优先权
该PCT申请要求于2013年3月14日提交的美国临时申请第 61/784,122号的优先权。该临时申请为了所有目的通过引用整体并入 本文。
发明领域
本文的实施方案涉及用于稳定减毒活病毒的组合物和方法。其他 实施方案涉及用于降低减毒活病毒退化的组合物和方法。其他实施方 案涉及这些组合物在便携式施用和方法的试剂盒中的用途。
发明背景
保护免受病毒感染的疫苗已经被有效地用于降低人或动物疾病的 发病率。对于病毒疫苗的一种最成功的技术是用病毒的减弱株或减毒 株(“减毒活病毒”)使动物或人免疫。由于免疫后有限的复制，减毒 株不会引起疾病。然而，有限的病毒复制足以表达病毒抗原的全部库 (repertoire)并且产生对病毒有效的且持久的免疫应答。因此，在后来 暴露于所述病毒的致病菌株时，保护免疫个体免受疾病。这些减毒活 病毒疫苗为公共健康中所使用的最成功疫苗之一。
在美国被批准销售的大多数病毒疫苗是减毒活病毒。高度成功的 活病毒疫苗包括黄热病17D病毒、Sabin脊髓灰质炎病毒1型、2型和 3型、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、水痘病毒和牛痘病毒。使 用牛痘病毒疫苗控制天花的暴发导致人疾病的首次且唯一根除。Sabin 脊髓灰质炎病毒疫苗已经帮助全世界预防肢残疾病并且正被努力用于 根除小儿麻痹症。儿童接种麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗和水痘 疫苗预防国际上数百万的死亡和疾病。
基孔肯雅热(chikungunyafever)，最近再次出现的蚊媒病毒疾病在 非洲和亚洲引起数百万例严重的且通常慢性的关节痛。基孔肯雅病最 近在加勒比海出现，这表明其传播至西半球。针对该病况的疫苗不仅 预防在世界的疾病流行地的疾病，而且降低进入美国和美洲其他地方 的风险。
最近的技术进步，如重配、反向遗传学和冷适应已经导致针对流 感病毒和轮状病毒的减毒活病毒的许可。用重组DNA技术开发的许 多活病毒疫苗正在动物和人临床试验中。这些重组的病毒疫苗依赖于 良好特征的减毒病毒疫苗的操作。所述安全的、减毒病毒是遗传改造 的以表达其他病毒或细菌病原体的保护性抗原。
为了使减毒活病毒疫苗有效，它们必须能够在免疫后复制。因此， 使病毒失活的任何因素可削弱疫苗。除了冷冻干燥之外，已鉴定了能 帮助稳定减毒活病毒疫苗中的病毒的不同添加剂(参见：例如Burke, Hsuetal1999)。
其他通常使用的疫苗对温度极限敏感；过热或偶然冷冻可使疫苗 失活。在发展中国家中，在整个配送中维持该“冷链”是特别困难的。 因此，依然存在改善既有的和新开发的减毒活病毒疫苗制剂的稳定性 的需求。
发明概述
本文的实施方案涉及减少或防止减毒活甲病毒组合物退化或失活 的方法和组合物。所公开的某些组合物可包括降低减毒活甲病毒退化 的组分的组合。本文其他实施方案涉及极大地提高减毒活甲病毒稳定 性的赋形剂的组合。然而本文其他组合物和方法涉及当增加水性和/ 或复溶的减毒活甲病毒的保存期限时，降低对较低温度的需求(例如冷 冻或冻藏)。根据这些实施方案，减毒活甲病毒组合物可被用于诱导对 对象中的甲病毒的免疫应答，其中所述对象可具有由甲病毒引起的降 低的感染发生率。
针对组合物的一些实施方案可包括但不限于一种或多种减毒活甲 病毒，如一种或多种减毒活甲病毒与HEPES缓冲液、一种或多种碳水 化合物和明胶的组合。根据这些实施方案，在对象中使用的任何 HEPES缓冲液以及任何明胶产物可被用在组合物中。明胶的来源可从 源自哺乳动物源到合成产生的明胶形式变化。在组合物中使用的碳水 化合物包括但不限于蔗糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、果糖、山梨醇、 右旋糖、甘露醇和其他碳水化合物来源。在某些实施方案中，需要全 部三种组分来稳定减毒活甲病毒组合物。在其他实施方案中，可将盐 加入到组合物中以提供组合物的盐度或渗透度(例如氯化钠或其他 盐)。在某些实施方案中，本文所考虑的的组合物可包括但不限于：在 约1-40mMHEPES下约pH6.0-pH10.0的缓冲HEPES，一种或多种 约1-25％(w/v)的碳水化合物剂，和一种或多种包括约0.01-5.0％(w/v) 明胶的蛋白剂，其中所述组合物减少减毒活甲病毒的失活和/或退化。
本文所考虑的的组合物可增加减毒活甲病毒的稳定性和/或减少 减毒活甲病毒的失活和/或退化，所述甲病毒包括但不限于：基孔肯雅 病毒、欧尼恩病毒、罗斯河病毒、东方马脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒 和西方马脑炎或在冠状病毒科和披膜病毒科家族中的其他甲病毒。其 他西门利启森林病毒复合体(SemlikiForestviruscomplexes)包括但不 限于：比巴鲁病毒、马亚罗病毒，亚型：乌纳病毒、欧尼恩病毒：亚 型：伊博-奥拉病毒、罗斯河病毒：亚型：比巴鲁病毒；亚型：盖他病 毒；亚型：鹭山病毒(Sagiyamavirus)、西门利启森林病毒：亚型：Me Tri病毒。
基孔肯雅病毒是具有大约11.6kb的正义单链RNA基因组的甲病 毒。它是西门利启森林病毒复合体的成员并且与罗斯河病毒、欧尼恩 病毒和西门利启森林病毒密切相关。本文所公开的组合物可被用于西 门利启森林病毒复合体的任何成员以增加在疫苗组合物中使用的减毒 活病毒的稳定性或降低其退化。
人上皮、内皮、原代成纤维细胞和单核细胞源性巨噬细胞体外容 许基孔肯雅病毒，并且病毒复制是高度细胞病变的，但其对I和II型 干扰素是敏感的。在体内，基孔肯雅病毒似乎在成纤维细胞、骨骼肌 祖细胞和肌纤维中复制。
其他实施方案涉及针对能够降低或预防由本文所考虑的一种或多 种甲病毒引起的医学病况发生的疫苗或免疫原性组合物的减毒活病毒 组合物和方法。
