技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及绿原酸在制备治疗绒毛膜癌的药物中的用途。
技术背景
妊娠滋养细胞肿瘤是由妊娠滋养细胞异常发育及增殖所致，是一组罕见的滋养叶组织疾病，可以看作是起源于浸润母体(胞衣)组织受孕的同种异体移植物，具有独特的形态学和临床生物学行为，主要包括侵袭性葡萄胎、绒癌及胎盘部位滋养细胞肿瘤，其中绒癌具有极强的侵袭力和广泛转移性，早期即可发生血道转移而危及患者生命。临床上多采用化疗为主，手术为辅的方式进行治疗，但仍有部分高危转移患者出现耐药和复发，对这类患者的治疗一直是滋养细胞肿瘤的一大难题。近年来，高靶向性的生物免疫治疗成为肿瘤免疫研究的新热点，并且应用于肿瘤的治疗。
绿原酸(chlorogenic acid CGA)又名咖啡鞣酸，是由咖啡酸(caffeic acid CA)和奎尼酸(quinic acid QA)组成的缩酚酸，其化学名为3-o-咖啡酰奎尼酸(3-o-caffeoylquinic acid CGA)。绿原酸是植物在进行有氧呼吸的过程中，经磷酸戊糖途径中间产物合成的一种苯丙素类物质。绿原酸已经被开放应用于食品，保健品，化妆品和药品等多个领域。由于它广泛的存在于常见的各种蔬菜水果中，具有多种生物活性，如:心血管保护作用、抗氧化作用、抗紫外及抗辐射作用、抗诱变及抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作用、降脂降糖作用、免疫调节作用等。在医药化工和食品等领域都具有广泛的应用。现已经报道的绿原酸有多种药理作用，但在治疗绒毛膜癌方面还鲜有报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了绿原酸的一种新用途，具体为绿原酸在制备治疗绒毛膜癌的药物中的用途。
作为可选方式，在上述用途中，所述药物是以CTLA-4为靶点预防和治疗绒毛膜癌。细胞免疫在机体对恶性肿瘤的免疫应答中发挥重要作用，而细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的存在会与T细胞表面协同刺激分子受体(CD28)竞争性地与抗原呈递细胞表面协同刺激分子(B7)结合，从而抑制T细胞的激活，下调或终止T细胞反应，阻碍肿瘤的生物免疫治疗效果。因此，CTLA-4被认为是抑制机体抗肿瘤的免疫因子。发明人通过大量实验发现绿原酸有利于阻断或减轻CTLA-4对T细胞免疫活性的抑制作用，从而刺激免疫细 胞的大量增殖，从而增强机体对肿瘤的免疫反应。
本发明还提供了一种用于治疗绒毛膜癌的药物，其活性成分包括有效量的绿原酸。
作为可选方式，所述药物是以CTLA-4为靶点预防和治疗绒毛膜癌。
作为可选方式，所述的药物是以绿原酸为有效成分，加入一种或多种药学上可接受的药用赋形剂制备而成的制剂。
作为可选方式，所述的药物中每制剂单位含有绿原酸1～1000mg。
作为可选方式，所述的药物为口服制剂或注射制剂。
作为可选方式，所述的药物是绿原酸占药物总质量的1-100％的口服制剂或注射剂。
作为可选方式，所述的药物口服制剂是片剂、胶囊剂、散剂、冲剂、颗粒剂。
作为可选方式，所述的药物注射制剂是粉针剂、注射液。
本发明还提供了一种绿原酸与其他常用药物在制备治疗绒毛膜癌的联合用药物中的用途。进一步的所述其他常用药物为其他抗肿瘤类药物(如5-氟尿嘧啶)或\和免疫应答促进类药物.。
作为可选方式，所述绿原酸与其他常用药物的剂量配比为1:5～2:1。
作为可选方式，所述免疫应答促进类药物是指能够促进或激活细胞免疫应答机制的药物或免疫因子，如白介素12、白介素2、γ干扰素中的一种或几种。
本发明还提供了一种治疗绒毛膜癌的联合用药物，其活性成分包括有效量的绿原酸与其他常用药物。
作为可选方式，所述的联合用药物是以绿原酸和其他常用药物为有效成分，加入一种或多种药学上可接受的药用赋形剂制备而成的制剂。
作为可选方式，所述绿原酸与其他常用药物的质量比为1:5～2:1。
