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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410538522.7 (22)申请日 2014.10.13 A61K 31/715(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 13/12(2006.01) (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上海市杨浦区邯郸路 220 号 (72)发明人 翁鸿博 力弘 潘玲玉 陈道峰 刘珍珍 章蕴毅 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 (54) 发明名称 柴胡多糖在制备防治糖尿病肾病的药物中的 用途 (57) 摘要 本发明属中药领域， 具体涉及柴胡多。
2、糖在制 备防治糖尿病药物中的用途。所述柴胡多糖提取 物经整体和离体实验证实， 对小鼠糖尿病肾病有 明显的防治作用。 柴胡多糖可改善疾病动物体重， 显著降低血糖和尿糖水平、 明显促胰岛素分泌， 降 低血清肌酐水平， 降低尿微量白蛋白分泌量， 降低 肾脏指数， 改善肾脏病理症状， 从而达到降血糖和 肾保护的作用。 柴胡多糖还可以逆转TGF-引起 的肾小管细胞转分化。可用于制备防治糖尿病以 及糖尿病引起的肾脏并发症药物。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图6页 CN 105560265 A 2016.05.11 CN 。
3、105560265 A 1/1 页 2 1. 柴胡多糖在制备治疗糖尿病药物中的用途。 2. 柴胡多糖在制备防治糖尿病肾病药物中的用途。 3. 按权利要求 1 或 2 所述的用途， 其特征在于， 所述的柴胡多糖通过下述方法制备 ： 取柴胡药材 100g， 以 95乙醇冷浸提取， 药渣于室温下置通风处晾干， 然后用热水提 取 3 次， 滤过， 合并提取液， 浓缩， 离心， 上清液以三氯醋酸去游离蛋白， 离心， 上清液用水透 析 3 天， 透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量 80， 离心， 沉淀冷冻干燥即得总多糖， 产物 收率达 3以上， 多糖含量超过 65 ； 所述的柴胡药材选自北柴胡 (Buple。
4、urum chinense DC)， 或小叶黑柴胡 (Bupleurum smithii var.parvifolium)。 权 利 要 求 书 CN 105560265 A 2 1/5 页 3 柴胡多糖在制备防治糖尿病肾病的药物中的用途 技术领域 0001 本发明属中药领域， 涉及中药柴胡多糖新的药用用途。具体涉及柴胡多糖在制备 防治糖尿病肾病的药物中的用途 背景技术 0002 糖尿病是以高血糖为特征的， 由于胰岛素绝对或相对分泌不足引发的一系列全身 性代谢紊乱综合征。中国疾病预防控制中心 2010 年的统计结果显示， 我国 18 岁及以上居 民糖尿病患病率达 9.65， 估计人数约为 96。
5、90 万人， 我国已经成为世界上糖尿病人口最多 的国家 ( 康继宏， Tiao Guan 等 . 转化医学研究 ,2012,2(3):1-24.)。随着我国城镇化的推 进和人口老龄化的加剧， 糖尿病患病率正迅速上升。糖尿病的危害主要是长期血糖过高导 致的各种微血管并发症。而糖尿病肾病 (Diabetic Nephropathy,DN) 是糖尿病的主要并发 症之一， 目前 l5 25的 l 型糖尿病及 30 40的 2 型糖尿病患者均存在 DN， DN 已 成为终末期肾病的首要病因。长期高血糖易破坏肾脏的滤过功能， 初期表现为微量白蛋白 尿， 随着病程延长， 尿蛋白增加， 肾脏清除血中毒素的能力。