本文所公开的药物组合物涉及制备或配制引入对象如人、动物(如 家养动物或牲畜)的组合物。
在某些实施方案中，本文所考虑的组合物可为部分或全部地脱水 或水化的。而且，本文所公开的组合物可在减毒活甲病毒组合物冻干 期间和之后使用。根据这些实施方案，组合物可为20％或更高、30％ 或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或 更高、或90％或者95％或更高脱水的。本文所描述的组合物能够增加 水性的或再水化的减毒活甲病毒的保存期限。本文所公开的组合物增 加减毒活甲病毒在宽范围温度如室温、零下温度、升高的温度(例如 -80℃-37℃以上)下于冻干的或液体的/冷冻状态下的稳定性。在某些 实施方案中，与未暴露于至少HEPES缓冲液、碳水化合物和明胶的组 合物的减毒活甲病毒组合物相比，本文所公开的组合物能将减毒活甲 病毒的稳定性增加2倍、4倍、10倍或更多。
其他的实施方案涉及用于减少减毒活甲病毒失活的方法，其包括 但不限于，将一种或多种减毒活甲病毒与能够降低减毒活病毒失活的 组合物组合，所述组合物包括但不限于：一种或多种蛋白剂；一种或 多种糖类或多元醇剂；和一种或多种缓冲液，其中组合物减少减毒活 病毒的失活。根据这些实施方案，减毒活病毒可包括但不限于披膜病 毒或冠状病毒，或者在某些实施方案中，包括任何甲病毒。
在某些实施方案中，本文所考虑的组合物能够在室温(例如约 20℃-约25℃或甚至高达37℃)或冷藏温度(例如约0℃-约10℃)下超 过12-24小时减少水化的减毒活甲病毒的失活和/或退化。在一些实施 方案中，组合组合物能够将约100％的减毒活甲病毒维持大于24小时。 此外，本文所考虑的组合组合物能够在至少2次、至少3次、至少4 次、至少5次、至少6次和更多次冻融循环期间降低水化的减毒活病 毒的失活。其他方法涉及能够在冷藏温度(例如约0℃-约10℃)下将水 化的减毒活病毒的失活降低约24小时-约50天的组合组合物。在这些 方法中所考虑的组合物可包括但不限于：缓冲液、HEPES缓冲液、一 种或多种碳水化合物如蔗糖或海藻糖以及一种或多种包括明胶的蛋白 剂。在某些实施方案中，减毒活病毒组合物在大约37℃下大于20个 小时后保留约100％的病毒滴度，在4℃左右的冷藏温度下50天后保 留约100％的病毒滴度。本文其他的实施方案可包括在大约21℃下7 天后保留约90％或约80％的病毒滴度并且在4℃左右的冷藏温度下50 天后保留约90％或约80％的病毒滴度的减毒活甲病毒组合物。所考虑 的其他实施方案包括与本领域已知的其他组合物相比，在大约37℃ 下数小时(例如20小时)后保留约3x-约10x病毒滴度浓度的减毒活病 毒组合物(参见：例如，图3和4)。当组合物储存在大约37℃下时， 本文所公开的组合物减少减毒活甲病毒的退化。
其他实施方案涉及用于减少减毒活病毒组合物失活的试剂盒，其 包括但不限于容器和组合物，所述组合物包括但不限于：在约1-30mM HEPES下约pH6.0-pH10.0的缓冲HEPES、一种或多种约1-25％(w/v) 碳水化合物剂(例如蔗糖和/或海藻糖)以及一种或多种包括约 0.01-5.0％(w/v)明胶的蛋白剂，其中组合物减少减毒活甲病毒的失活和 /或退化。根据这些实施方案，试剂盒还可包括一种或多种减毒活甲病 毒。在其他实施方案中，试剂盒还可包括盐或盐溶液(例如氯化钠)。
在其他实施方案中，本文所考虑的组合物可含有微量或无二价阳 离子。例如，本文所考虑的组合物可具有微量或无钙/镁(Ca+2/Mg+2)。
附图简述
下面的附图组成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本 文具体实施方案的某些方面。可通过参考这些附图中的一个或多个结 合本文所提供的详述更好地理解实施方案。
图1表示使用不同组合物测试示例性减毒甲病毒组合物在37℃ 下的稳定性的实验的示例性直方图。
图2表示使用具有不同碳水化合物剂的组合物测试示例性减毒甲 病毒组合物在4℃下的稳定性的实验的示例性直方图。
图3表示使用不同组合物测试示例性减毒甲病毒组合物在37℃ 下的稳定性的实验的示例性直方图。
图4表示使用不同组合物测试示例性减毒甲病毒组合物在37℃ 下的稳定性的实验的示例性直方图。
图5表示使用不同液体组合物测试示例性减毒甲病毒组合物在 4℃下的稳定性的实验的示例性绘图数据。
图6表示使用不同液体组合物测试示例性减毒甲病毒组合物在 -80℃下的稳定性的实验的示例性绘图数据。
图7表示使用不同的冻干组合物测试示例性减毒甲病毒组合物在 4℃下的稳定性的实验的示例性绘图数据。
图8表示使用不同的冻干组合物代表示例性减毒甲病毒组合物在 -80℃下的示例性直方图的实验的示例性绘图数据。
图9表示使用具有不同明胶制剂的多种组合物测试示例性减毒甲 病毒组合物的稳定性的实验的示例性直方图。
图10表示使用具有不同明胶制剂的多种组合物测试冻融处理后 的示例性减毒甲病毒组合物的稳定性的实验的示例性直方图。
图11表示使用具有不同明胶制剂的多种组合物测试冻干后的示 例性减毒甲病毒组合物的稳定性的实验的示例性直方图。
示例性实施方案的描述
定义
如本文所使用的，“一个(a)”或“一种(an)”可意指一项或多于一 项。
如本文所使用的，“约”可意指至多且包括正或负百分之五，例如， 约100可意指95和至多105。
如本文所使用的，“碳水化合物”剂可意指一种或多种单糖(例如 葡萄糖、半乳糖、核糖、甘露糖、鼠李糖、塔罗糖、木糖或阿洛糖、 阿拉伯糖)、一种或多种二糖(例如海藻糖，蔗糖，麦芽糖、异麦芽糖、 纤维二糖(cellibiose)、半乳糖、龙胆二糖，昆布二糖、木二糖、甘露二 糖、乳糖或果糖)、三糖(例如阿卡波糖、棉子糖、松三糖、潘塘或纤 维三糖)或糖聚合物(例如右旋糖酐、黄原胶、普鲁兰多糖、环糊精、 直链淀粉、支链淀粉、淀粉、纤维低聚糖(celloologosaccharides)、纤维 素、麦芽低聚糖、糖原、壳聚糖或几丁质)。
