单杂交， 得第二亲本； 0028 3)将步骤1)得到的所述第一亲本与步骤2)得到的所述第二亲本杂交， 得F1代； 0029 4)将步骤3)得到的所述F1代第一自交后， 得F2代筛选群体； 0030 5)在步骤4)得到的F2代。
14、筛选群体中筛选可育单株， 以所述可育单株为亲本进行第 说 明 书 2/6 页 4 CN 108967181 A 4 二自交， 得F3代筛选群体； 0031 6)以上一次自交获得的筛选群体为筛选对象， 筛选可育单株， 以该可育单株为亲 本进行自交， 得到下一代筛选群体， 重复所述筛选可育单株、 以所述可育单株为亲本进行自 交过程67次后， 得雌性不育系， 命名为水稻种质tfs1； 0032 步骤1)与步骤2)之间并不存在时间上的限制关系。 0033 在本发明的创制方法中， 将籼稻广超丝苗和镇恢084进行第一单杂交， 得第一亲 本。 在本发明中， 优选的以所述广超丝苗为母本， 镇恢084为父本。 。
15、本发明所述广超丝苗和镇 恢084均为籼型水稻， 且表型差异较大。 0034 本发明将粳稻02428DM和籼稻丰丝占进行第二单杂交， 得第二亲本。 在本发明中， 优选的以02428DM作为母本， 丰丝占作为父本。 本发明所述第二单杂交的亲本分别属于不同 类型的水稻， 可确保杂交亲本的遗传多样性， 并有利于提高不育株的出现概率。 0035 本发明将上述第一亲本与第二亲本杂交， 得F1代。 本发明所述杂交， 优选的以第一 亲本为母本， 第二亲本为父本。 0036 本发明将得到的所述F1代第一自交， 得F2代筛选群体。 本发明所述F2代筛选群体 的构建路线如图1所示。 本发明所述自交可以将不同亲本来源。
16、的DNA进行重组， 自交后代会 继续产生分离， 扩大分离群体， 增大不育材料出现概率。 0037 本发明在得到的F2代筛选群体中筛选可育单株， 以所述可育单株为亲本进行第二 自交， 得F3代筛选群体。 本发明所述可育单株的筛选性状优选的还包括株型和穗型。 本发明 对利用株型和穗型筛选可育单株的方法并没有特殊限定， 利用本领域的常规方法即可。 具 体包括穗长， 每穗总粒数， 粒型和株高， 分蘖数等性状综合考虑， 最后根据成穗率和结实率 的差异挑选具有代表性的少量单株作为可育单株进行下一步的筛选， 挑选方案如实施例2 所示。 0038 本发明以上一次自交获得的筛选群体为筛选对象， 筛选可育单株， 。
17、以该可育单株 为亲本进行自交， 得到下一代筛选群体， 重复所述筛选可育单株、 以所述可育单株为亲本进 行自交过程67次后， 得雌性不育系， 命名为水稻种质tfs1。 本发明在得到雌性不育系后， 优选的还包括种植过程。 本发明所述种植优选的在冷灌基地进行种植， 本发明对所述种植 方法并没有特殊限定， 利用本领域的常规种植方法即可。 结果显示在3035生长条件下， 所述雌性不育系表现出完全不育的性状； 而在2527生长条件下则部分恢复育性， 其恢 复效率在3070之间。 0039 本发明还提供了一种利用上述创制方法在水稻机械制种中的应用。 将本发明中的 温敏雌性不育特性利用多代回交或是转基因的方法。
18、引入到杂交水稻的恢复系中去， 由于父 本和母本都为不育材料不会自交产生种子， 只有杂交成功的才能产生杂交种子， 因此可以 把父本和母本混播， 实现机械化制种。 0040 下面结合实施例对本发明提供的水稻种质资源的创制方法进行详细的说明， 但是 不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 0041 实施例1 0042 不育系筛选群体的构建： 按照如图1所示路线构建不育系筛选群体， 首先将籼稻广 超丝苗(母本)和镇恢084(父本)进行单杂交获得第一亲本， 同时将02428DM(母本)和丰丝占 (父本)进行单杂交获得第二亲本， 最后将第一亲本(母本)与第二亲本(父本)进行杂交， 随 说 明 书 3/6。
19、 页 5 CN 108967181 A 5 后再进行自交1次后获得F2代筛选群体， 共1000单株。 0043 实施例2 0044 种质资源tfs1的筛选： 在该群体的1000个单株中根据株型和穗型挑选了20个可育 的优良目标单株， 随后将这20个单株进行自交， 在F3代群体中同样根据株型和穗型在其中3 个优良株系中分别挑选3个目标单株， 将F4代种植后在9个株系中继续在3个株系中挑选3个 可育的优良目标单株， 重复进行该筛选过程， 在田间发现自交后代F9代的一个田间编号为 9099的株系中7株呈现柱头败育性状(雌性不育)， 并且该株系后代中可育株与不育株比例 为3:1。 说明该编号为9099。