联合用药是指为了达到治疗目的而采用的两种或两种以上药物同时或先后应用。本发明绿原酸与免疫应答促进类药物联合用于治疗绒毛膜癌的效应为相互促进的，绿原酸本身既具有抑制肿瘤的作用，同时又对机体无害，且可以提高机体免疫力、改善机体造血功能和肝肾功能；而且绿原酸能够阻断或减轻CTLA-4对T细胞免疫活性的抑制作用，从而刺激免疫细胞的大量增殖，从而增强机体对肿瘤的免疫反应，提高免疫应答促进类药物的疗效，具有良好的临床应用前景。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果：
本发明采用绿原酸作为活性成分制成的药物，用于治疗绒毛膜癌。绿原酸本身既具有抑制肿瘤的作用，同时又对机体无害，且可以提高机体免疫力、改善机体造血功能和肝肾功能；而且绿原酸能够阻断或减轻CTLA-4对T细胞免疫活性的抑制作用，从而刺激免疫细胞的大量增殖，从而增强机体对肿瘤的免疫反应。绿原酸通过两条途径阻断或减轻CTLA-4对T细胞免疫活性的抑制作用：1.作用于CTLA-4的靶基因，阻断CTLA-4的表达，减少体内CTLA-4的表达；2.直接作用于CTLA-4，使其失去活性。
附图说明：
图1为实施例1中各实验组细胞增殖情况的柱状图；
图2为实施例2中各实验组细胞增殖情况的柱状图；
图3为实施例3中各实验组T细胞活性的柱状图；
图4为实施例4中各实验组抑瘤率的柱状图。
具体实施方式：
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1绿原酸以CTLA-4为作用靶点抑瘤效果模拟实验
细胞培养
绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞生长在含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基(添加2mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每3三天换液一次。当细胞长满70％～80％左右，以0.25％的胰酶和0.02％EDTA混合液按1:3比例传代。
MTT比色法测定细胞增殖
取指数生长期的JEG-3细胞按初始浓度为3×104/ml接种于96孔板，分6组分别为对照组、IL-12组、CTLA-4+IL-12组、0.01μM绿原酸+CTLA-4+IL-12组、0.1μM绿原酸+CTLA-4+IL-12组和1μM绿原酸+CTLA-4+IL-12组37℃、5％CO2培养箱中培养48h后换成 无血清培养基使其继续饥饿同步化24h；然后分别给予5ng/ml的IL-12、5ng/ml的CTLA-4和各剂量的绿原对JEG-3细胞进行外源性干预(各实验组的具体干预方式见表1)，36h终止培养并收获细胞，对照组不做外源性干预，每组设5个平行孔。弃去孔内培养基，温和PBS洗2遍，每孔加入180μL培养基，20μL 5ng/ml的MTT溶液，轻振培养板，再放回培养箱继续培养4h后小心吸净上清。每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，使紫蓝色结晶完全溶解。混匀后在酶标仪492nm波长处检测各孔的OD值。
统计学处理
采用SPSS 11.5统计软件包进行统计学分析。数据均采用均数±标准差(-x±s)表示，采用单因素方差分析对数据进行处理，两两比较时采用SNK-q检验。以0.05为显著性检验水准。
结果
MTT结果显示：5ng/ml的IL-12、5ng/ml的CTLA-4和各剂量的绿原对JEG-3细胞进行作用36h后，IL-12能明显的抑制JEG-3细胞的增殖；CTLA-4能抑制IL-12的活性，CTLA-4+IL-12共同作用36h后，与对照组相比较，JEG-3细胞的增殖没有得到有效的抑制；绿原酸+CTLA-4+IL-12组，JEG-3细胞的增殖得到了明显的抑制，并且抑制的程度与绿原酸的给药量呈剂量依赖关系(表1、图1)。
表1.IL-12、CTLA-4和绿原酸对JEG-3细胞增殖的影响
实施例2对JEG-3绒毛膜癌细胞增殖的影响
细胞培养
绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞生长在含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基(添加2mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每3三天换液一次。当细胞长满70％～80％左右，以0.25％的胰酶和0.02％EDTA混合液按1:3比例传代。
MTT比色法测定细胞增殖
取指数生长期的JEG-3细胞按初始浓度为3×104/ml接种于96孔板，分5组分别为对照组、IL-12组、绿原酸0.01μM、0.1μM、1μM组37℃、5％CO2培养箱中培养48h后换 成无血清培养基使其继续饥饿同步化24h；然后分别按表2所述的分组情况及相应剂量加入IL-12(5ng/mL)或绿原酸对JEG-3细胞进行外源性干预，36h终止培养并收获细胞，对照组不做外源性干预，每组设5个平行孔。弃去孔内培养基，温和PBS洗2遍，每孔加入180μL培养基，20μL 5ng/ml的MTT溶液，轻振培养板，再放回培养箱继续培养4h后小心吸净上清。每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，使紫蓝色结晶完全溶解。混匀后在酶标仪492nm波长处检测各孔的OD值。
统计学处理
采用SPSS 11.5统计软件包进行统计学分析。数据均采用均数±标准差(-x±s)表示，采用单因素方差分析对数据进行处理，两两比较时采用SNK-q检验。以0.05为显著性检验水准。
结果
结果表明，绿原酸能够有效的抑制绒毛膜癌细胞的增殖，抑制效果呈现出剂量依赖关系，并且抑制效果优于IL-12(如表2、图2所示)。
表2.绿原酸对JEG-3细胞增殖的影响
实施例3绿原酸抑制CTLA-4的活性
CTLA-4的抑制作用机理是通过介导活化的T细胞发生细胞凋亡实现的。研究者发现CTLA-4可介导不依赖Fas途径的T细胞凋亡。活化的T细胞凋亡后，效应T细胞数量减少，分泌的细胞因子随之减少，机体的免疫功能自然受到抑制。
小鼠CTLA-4模型，选用BALB/c小鼠，雄性，18-22g。一次性注射CTLA-430mg/kg剂量，14天后评估模型建立的情况。模型建立成功后次日动物随机分组，称重，并开始给药。绿原酸注射液(根据给药剂量将绿原酸溶于生理盐水制成具有不同浓度的一系列绿原酸腹腔注射液)给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml，每日1次，连续给药13天，实验动物共分4组，对照组(按与其他实验组相同的给药体积腹腔注射生理盐水)与绿原酸5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg用药三个剂量组。每组20只动物。
于给绿原酸的第3、6、9、14天在无菌条件下取小鼠的脾脏，加适量的Hank’s液研磨，以200目细胞筛滤过，1500r/m离心5分钟，弃上清，加Hank’s液重复洗涤2次。收集脾 细胞，加适量的RPMI1640培养液混悬，以0.4％的台盼兰拒染色法计数，活细胞数不小于95％，加RPMI1640完全培养液稀释，并调整细胞浓度至1x107个/ml。于96孔微量板中，每孔加100μL脾细胞悬液和等体积的ConA溶液(终浓度为5μg/ml)、LPS溶液(终浓度为10μg/ml)或RPMI1640培养液，重复3孔。另设空白对照组。然后，再在37℃、5％CO2培养4小时后，各孔加入50μl MTT溶液(2mg/ml)，继续培养4小时。然后，再1000r/m离心5分钟，弃去各孔上清，分别加入150μl酸性DMSO溶液，振荡，于室温暗处放15分钟，以酶标仪于波长578nm处测定OD值。
结果
结果表明，能够有效的抑制CTLA-4的活性从而提高机体T细胞的活性，并且呈现出剂量依赖的关系，其中20mg/kg的剂量为最有效的剂量(如表3、图3所示)。
表3.绿原酸对T细胞活性的影响
注：与对照组相比，*p<0.005。
实施例4绿原酸治疗绒毛膜癌小鼠抑瘤率研究
动物模型的建立