如本文所使用的CHIKV可意指基孔肯雅病毒。
如本文所使用的TCID50可意指50％的组织培养感染剂量。
如本文所使用的HB可意指HEPES缓冲盐水。
如本文所使用的HBS可意指HEPES缓冲盐水+蔗糖。
如本文所使用的HSG可意指HEPES缓冲盐水+蔗糖+明胶。
如本文所使用的IRES可意指内部核糖体进入位点。
如本文所使用的DMEM可意指达尔伯克改良必需基本培养基。
如本文所使用的MCT可意指微量离心管。
如本文所使用的PBS可意指磷酸盐缓冲盐水。
如本文所使用的FBS可意指胎牛血清。
如本文所使用的Pre-MVS可意指前主病毒种子。
如本文所使用的Lyo可意指冻干的或脱水的，其取决于参照的制 剂。
如本文使用的明胶可为半透明的、无色的、易碎的(当为干的时)、 无味的固体物质，其来源于从不同动物副产品或其他来源获得的胶原。 它通常被用作胶凝剂并且为商业上可得的。本文所考虑任何商业上可 得的、分离的或合成的明胶剂。
如本文所使用的，“减毒病毒”可意指当施用于动物时显示降低的 或无临床疾病症状的病毒。
详述
在下面的部分，描述多种示例性组合物和方法以便详述多种实施 方案。对本领域技术人员显而易见的是实施多种实施方案不需要利用 本文所概述的所有或甚至部分具体细节，而是可通过常规实验改良浓 度、时间以及其他具体细节。在一些情况下，本说明书中没有包括公 知的方法或组分。
在本文所公开的某些实施方案中已评估了甲病毒疫苗的稳定性。 在某些实施方案中，已证明对液体的、冷冻的、冻干的和再水化的减 毒活甲病毒制剂的滴度的损失给予明显保护作用的制剂。在某些实施 方案中，本文所公开的组合物涉及HEPES缓冲液、一种或多种包括明 胶的蛋白剂和一种或多种碳水化合物剂的两种或更多种或全部三种组 分的组合。
在某些实施方案中，本文所公开的组合物可包含HEPES缓冲液中 的甲病毒、包含至少一种蔗糖或海藻糖的碳水化合物以及来源于任何 来源的明胶(例如药物级或能够被引入对象的级别)。本文所公开的某 些组合物包含盐或盐溶液。这些制剂可被用于在约-80℃-约37℃或在 无明显丧失CHIK疫苗的上述储存温度下的液体的、冷冻的或冻干的 减毒活甲病毒。例如，长期储存在4℃对于该制剂也是一种可能。
本文的实施方案涉及减少或防止减毒活甲病毒组合物退化或失活 的方法和组合物。所公开的某些组合物可包含降低减毒活病毒退化的 组分的组合。本文其他的实施方案涉及极大地提高减毒活病毒稳定性 的赋形剂的组合。然而本文其他的组合物和方法涉及当增加水性和/ 或复溶的减毒活甲病毒的保存期限时，降低对较低温度(例如冷冻或冻 藏)的需求。
根据这些实施方案，某些减毒活病毒涉及甲病毒。针对组合物的 一些实施方案可包括但不限于：一种或多种减毒活甲病毒，如一种或 多种减毒活甲病毒与HEPES缓冲液、一种或多种碳水化合物和/或一 种或多种包括明胶的蛋白剂的组合。在某些实施方案中，本文所公开 的甲病毒制剂包含至少所有三种组分。在其他实施方案中，可加入盐 以便增加所述制剂的缓冲能力。
本文所考虑的组合物可增加减毒活甲病毒的稳定性和/或降低减 毒活甲病毒的失活和/或退化，所述减毒活甲病毒包括但不限于以下减 毒活甲病毒，其包括但不限于：基孔肯雅病毒、欧尼恩病毒、罗斯河 病毒、东方马脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒和西方马脑炎或在冠状病毒 科和披膜病毒科家族的其他甲病毒。
其他实施方案涉及针对能够降低或预防由本文所考虑的一种或多 种甲病毒引起的医学病况发生的疫苗组合物的减毒活病毒组合物和方 法。在某些实施方案中，减毒活甲病毒为不能在蚊群中复制的甲病毒。 在其他实施方案中，本文所考虑的减毒活甲病毒在真核生物控制下操 作(例如IRES序列的插入)。
在某些实施方案中，本文所考虑的组合物可为部分或全部地脱水 的或水化的。在其他实施方案中，在本文组合物中使用的所所考虑的 碳水化合物剂可包括但不限于：蔗糖、果糖、半乳糖和海藻糖。
在某些实施方案中，HEPES缓冲液为约1mM-约40mM；碳水化 合物浓度为约1％-约25％(w/v)；以及明胶为约0.01％-约5％。在其他 实施方案中，HEPES缓冲液为约lmM-约20mM；碳水化合物浓度为 约5-约20％(w/v)；以及明胶为约0.1％-约2％。在其他实施方案中， HEPES缓冲液为约5mM-约15mM；碳水化合物浓度为约5％-约 25％(w/v)；以及明胶为约0.5％-约1.5％。在某些实施方案中，制剂还 可包含10-150mM盐(例如氯化钠或本领域已知的其他适当的盐)。其 他缓冲剂可被用于本文某些组合物中与上述所需要的三种组分组合。
本文的一些实施方案涉及部分或全部脱水的减毒活甲病毒组合 物。根据这些实施方案，组合物可为20％或更高、30％或更高、40％ 或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、或90％ 或更高脱水的。在其他实施方案中，本文所公开的组合物可为完全冻 干的组合物。
其他实施方案涉及用于减少减毒活甲病毒失活的方法，其包括但 不限于将一种或多种活减毒甲病毒与能够降低减毒活甲病毒失活的组 合物组合，所述组合物包括但不限于：一种或多种蛋白剂；一种或多 种碳水化合物、糖类或多元醇剂以及HEPES缓冲液，其中所述组合物 减少减毒活甲病毒的失活。根据这些实施方案，减毒活病毒可包括具 体的甲病毒，如与CHIK有关的那些甲病毒(例如西门利启森林病毒复 合体)。
此外，本文所公开的方法和组合物可包括用于组合的冷冻干燥或 其他脱水方法。根据这些方法和组合物，所述方法和组合物减少冷冻 干燥的或者部分或全部脱水的减毒活病毒的失活。在其他方法中，用 于减少减毒活病毒失活的组合物可包含水性组合物或可包含脱水后再 水化的组合物。本文所描述的组合物能够增加水性或再水化的活减毒 甲病毒的保存期限。