20、的F9代株系后代种子中分离出不育株。 随后我们将这些不育株作 为父本和母本分别与籼稻野生型进行正方杂交， 其中不育株作为母本的杂交没有收获F1种 子， 而不育株作为父本则可获得可育的F1种子， 其分离后代的分离规律也符合3:1分离比 例， 初步确定该雌性不育性状为单隐性核基因控制。 0045 将该不育株的禾头挖出并移到冷灌基地进行种植， 成功再生获得雌性不育株的种 子， 初步说明该雌性不育性状为条件性不育。 另外， 将获得种子在可控温的阳光温室生长， 并尽量严格控制生长温度， 发现该雌性不育材料在2527之间的育性恢复最高， 不同株 的恢复率在3070之间， 高于或低于这一温度范围则表现出不育。
21、。 恢复表型如图2所 示， A表示在正常高温下生长的野生型材料， D表示正常高温下生长的tfs1材料， B和C则表示 tfs1材料在相对低温下生长的不同单株育性恢复情况。 推测该雌性不育株系为温度敏感型 雌性不育材料， 命名为tfs1。 0046 试验 0047 1、 tfs1的表型的细胞生物学观察： 0048 在获得该突变体材料之后， 首先对其花器官进行表型分析如图3所示， 其中A-1至 F-1为tfs1材料颖花在抽穗到扬花期间的表型图； A-2至F-2位野生型材料颖花在抽穗到扬 花期间的表型图， 可知tfs1突变材料的颖花和野生型材料一样具有6个雄蕊和2个雌蕊的完 整花器官， 但是tfs1。
22、的颖壳则表现出明显的不完整的表型。 0049 对tfs1材料的花器官进行显微观察， 结果如图4所示， 其中A为野生型材料雌蕊， B 和C为tfs1材料的雌蕊表型， 发现tfs1位雌性不育材料其雌蕊在外观上与野生型对照材料 一样； 0050 对tfs1材料的雄蕊表型及花粉活力进行测定， 结果如图5所示， 其中A， B和C为野生 型材料的花粉活力和雄蕊表型； D， E和F则是tfs1材料的花粉活力和雄蕊表型。 说明tfs1不 育材料的雄蕊和花粉活力都与野生型一致， 没有明显的差异。 0051 将tfs1材料作为父本与其他籼稻野生稻杂交， 所产生F1代杂交种子均为可育种 子， 但作为母本与其他可育材。
23、料杂交后代均不育。 0052 综上可知， tfs1材料的雄蕊生物学功能正常。 0053 2、 tfs1材料的遗传分析 0054 将tfs1不育材料通过正交和反交的方式与籼稻亚种明恢63和扬稻6号以及粳稻亚 种日本晴进行杂交， 结果如表1所示， 0055 表1.tfs1雌性不育性状和颖壳表型的遗传分析 说 明 书 4/6 页 6 CN 108967181 A 6 0056 0057 0058 由上表可知， tfs1材料作为母本完全不能产生F1杂交种子， 而作为父本则可产生 可育的F1代种子， 这些可育的F1代杂交种子自交后分离比例完全按照3:1的规律进行， 且 tfs1材料颖壳不闭合的表型与雌性。
24、不育表型完全连锁。 利用回交试验我们发现利用三种可 育材料作为回交亲本， 则回交1代(B1)全部为颖壳闭合可育株， 而以tfs1材料作为回交亲本 则颖壳闭合可育株和颖壳开裂不育株的比例为1:1， 说明这一对紧密连锁的性状受一个隐 性核基因所控制。 0059 综上可知， 本发明提供了一种水稻种质资源的创制方法， 利用表型差异较大的4亲 本构建筛选群体， 可确保杂交亲本的遗传多样性和有利于不育株的出现概率。 本发明所创 造的雌性不育水稻新种质是一种由一个隐性核基因控制的雌性不育材料， 受生长温度的影 响会发生育性的变化， 在正常高温(3035)生长条件下， 表现出完全不育的性状； 而在相 对低温(。
25、2527)生长条件下则可部分恢复育性， 其恢复效率在3070之间。 本发明首 次在田间发现温敏型雌性不育的水稻新种质。 0060 同样， 利用该种质的相对低温部分恢复育性的特性进行繁种， 将该雌性不育材料 与雄性不育系均匀混播后于正常高温下生长并进行杂交， 由于父本在该生长条件下为雌性 说 明 书 5/6 页 7 CN 108967181 A 7 不育， 因此可实现完全机械化水稻杂交制种， 极大缩减杂交水稻的制种成本， 也可用于根据 不同的目标筛选不同的杂交亲本， 具有非常重要的实践意义应用前景。 0061 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108967181 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 9 CN 108967181 A 9 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 10 CN 108967181 A 10 图5 说 明 书 附 图 3/3 页 11 CN 108967181 A 11 。