6、逐渐减退， 最终发展为终末期肾 病 (ESRD)， 只能依靠血液透析或肾移植来维持生命。 0003 目前， 糖尿病肾病的发病机制尚未完全阐明， 涉及多种机制。 如何防治糖尿病肾病 已成为当前医药界关注的焦点。目前糖尿病肾病的临床治疗主要采取对症治疗和联合用 药， 综合降血糖、 降血脂及降血压等来治疗， 一直缺乏专门用于这一疾病的药物， 因而寻找 更有效的治疗药物成为迫切的任务。 0004 柴胡是一种我国常见的解表类中药， 为双子叶植物伞形科柴胡属 (Bupleurum) 植 物。柴胡始载于 神农本草经 ， 有解表退热、 疏肝解郁、 升举阳气的功效 ( 中华人民共和国 卫生部药典委员会， 中国药。
7、典， 一部。北京 ： 中国医药科技出版社 ,2010:263)， 具有抗炎、 止 痛、 降温等功效， 常作为复方治疗感冒、 头痛、 发热、 流行性感冒、 上呼吸道感染等。 0005 动物实验研究表明， 柴胡多糖可用于治疗炎症疾病(Navarro P,Giner RM等.Life Sci 68:1199-1206.) 和 自 身 免 疫 性 疾 病 (Yi-wen Jiang,Hong Li 等 .Clinical and Developmental Immunology,2012)。 0006 综观国内外的研究， 均未见报道柴胡多糖防治糖尿病肾病的药效。 发明内容 0007 本发明的目的是提供。
8、中药柴胡多糖新的药用用途 ； 具体涉及柴胡多糖在制备防治 糖尿病肾病的药物中的用途 0008 本发明从中药柴胡中分离提取得到总多糖提取物。 整体动物模型试验证实其具有 较强的防治实验性糖尿病肾病的作用， 离体实验证实其具有逆转 TGF- 诱导的肾小管细 胞转分化的作用。 0009 本发明所述的中药柴胡包括北柴胡 (Bupleurum chinense DC) 和小叶黑柴胡 (Bupleurum smithii var.parvifolium)。 说 明 书 CN 105560265 A 3 2/5 页 4 0010 本发明进行了动物实验， 实验结果显示， 柴胡多糖对糖尿病肾病有防治作用。 动物。
9、 实验结果证实， 柴胡多糖可显著降低血糖和尿糖水平、 明显促胰岛素分泌， 降低血清肌酐水 平， 降低尿微量白蛋白分泌量， 降低肾脏指数， 改善肾脏病理损伤， 表现出明显的降血糖和 肾保护的作用 ； 离体细胞实验结果也证实， 柴胡多糖有直接明显的肾保护作用， 在 TGF- 诱导的肾小管细胞病变模型中， 柴胡多糖逆转 TGF- 诱导的肾小管细胞转分化。进一步， 所述的柴胡多糖可用于制备防治糖尿病肾病的药物。 0011 本发明的目的通过下述方法实现 ： 0012 1. 柴胡多糖用于防治糖尿病肾病试验 ： 0013 1) 体重测定 0014 小鼠每两天称重一次， 并更换垫料。结果显示， 与模型组相比，。
10、 柴胡多糖各组可改 善糖尿病小鼠消瘦症状， 增加动物体重， 增强动物活动力。 0015 2) 肾脏指数测定 0016 小鼠处死当天称重， 为小鼠体重 ； 小鼠处死后， 取两侧肾脏， 用滤纸吸干表面血液， 称重， 得左肾重和右肾重， 取其平均数为肾脏重 ； 器官指数器官重量 (g)/ 体重 (g)*1000。 结果显示 : 与模型组相比， 柴胡多糖各剂量可降低肾脏指数， 高剂量具有显著性差异 (P0.05)。 0017 3) 血糖测定 0018 取小鼠血液， 离心得血清。按照葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖水平。结果显示， 与模 型组相比， 柴胡多糖各剂量可显著降低小鼠血糖水平 (P0.05)。 001。
11、9 4) 血清胰岛素含量测定 0020 取小鼠血液， 离心得血清。按照胰岛素 ELISA 试剂盒说明书测定胰岛素水平。结 果显示， 与模型组相比， 柴胡多糖各剂量可增加胰岛素水平， 改善胰岛素分泌， 高剂量具有 显著性差异 (P0.01)。 0021 5) 血清肌酐含量测定 0022 取小鼠血液， 离心得血清。按照肌酐试剂盒说明书测定肌酐含量。结果显示， 与模 型组相比， 柴胡多糖各剂量可显著降低小鼠肌酐水平 (P0.01)。 0023 6) 尿糖含量测定 0024 收集小鼠 5h 尿液样本， 离心后， 取上清， 1 ： 20 稀释。尿糖按照葡萄糖氧化酶法测 定。结果显示， 与模型组相比， 柴。