在某些实施方案中，本文所考虑的组合物能够在室温(例如约 20℃-约25℃或甚至高达37℃)或冷藏温度(例如约0℃-约10℃)下超 过12-24小时减少水化的减毒活甲病毒的失活和/或退化。在一些实施 方案中，组合组合物能够将约100％的减毒活甲病毒维持大于24小时。 此外，本文所考虑的组合组合物能够在至少2次(或3次或4次或5次 等)冻融循环期间降低水化的减毒活病毒的失活。其他方法涉及能够在 冷藏温度(例如约0℃-约10℃)下将水化的减毒活病毒的失活降低约24 小时至大于50天的组合组合物。在这些方法中所考虑的组合物可包括 但不限于：缓冲液(HEPES缓冲液)、一种或多种碳水化合物如蔗糖或 海藻糖以及一种或多种包括明胶的蛋白剂。在某些实施方案中，减毒 活病毒组合物在大约37℃下超过20小时后保留约100％的病毒滴度 以及在4℃左右的冷藏温度下超过50天后保留约100％的病毒滴度。 本文其他实施方案可包括减毒活甲病毒组合物在大约21℃下7天后保 留约90％或约80％的病毒滴度以及在4℃左右的冷藏温度下50天后 保留约90％或约80％的病毒滴度。所考虑的其他实施方案包括与本领 域已知的其他组合物相比，减毒活病毒组合物在大约37℃下数小时 (例如20小时)后保留约3x-约10x浓度的病毒滴度(参见实施例部分)。 当组合物储存在大约37℃以及其他温度时，本文所公开的组合物降低 减毒活甲病毒的退化。
其他实施方案涉及用于减少减毒活病毒组合物失活的试剂盒，其 包括但不限于，容器和组合物，所述组合物包括但不限于：约pH6.0-pH 10.0的缓冲HEPES、一种或多种碳水化合物剂(例如蔗糖和/或海藻糖) 以及一种或多种包括明胶的蛋白剂，其中所述组合物减少减毒活甲病 毒的失活和/或退化。根据这些实施方案，试剂盒还可包括一种或多种 减毒活甲病毒、在约1-40mMHEPES下约pH6.0-pH10.0的缓冲 HEPES、一种或多种约1％-25％(w/v)的碳水化合物剂以及一种或多种 包括约0.01％-5.0％(w/v)明胶的蛋白剂，其中所述组合物减少减毒活甲 病毒的失活和/或退化。
在其他实施方案中，本文所考虑的组合物可含有微量或无二价阳 离子。例如，本文所考虑的组合物可具有微量或无钙/镁(Ca+2/Mg+2)。
已确定没有减毒活甲病毒疫苗的制剂为冻干制剂提供温度超过 2-8℃的长期稳定性。此外，已描述没有制剂防止滴度的损失、稳定 水性疫苗或降低其退化保持超过几小时。
也已描述了其他减毒活病毒的制剂(参见例如Burke,Hsuetal. 1999)。被称为SPGA的一种常见稳定剂为2-10％蔗糖、磷酸盐、谷氨 酸钾和0.5-2％血清白蛋白的混合物(参见例如Bovarnick,Milleretal. 1950)。已确定该基本制剂的多种改良具有不同的阳离子、淀粉水解液 或右旋糖酐替换蔗糖以及酪蛋白水解液或多聚乙烯吡咯烷酮替换血清 白蛋白。其他制剂使用水解的明胶代替血清白蛋白作为蛋白源(Burke, Hsuetal1999)。然而，在免疫的儿童中，明胶可引起过敏反应并且可 能是疫苗-相关不良事件的原因。美国专利6,210,683描述了在疫苗制 剂中用重组人血清白蛋白替换纯化自人血清的白蛋白。
本文的实施方案公开与现有领域的组合物相比提高减毒活病毒疫 苗的稳定性和/或降低减毒活病毒疫苗退化的组合物。在约37℃下本 文所公开的某些组合物为水性病毒提供至多2小时、至多3小时、至 多4小时以及超过21小时的稳定性。在约室温(例如25℃)下本文所公 开的某些组合物为水性病毒提供至多1天-约1周或更久的稳定性。本 文所考虑的实施方案为减毒活病毒提供对例如冷冻和/或解冻，和/或高 温增加的保护。在某些实施方案中，本文的组合物可在室温条件(例如 约25℃)稳定脱水的减毒活病毒产物、降低其退化和/或防止其失活。 在其他实施方案中，本文所考虑的组合物可在约25℃或至多约37℃ 稳定水性减毒活病毒产物、降低其退化和/或防止其失活。本文所公开 的组合物和方法可促进病毒疫苗在发达和不发达地区的储存、分发、 递送和施用。
本领域技术人员将认识到本文的组合物或制剂涉及通过任何方法 减毒的病毒，所述方法包括但不限于：细胞培养传代、重配、侵染性 克隆中突变的掺入、反向遗传学、其他重组DNA或RNA操作。此外， 本领域技术人员将认识到其他实施方案涉及被改造以表达任何其他蛋 白质或RNA的病毒，其包括但不限于重组的甲病毒。这样的病毒可被 用作传染性疾病的疫苗、治疗肿瘤学病况的疫苗或引入表达蛋白质或 RNA(例如，基因疗法、反义疗法、核糖酶疗法或小抑制RNA疗法) 以治疗病症的病毒。
在一些实施方案中，本文的组合物可含有一种或多种披膜病毒或 冠状病毒的有膜包膜的病毒(例如，包膜病毒)或者披膜病毒家族的任 何甲病毒。在其他实施方案中，本文的组合物可含有披膜病毒或冠状 病毒家族的一种或多种包膜、正链RNA病毒。在某些实施方案中，组 合物可含有这样的一种或多种减毒活甲病毒(例如基孔肯雅病毒)，其 具有一种或多种插入、缺失或突变以诱导所述病毒减毒供在疫苗组合 物中使用。
在某些实施方案中，减毒活甲病毒组合物可包含于2009年1月 23日提交的标题为“ATTENUATEDRECOMBINANTALPHAVIRUSES INCAPABLEOFREPLICATINGINMOSQUITOESANDUSES THEREOF(不能在蚊群中复制的减毒重组甲病毒及其用途)”的美国申 请第PCT/US2009/000458号以及于2010年7月23日提交的美国专利 申请第12/804,535号中所描述的一种或多种减毒活甲病毒的构建体， 所述申请及其延续和分案为了所有目的通过引用整体并入。
本文的一些实施方案涉及呈水性或冻干形式的减毒活病毒的组合 物。本领域技术人员将认识到：改善热病毒稳定性并且防止冻融失活 的制剂将改善为液体的、粉末的、冷冻干燥的或冻干的并通过本领域 已知的方法制备的产物。复溶后，这样稳定的疫苗可通过多种途径施 用，其包括但不限于：皮内施用、皮下施用、肌内施用、鼻内施用、 肺部施用或口服施用。在本领域中已知多种设备用于疫苗的递送，所 述设备包括但不限于：注射器和针注射、分叉针施用、通过皮内贴剂 或泵施用、皮内无针喷射递送(皮内等)、皮内颗粒递送或气溶胶粉末 递送。
实施方案可包含由以下组成的组合物：一种或多种减毒活病毒(如 上所述)和HEPES缓冲液或类似缓冲液、一种或多种碳水化合物以及 一种或多种包含明胶的蛋白质的混合物。在某些实施方案中，组合物 包括但不限于：一种或多种减毒活甲病毒、HEPES缓冲液或类似缓冲 液、蔗糖或海藻糖的一种或多种以及一种或多种包含明胶的蛋白质。
在一些实施方案中，碳水化合物为糖或多元醇。糖可包括但不限 于：单糖(例如葡萄糖、半乳糖、核糖、甘露糖、鼠李糖、塔罗糖、木 糖或阿洛糖阿拉伯糖)、二糖(例如海藻糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、 纤维二糖、龙胆二糖、昆布二糖、木二糖、甘露二糖、乳糖或果糖)、 三糖(例如阿卡波糖、棉子糖、松三糖、潘塘或纤维三糖)或糖聚合物(例 如右旋糖酐、黄原胶、普鲁兰多糖、环糊精、直链淀粉、支链淀粉、 淀粉、纤维低聚糖、纤维素、麦芽低聚糖、糖原、壳聚糖或几丁质)。 多元醇可包括但不限于：甘露醇、山梨醇、阿拉伯醇、赤藓醇、麦芽 糖醇、木糖醇、甘糖醇(glycitol)、甘醇、聚甘糖醇、聚乙二醇、聚丙 二醇和甘油。
能耐受低水状态的脱水生物体含有大量的海藻糖。已显示海藻糖 能防止干燥期间可引起膜不稳定的膜融合事件和相变。结构分析表明 海藻糖在脂质双层的极性头部基团之间非常适合。海藻糖也防止干燥 期间不稳定蛋白的变性。据认为，海藻糖通过与极性蛋白质残基的氢 键来稳定蛋白质。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1：1连接组成的二糖。 由于1：1连接，海藻糖具有很少或无还原能力，因此与氨基酸和蛋白 质基本上为非-反应的。没有还原活性可提高海藻糖对蛋白质的稳定影 响。在某些实施方案中，海藻糖为减毒活病毒提供稳定性。海藻糖的 这种活性可能是由于它能够稳定病毒的膜和外壳蛋白。
在某些实施方案中，组合物可被描述为通常包含生理上可接受的 缓冲液。本领域技术人员公认：发现HEPES对本文所公开的甲病毒组 合物具有意外的稳定效果。此外，本领域技术人员公认：将盐浓度调 整至接近生理水平(例如，生理盐水或0.15M总盐)对于肠胃外施用组 合物以预防注射部位的细胞损伤和/或疼痛可能是最佳的。本领域技术 人员将认识到当碳水化合物浓度增加时，可减少盐浓度以维持与制剂 等效的渗透性。在某些实施方案中，所考虑pH大于6.8至约pH10.0 的缓冲介质；一些减毒活病毒(例如甲病毒)在低pH下是不稳定的。
本文的一些减毒活病毒疫苗组合物涉及除了具有降低的免疫原性 或无-免疫原性外，增加减毒活病毒的稳定性和/或降低减毒活病毒退 化的组合物。
药物组合物
本文的实施方案提供以适合于药物体内施用的生物上相容的形式 将组合物施用于对象。“适合于体内施用的生物上相容的形式”意指待 被施用的活性剂(例如所述实施方案的减毒活病毒组合物)的形式，其 中所述活性剂的治疗效果超过任何毒性作用。施用的治疗组合物的治 疗活性量被定义为实现期望结果必需的剂量和时段处的有效量。例如， 化合物的治疗活性量可根据以下因素变化，如个体的疾病状态、年龄、 性别和体重以及制剂引起个体中期望应答的能力。可调整剂量方案 (regima)以提供最佳治疗反应。
在一些实施方案中，可以以便捷的方式施用组合物(例如实施方案 的药化蛋白质、肽)，所述方式如皮下、静脉内、经口施用、吸入、透 皮应用、阴道内应用、局部应用、鼻内或直肠施用。在更具体的实施 方案中，化合物可经口或皮下施用。在另一个实施方案中，化合物可 静脉内施用。在一个实施方案中，化合物可经鼻内施用，如吸入。
可以以适当的载体或稀释剂与组合物共施用的方式将化合物施用 于对象。如本文所使用的术语“药学上可接受的载体”意图包括诸如 生理盐水和缓冲水溶液的稀释剂。活性剂也可肠胃外或腹膜内施用。 也可在甘油、液体聚乙二醇和其混合物以及在油中制备分散液。在储 存和使用的普通条件下，这些制备剂可含有防腐剂以防止微生物生长。
可通过本领域已知的方法来施用适合于注射使用的药物组合物。 例如，可使用无菌水溶液(在这里为水溶性的)或分散液和无菌粉剂用 于临时制备无菌可注射溶液或分散液。在所有情况下，组合物是无菌 的并且可具有容易注射的流动性的程度。它可进一步对抗诸如细菌和 真菌的微生物的污染作用而保存。药学上可接受的载体可为含有例如， 水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适 的混合物的溶剂或分散介质。例如，可通过使用包衣(如卵磷脂)、在 分散的情况下通过维持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维 持适当的流动性。
可通过将某些量的活性化合物与适当的溶剂或根据需要与上述所 枚举的成分中的一种或组合合并，随后灭菌来制备无菌可注射溶液。
当配制时，可以以与剂型相容的方式和以治疗有效的量施用溶液。 所述制剂以多种剂量形式容易地施用，如上文所述的可注射溶液的类 型。预期也可利用缓释胶囊、定时释放微粒等施用本文的组合物。这 些具体的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在一 些实施方案中，本文所公开的制剂可在暴露于本发明的甲病毒之前、 期间和/或之后施用。