12、胡多糖各剂量可降低尿糖水平， 高剂量具有显著性差异 (P0.01)。 0025 7) 尿微量白蛋白测定 0026 收集小鼠5h尿液样本， 离心后， 取上清， 1 ： 10稀释。 尿样按照微量白蛋白ELISA试 剂盒说明书测定。结果显示， 与模型组相比， 柴胡多糖各剂量可降低尿微量白蛋白分泌量， 高剂量具有显著性差异 (P0.01)。 0027 8) 肾脏病理 0028 小鼠处死后， 取左侧肾脏和胰腺， 放入 10福尔马林固定， 4m 石蜡切片， 苏木 精 - 伊红染色。结果显示， 与模型组相比， 柴胡多糖各剂量可明显减轻肾脏肥大， 肾小球基 质增生， 肾小管空泡化等 DN 肾脏病理症状。 00。
13、29 2. 柴胡多糖用于 TGF- 诱导的肾小管细胞转分化试验 说 明 书 CN 105560265 A 4 3/5 页 5 0030 当机体处于糖尿病肾病时， 高糖诱导肾脏TGF-(转化生长因子)表达增高， 进 而引起肾小管细胞转分化成成纤维细胞， 形成肾脏纤维化。在离体实验中， 建立 TGF- 诱 导的肾小管细胞转分化模型， 模拟体内糖尿病肾病环境。 结果显示， 正常肾小管上皮细胞形 态呈椭圆形铺路石状或多边形 ； 模型组肾小管上皮细胞失去固有形态 , 呈成纤维细胞样的 长梭形 ； 与模型组相比， 柴胡多糖各剂量可明显逆转 TGF- 诱导的细胞形态变化。 0031 表 1 糖尿病肾病小鼠体。
14、重及肾脏指数 (XSD) 0032 0033 表 2 糖尿病肾病小鼠血清及尿液指标 (XSD) 0034 说 明 书 CN 105560265 A 5 4/5 页 6 0035 其中， * 与模型组比较 P0.05 ； * 与模型组比较 P0.01 ； * 与模型组比较 P0.001 ； 附图说明 0036 图 1 糖尿病肾病小鼠体重变化结果。 0037 图 2 糖尿病肾病小鼠肾脏指数结果。 0038 图 3 糖尿病肾病小鼠血糖水平测定结果。 0039 图 4 糖尿病肾病小鼠血清胰岛素含量测定结果。 0040 图 5 糖尿病肾病小鼠血清肌酐水平测定结果。 0041 图 6 糖尿病肾病小鼠尿糖水。
15、平测定结果。 0042 图 7 糖尿病肾病小鼠尿微量白蛋白分泌量测定结果。 0043 图 8 正常组小鼠肾脏 HE 染色图。 0044 图 9 柴胡单给药组小鼠肾脏 HE 染色图。 0045 图 10 模型组小鼠肾脏 HE 染色图。 0046 图 11 30mg/kg 柴胡多糖给药组小鼠肾脏 HE 染色图。 0047 图 12 60mg/kg 柴胡多糖给药组小鼠肾脏 HE 染色图。 0048 图 13 7.2mg/kg 格列苯脲给药组小鼠肾脏 HE 染色图。 0049 图 14 TGF- 诱导的转分化实验 - 肾小管细胞形态变化图 ( 苯胺蓝染色 )。 具体实施方式 0050 实施例 1 00。
16、51 取柴胡药材 100g， 以 95乙醇冷浸提取， 药渣于室温下置通风处晾干， 然后用热 水提取 3 次， 滤过， 合并提取液， 浓缩， 离心， 上清液以三氯醋酸去游离蛋白， 离心， 上清液用 水透析 3 天， 透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量 80， 离心， 沉淀冷冻干燥即得总多糖， 产物收率达 3以上， 多糖含量超过 65。 0052 所述的柴胡药材可选自北柴胡 (Bupleurum chinense DC)， 或小叶黑柴胡 (Bupleurum smithii var.parvifolium)。 0053 实施例 2 0054 C57BL/6 小鼠 56 只 (8 周龄 ), 按体重随。