在另一个实施方案中，鼻用溶液或喷雾、气溶胶或吸入剂可被用 于递送感兴趣的化合物。适合于其他施用模式的另外的制剂包括栓剂 和子宫托。也可使用直肠子宫托或栓剂。
口服制剂包含诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖 精钠、纤维素、碳酸镁等通常利用的赋形剂。在某些实施方案中，口 服药物组合物可包含惰性稀释剂或可吸收食用的载体、或可被包封在 硬壳或软壳胶囊内、或可被压缩成片剂、或可直接地与饮食食物合并。 对于口服治疗施用，可将活性化合物与赋形剂合并并且以以下形式使 用：可消化的片剂、经颊片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、 粉片等。这样的组合物和制备剂应含有至少0.1％的活性化合物。当然， 可改变组合物和制备剂的百分比，其可便利地在约2％-约75％的单位 重量之间，或优选在25-60％之间。在这样的治疗有用的组合物中活性 化合物的量为可获得合适剂量的量。
试剂盒
进一步的实施方案涉及供本文所述的方法和组合物使用的试剂 盒。可在试剂盒中提供组合物和活病毒制剂。试剂盒也可包括合适的 容器、本文所详述的减毒活病毒组合物以及任选地一种或多种另外的 药剂，如其他抗病毒剂、抗真菌剂或抗细菌剂。
试剂盒还可包括在有此需要的对象中使用的适当地分为小份的组 合物。此外，本文的组合物可为部分或全部脱水或水化的。本文所考 虑的试剂盒可根据具体的制剂储存在本文所公开的室温或冷藏温度 中。
所述试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、 注射器或其他容器装置，可将组合物置于容器装置中，并且优选为适 当地分为小份的。当提供另外的组分时，试剂盒通常还含有一个或多 个另外的容器，可将该药剂或组分置于该容器中。本文的试剂盒通常 还包括含有药剂、组合物以及用于商业销售的严格限制的任何其他试 剂容器的装置。这样的容器可包括保存期望小瓶的注射或吹塑成型的 塑料容器。
实施例
包括以下实施例来说明本文所呈现的某些实施方案。本领域的技 术人员应了解，以下实施例中所公开的技术代表在本文所公开的实践 中发现的运行良好的技术，并且因此可被认为构成用于其实施的优选 模式。然而，鉴于本公开，本领域技术人员应了解，可在所公开的具 体实施方案中做出许多变化并且依然获得相同或相似的结果而不背离 本文的精神和范围。
实施例1
缓冲液筛选
在某些示例性方法中，确定了适于临床前和临床试验以及甲病毒 疫苗使用的液体组合物和可冻干组合物。关于根据这些示例性组合物 的液体组合物的一种考虑为一些甲病毒为pH敏感的(例如对低的pH 敏感)。因此，本文所公开的组合物的组分包括仔细考虑的pH因素。 在某些示例性组合物中，制剂的pH为约pH6-约10，其中许多制剂的 pH为大约pH6.5-7.5以及至多约9.5。
在一些方法中，减毒的基孔肯雅病毒(下文称CHIK)被用作临床前 和临床试验中的甲病毒组合物的实例。
提供了用于这些方法的组合物。在一个示例性实验中，预定量的 CHIK-IRES疫苗(pMVS)，在这里该减毒病毒受IRES插入的控制。任 何减毒甲病毒可被用于这些示例性组合物中以增加组合物的稳定性并 降低退化。最初，测试许多不同的碱性缓冲液如DMEM、PBS、HEPES 等。
进行某些测试，如在37℃下孵育至多21个小时以测试减毒病毒 制剂的稳定性。取样以在具有Vero细胞的96孔板中通过TCID50滴定 存在的感染病毒。计算与输入(未孵育)的疫苗对照相比剩余病毒的百 分比。在含有单独的PBS、20％DMEM或DMEM缓冲右旋糖的组合 物中105TCID50的CHIK病毒疫苗的孵育表明效能的快速损失。发现 某些示例性组合物对稳定减毒甲病毒如CHIK病毒疫苗是有效的，例 如，含有不同浓度的HEPES缓冲液(4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙磺酸)(数据 未显示)的组合物，如约1-约30mMHEPES的组合物。在一个实施 例中，与对照相比，发现含有150mMNaCl和15mMHEPES(HEPES 缓冲盐水-HS)的组合物为减毒甲病毒疫苗提供增加的稳定性(图1)。
图1和2表示说明在37℃下于不同组合物中孵育～21个小时后剩 余的减毒甲病毒，CHIKV疫苗的效能(显示为在指定时段后剩余的总 病毒的百分比)的示例性直方图。与其他缓冲组合物相比，含有不同浓 度的HEPES的组合物明显地增加CHIK疫苗的稳定性(20％-55％相对 于少于10％，数据未显示)。在图1中，与其他组合物相比，含有15mM HEPES+150mMNaCl或15mMHEPES的组合物对疫苗稳定性和效能 显示出显著影响。
实施例2
在一些其他示例性方法中，基于观察结果：包括一种或多种碳水 化合物对CHIK疫苗稳定性具有积极影响，进行4℃下的长期稳定性 实验以分析不同碳水化合物(例如糖)对甲病毒疫苗(例如CHIK病毒疫 苗)稳定性的影响。生成含有HEPES和碳水化合物的组合物，所述碳 水化合物为如蔗糖、乳糖、海藻糖、半乳糖、果糖、D-山梨醇、右旋 糖和D-甘露醇)。在这些组合物中配制各小份预定浓度的CHIK-IRES 疫苗(pMVS)，并且在4℃下孵育12周。在图2所显示的时间点收集 样品并且滴定Vero细胞。如图2所显示的，约15％海藻糖、15％蔗糖 或10％D-甘露醇与HEPES缓冲盐水(HB)组合的组合物对病毒稳定性 表现出与其他组合物约等同、优于其他组合物的改善。
在某些示例性方法中，检验包含蔗糖或海藻糖的制剂关于增加甲 病毒疫苗和其他制剂的稳定性的性能。在某些方法中，在存在或不存 在蛋白质时，将105TCID50的CHIK病毒疫苗在室温37℃下于HEPES 缓冲液(HB)与递增浓度的蔗糖或海藻糖的不同组合物中孵育，并且分 析至多21个小时的稳定性。如在图3的直方图中所显示的，含有 HEPES缓冲液与5％蔗糖(被称为HBS)或HEPES缓冲液与15％海藻糖 的组合物比HEPES缓冲液和人血清白蛋白或其他碳水化合物浓度的 组合物更稳定。
图2为表明含有HEPES缓冲盐水和不同碳水化合物的液体甲病毒 组合物、CHIKV疫苗组合物在4℃下12周内稳定性的示例性曲线图。 图2表示显示在存在或不存在0.1％HSA时在含有HEPES缓冲液+150 mMNaCl和不同浓度的碳水化合物，例如蔗糖或海藻糖的组合物中于 4℃孵育数周后剩余的总病毒的百分比的示例性直方图。
实施例3
蛋白质诱导的稳定性制剂的筛选
在其他示例性方法中，与对照(无蛋白或具有不利的其他蛋白)相 比，分析不同的蛋白剂用于增加甲病毒制剂的稳定性。分析含有HB 或HBS与目标蛋白剂的组合物。在每种实验条件约105的减毒CHIK 疫苗组合物孵育(37℃保持～21小时)后，取等分试样并通过TCID50滴 定在Vero细胞中的生长。然后，评估剩余病毒滴度的百分比。如图4 中所显示的，将明胶加入到含有或没有碳水化合物的制剂中增加甲病 毒疫苗在37℃的稳定性(参见图4)。
图4表示显示在37℃下于含有HEPES缓冲盐水和蛋白质(如乳铁 蛋白、胰化蛋白胨、乳白蛋白和明胶)的组合物中孵育～21个小时后剩 余的CHIK病毒滴度的总百分比的示例性直方图。在所有测试的组合 物之中，含有明胶和HB缓冲液的组合物表明通过降低甲病毒在室温 的退化来增加对疫苗稳定性的稳定性。当组合物中包含诸如蔗糖的碳 水化合物时，观察到的效果超过添加剂。
与储存在含有单独的FBS或PBS的培养基中的疫苗相比，观察到 甲病毒疫苗的稳定性明显增加。产生十分稳定的病毒疫苗的一种示例 性制剂被确定为HEPES缓冲液、蔗糖和明胶形成。制剂中包含重组明 胶极大地减少了该甲病毒疫苗的不稳定性。
实施例4
长期稳定性研究
在一些示例性方法中，分析明胶的浓度范围以确定明胶的哪个浓 度对甲病毒组合物具有最好的稳定性能。在一个方法中，选择两种浓 度的明胶用于与HBS(HBS+0.5％明胶和HBS+l％明胶)组合用于某些 组合物中。然后，用含有明胶和HBS的组合物进行评价液体CHIK疫 苗在4℃或-80℃下的长期稳定性研究(表1)。下面提供这些组合物的 实例。
示例性组合物：
1.HB-HEPES缓冲盐水(15mMHEPES和150mMNaCl)
2.HBS-HEPES缓冲盐水+5％蔗糖
3.HSG(0.5％明胶)-HEPES缓冲盐水+5％蔗糖和0.5％明胶
4.HSG(1％明胶)-HEPES缓冲盐水+5％蔗糖和1％明胶
表1：长期稳定性实验设计
周 0 1 3 4 8 12 24 36 4℃ x x x x x x x x -80℃ x x x x x x x x
将在这些组合物中配制的疫苗样品以500μl体积储存在1.5mL MCT中。将每种制剂的15个样品储存在4℃(微气候室；型号# MCB-12-33-33-H/AC)，以及15个样品储存在-80℃(Thermo；型号# ULT2186-6-D43)。
在表1和图5-6所显示的时间点取样用于效能评价。平行分析4℃ 下孵育的样品(图5)与-80℃下孵育的样品(图6)来表明36周内滴度的 趋势。如在图5的曲线图中所显示的，在这些组合物中配制的疫苗在 4℃下高达12周具有明显降低的滴度损失。孵育24周后，观察到病 毒滴度损失1log10TCID50或更高。加入明胶对甲病毒疫苗制剂(减毒 CHIK)的稳定性表现出明显的积极效果。甲病毒组合物在-80℃下于研 究期间内所测试的所有组合物中是稳定的(图6)。
实施例4
冻干制剂
在另一个示例性方法中，评价冻干的减毒甲病毒制剂(例如CHIK 疫苗制剂)的长期稳定性。冻干的疫苗制剂储存在4℃(图7)或-80℃(图 8)。将在指定时间点所取的样品复溶并且通过TCID50滴定Vero细胞。 配制在HSG(0.5％和1％明胶)中的示例性减毒CHIK疫苗显示在4℃ 下超过80周的病毒滴度损失最小而HB或HBS组合物24周后病毒滴 度损失约1个log10TCID50(图7)。CHIK疫苗在-80℃下于80周及更 长的时期内所测试的所有组合物中是十分稳定的(图8)。
在一种其他示例性方法中，比较不同来源的明胶关于稳定CHIK 疫苗的能力。在包括Sigma、Merck、Tekni和Gelita的任何生产商之 间观察到没有差异(图9)。
图5-6表示表明储存在含有HB、HBS或HSG的组合物中的液体 减毒甲病毒疫苗制剂(例如CHIKV)在4℃(图5)或在-80℃(图6)至多 80-90周增加的稳定性的示例性曲线图。图7-8表示表明冻干在含有 HB、HBS或HSG的组合物中的CHIKV疫苗在4℃(图7)或在-80℃ 下(图8)至多80-90周的效能的示例性曲线图。
图9提供比较来自不同来源的明胶对稳定CHIK疫苗的影响的示 例性直方图。
图10表示比较来自不同来源的明胶对冻融(F-T)处理后的CHIK 疫苗稳定性的影响的示例性直方图。CHIK疫苗组合物包括具有0.5％ 明胶的HEPES(HS)缓冲液。测试来自五种不同来源的明胶，其来源包 括Sigma、Merck、Tekni、Gelita和Nitta。将CHIK疫苗组合物暴露 于1(IX)轮、3(3X)轮或5(5X)轮F-T处理。在不同来源的明胶之中观察 到没有显著差异。因此，该数据支持任何来源的明胶(例如能够被引入 对象中，如药物级明胶)可被用于本制剂中以增加本文所公开的组合物 中的减毒活病毒的稳定性。
图11显示与液体培养相比，比较来自不同来源的明胶对冻干后的 CHIK疫苗稳定性的影响的示例性直方图。CHIK疫苗组合物包含具有 0.5％或1.0％明胶的HEPES(HS)缓冲液。测试来自Merck和 Nitta(beMatrix)的明胶。来自Merck和Nitta的明胶之间观察到没有显 著差异。两种CHIK疫苗组合物产生稳定的冻干饼，与液体制剂相比， 冻干饼复溶后会保留显著的滴度。