17、机分为 6 组 (A、 B、 C、 D、 E、 F 组 ) ： A 组为正 常对照组， B组为柴胡多糖单给药组(正常小鼠给予柴胡多糖， 给药剂量60mg kg-1)， C组为 模型组， D 组为模型组 + 柴胡多糖 30mgkg-1剂量组， E 组为模型组 + 柴胡多糖 60mgkg-1 剂量组， F 组为模型组 + 格列苯脲阳性组 (7.2mgkg-1)， 每组 8-12 只不等。以造模前一天 为 Day-1， 小鼠隔夜禁食 15 小时后， C、 D、 E、 F 组造模， 以 STZ(Streptozotocin， 链脲佐菌 素 )100mg/kg 的剂量， 连续两天腹腔注射 (0.1mL1。
18、0g-1)。A、 B 组小鼠注射等量生理盐水 模拟造模步骤。造模后小鼠正常饲料喂养， 72h 内观察小鼠存活率。Day9 上午 8 点割尾取 血， 用血糖仪测动物晨起血糖， 选取血糖 16.8mmol/L 小鼠， 作为糖尿病模型小鼠， 按血糖 随机分组， 给药组开始每天一次灌胃给药， 持续 35 天 (Day9-Day44)。于 Day37-38， 利用小 鼠代谢笼收集 5 小时尿样， 800g 离心 15min， 取上清， 称重， -20冷冻、 待测。尿样用于检 测尿糖、 尿微量白蛋白等指标。Day44 小鼠摘眼球取血， 血液 800g 离心 10 分钟后， 收集， 分 说 明 书 CN 1。
19、05560265 A 6 5/5 页 7 装， -20保存、 待测。血样用于检测血糖、 血清胰岛素等指标。同时取出小鼠肾脏， 于精密 天平上称量， 记录， 计算器官指数， 器官指数器官重量 (g)/ 体重 (g)*1000。左肾用刀沿 肾盂弯口切开， 置于 10福尔马林溶液中保存， 用于制备石蜡切片。右肾用锡纸包裹后置 于 -80冰箱中存放。 0055 实施例 3 0056 肾小管细胞种板， 贴壁过夜， 饥饿 24h 后， 将实验分为 10 组。分别为 ： Normal 组 ( 正常对照组 ) ； TGF- 组 ( 模型组 ) ； SB 组 ( 单加 TGF- 抑制剂 ) ； BPs20 组 。
20、( 单加柴胡 20g/mL 组 ) ； BPs40 组 ( 单加柴胡 40g/mL 组 ) ； BPs80 组 ( 单加柴胡 80g/mL 组 ) ； SB-TGF 组 ； BPs20-TGF 组 ； BPs40-TGF 组 ； BPs80-TGF 组。各组干预 48h 后， 细胞用 4多聚 甲醛固定， 倒置显微镜下观察细胞形态， 拍照。 0057 动物实验研究结果表明， 柴胡多糖可改善糖尿病模型动物体重， 显著降低血糖和 尿糖水平、 明显改善胰岛素分泌， 降低血清肌酐水平， 降低尿微量白蛋白分泌量， 降低肾脏 指数。病理检查结果表明， 模型组动物肾小球系膜细胞明显增多， 系膜基质增生， 肾小。
21、球截 面积明显增大， 大量肾小管上皮细胞空泡化， 部分上皮细胞细胞核脱落。与模型组相比， 柴 胡多糖各剂量可明显减轻肾小球基质增生， 肾小管空泡化的病理症状， 延缓糖尿病肾病的 进展。离体细胞实验研究表明， 柴胡多糖可以逆转 TGF- 引起的肾小管细胞转分化， 提示 可预防糖尿病引起的肾小管病变。 动物实验和离体细胞实验共同提示柴胡多糖对小鼠糖尿 病肾病具有降血糖和肾保护两方面的作用。 说 明 书 CN 105560265 A 7 1/6 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 105560265 A 8 2/6 页 9 图 3 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 105560265 A 9 3/6 页 10 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 105560265 A 10 4/6 页 11 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 105560265 A 11 5/6 页 12 图 11 图 12 说 明 书 附 图 CN 105560265 A 12 6/6 页 13 图 13 图 14 说 明 书 附 图 CN 105560265 A 13 。