表2缩写列表
CHIKV 基孔肯雅病毒 TCID50 50％组织培养感染剂量 HB Hepes缓冲盐水 HBS Hepes缓冲盐水+蔗糖 HSG Hepes缓冲盐水+蔗糖+明胶 IRES 内部核糖体进入位点 DMEM 达尔伯克改良必需基本培养基 MCT 微量离心管 PBS 磷酸盐缓冲盐水 FBS 胎牛血清 Pre-MVS 前主病毒种子
材料和方法
将各小份预定剂量的CHIK-IRES疫苗(pre-MVS)配制在含有缓 冲液的组合物中，所述缓冲液包含Hepes缓冲盐水(HB)、含有蔗糖的 Hepes缓冲盐水(HBS)、含有蔗糖和不同浓度明胶(例如0.5％和1％明 胶)的Hepes缓冲盐水(HSG)。将配制的水化或液体疫苗孵育在某些温 度下，如室温37℃、冷藏4℃或急速冻结-80℃。在预定间隔下从这 些制剂中取样，并且在例如具有Vero细胞的96孔板中通过TCID50滴 定存在的感染病毒。
细胞系和组织培养
制备来源于申请人的cGMP工作细胞库的研究级Vero细胞库来进 行这些实验。获得Vero细胞：Vero(WHO)工作细胞库传代：142 (lot#INV-VERO-WCB-001；5x106)，并且储存在液氮中。将小瓶在水 浴中快速地解冻，直接地接种至T-75cm2培养瓶中含有青霉素-链霉素、 40mML-谷氨酰胺和10％FBS的约19ml预热的cDMEM(达尔伯克改 良必需基本培养基)中并在37℃，5％CO2孵育。使细胞生长至汇合， 并使用PBS、胰蛋白酶(HyClone，例如，cat#SH30042.01)和cDMEM-10 传代培养。将该培养瓶扩增到两个T-185cm2培养瓶中并且生长直至细 胞达到100％汇合。通过胰蛋白酶消化收 获细胞，在800xg下离心10分钟，并且在含有20％FBS和10％DMSO 的DMEM中以浓度为1x107个细胞/mL进行重悬。将这些细胞(总共 20mL)等分至冷冻管(20x1mL)并且标记：VeroWHOWCB p#142-2(Waisman)(WWCB)1mL1x107个细胞/mL，2012年1月13日 LV并且储存在液氮中。
使VeroWWCBIWHO细胞生长并维持在含有青霉素-链霉素和 10％FBS(HyClone)的达尔伯克改良必需基本培养基(DMEM)中 (DMEM-10％-FBS)。胰蛋白酶被用来维持细胞。病毒吸附前两天，在 每孔100μLDMEM-FBS-10％中用1.4x105个细胞/mL对96孔板接种。 每天监测培养箱以维持指定温度。用cDMEM-FBS2％进行病毒稀释、 吸附和TCID50测定。
CHIK减毒病毒
在所描述的多种方法中所使用的CHIK疫苗的分子生成被指定为 CHIK-002(之前所描述的)。CHIK疫苗在Vero细胞中生成并繁殖。将 浓度为105TCID50/mL的前主病毒种子储备用于这些实验。简言之， 感染单层Vero细胞后生成CHIKpre-MVS。疫苗-病毒分泌至上清液， 纯化/去除死的Vero细胞后从培养基中收获病毒。CHIK-pre-MVS在含 有10％FBS的DMEM中是稳定的，并且储存在-80℃。
测定方法
TCID50测定方法被用于定量疫苗制备剂中存在的感染病毒的量 (效能或稳定性)。TCID50被定义为病毒的稀释水平，在该稀释水平下 96孔板中半数连续复制的受感染细胞显示出如由例如CPE(细胞病变 效应)所证明的病毒感染性迹象。使Vero细胞(WWCBIWHO)生长并维 持在含有青霉素-链霉素、L-谷氨酰胺和10％FBS(HyClone)的达尔伯 克改良必需基本培养基(DMEM)(DMEM10％-FBS)中。将等分的配制 样品在水浴中快速地解冻并且混合。将pre-MVS最初稀释为工作浓度 并在96孔板中用例如cDMEM-2％FBS对这些样品进行10倍系列稀 释。在接种单层Vero细胞之前将稀释的病毒维持在4℃下。在测定时， 将生长培养基从96孔板吸走，并将100μL每个病毒稀释物加入到孔 中。将板在37℃和5％CO2下孵育3-5天。使用Spearman-Karber方 法计算滴度。
疫苗制剂
用包含研究级疫苗制备剂的疫苗以及从Inviragen得到的 CHIK-IRESpMVS准备稳定性实验。为了筛选赋形剂以及使用本文所 提供的多种组合物进行稳定性研究，制备了最终体积为500μL的疫苗 制剂，其每个样品含有105TCID50/mL病毒。在指定的缓冲液/制剂中 大批制备样品并且在开始研究之前取走输入样品作为初始滴度的量 度。将样品等分至MCT中并在指定时间和温度储存。制备了最终体 积为500μL的四种制剂中的每一种，每个样品含有105TCID50/mL病 毒。每种制剂大批制备60个样品并且在它们被等分至1.5mLMCT(含 有500μL)之前取出输入样品。
配制的疫苗储存
将疫苗制剂储存在4℃(微气候室；型号#MCB-12-33-33-H/AC) 和-80℃(REVCOElitePlus；型号#ULT2186-6-D43)。用Dickson Wizard2-900MHZLogger(型号#WT-220用于4℃和WT-240用于 -80℃)监测两种系统。
根据本公开，可完成和执行本文所公开和所要求保护的所有组合 物和方法而无需过多实验。虽然根据优选的实施方案已描述组合物和 方法，对本领域技术人员显而易见的是适用于组合物和方法以及本文 所描述的方法的步骤和步骤的顺序中的变化没有脱离本文的概念、精 神和范围。更具体地说，化学上和生理上相关的某些药剂可替代本文 所述的药剂同时实现相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见 的所有这样相似的取代和修饰被认为在由所附的权利要求所定义的精 神、范围和概念内。