小鼠绒毛膜癌JEG-3模型，选用BALB/c小鼠，雄性，18-22g。绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞生长在含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基(添加2mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每3三天换液一次。取指数生长期的JEG-3细胞配制浓度为3×104/ml细胞液，每只小鼠腋背部接种0.2ml瘤液。接种后次日动物随机分组，称重，并开始给药。绿原酸注射液(根据给药剂量将绿原酸溶于生理盐水制成具有不同浓度的一系列绿原酸腹腔注射液)给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml，每日1次，连续给药13天，IL-12隔日给药，给药剂量为25μg/kg。实验动物共分5组，对照组、IL-12给药组与绿原酸5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg用药三个剂量组。每组20只动物。绿原酸停药后次日处死动物，称体重，剥瘤并称瘤重。根据肿瘤 重量计算肿瘤抑制率(％)。体重及瘤重用均值±标准差(x±SD)表示。
结果
腹腔注射给予荷瘤小鼠绿原酸对绒毛膜癌JEG-3的生长有明显的抑制作用，且呈一定的剂量效应关系，绿原酸20mg/kg抑瘤率与IL-12抑瘤率相近。绿原酸与IL-12联合用药的情况下，显著的提高IL-12的抑瘤率。在所用剂量下，绿原酸对动物体重无明显影响(见表4、图4)。
表4.绿原酸对绒毛膜癌JEG-3的抗肿瘤作用
注：与对照组相比较，***P<0.005。
实施例5
以绿原酸为有效成分，加入一种或多种药学上可接受的药用赋形剂制备成口服制剂、注射制剂或外用透皮给药制剂等不同剂型的药物。控制所得药物中每制剂单位绿原酸含量为1～1000mg。
按照实施例4中所述的实验方法进行绿原酸治疗绒毛膜癌小鼠抑瘤率研究。所不同的是：分别将绿原酸的给药方式改为肌肉注射、静脉注射、透皮给药和灌喂四种方式进行实验。结果显示：在上述四种给药方式下绿原酸对绒毛膜癌JEG-3的生长均具有明显的抑制作用。在实施例4中分别用白介素12和5-氟尿嘧啶与绿原酸进行联合用药，结果显示绿原酸与白介素12、5-氟尿嘧啶均能相互协同抑制小鼠绒毛膜癌组织的生长，且协同作用显著。
实施例6：用绿原酸制备冻干粉针剂
1.绿原酸的提取：
本实施例中所用的绿原酸原料药，系由金银花中提取、纯化得到，纯度为99.52％。
2.绿原酸冻干粉针剂的制备
2.1处方：
将以上处方完全溶解于注射用水中，过滤后，再用0.22μm的除菌微孔滤膜精滤，调节pH后，按照无菌粉针剂的常规操作共制成2ml粉针剂1000支，每支含绿原酸40mg。
实施例7：用绿原酸制备丸剂
1.绿原酸的提取
本实施例中所使用的绿原酸，系由杜仲叶中提取、纯化得到的，纯度为98.33％。
2.绿原酸丸剂的制备
2.1处方
2.2.制法：
取适量的聚维酮K30，用无水乙醇配制成溶液，再取处方量的绿原酸和淀粉，采用等量稀释法混合均匀之后，加入聚维酮K30的乙醇溶液中，充分搅拌后制得软材，采用搓丸法制得绿原酸丸剂1000粒，每粒丸剂含绿原酸1mg。
实施例8：用绿原酸制备口服溶液剂
1.绿原酸的提取
本实施例中所使用的绿原酸，系由牛蒡叶中提取、纯化得到，纯度为99.04％。
1.绿原酸口服溶液剂的制备
2.1处方
2.2制法
取处方量的绿原酸和亚硫酸氢钠，溶解于10L注射用水中，按照口服液的常规制备工艺，过滤后，无菌灌装成1000支口服液，每支口服液为10mL，含绿原酸200mg。
实施例9：用绿原酸制备片剂
1.绿原酸的提取：
本实施例中所使用的绿原酸，系由金银花中提取、纯化得到，纯度为98.37％。
2.绿原酸片剂的制备
2.1处方：
2.2制法：
本实施例采用制湿颗粒压片法制备绿原酸片剂。(1)按处方量取羟丙甲纤维素制成水溶液；(2)取处方量的绿原酸、淀粉和乳糖混合均匀后，加入羟丙甲纤维素水溶液，充分搅拌均匀后制成软材；(3)将制备好的软材按常规的湿法制粒的操作规程，过筛、干燥和整粒后得到大小均一的颗粒；(4)将制得的颗粒与硬脂酸镁混合均匀后压片，共制成1000片剂，每片含绿原酸100mg。
实施例10：用绿原酸制备胶囊剂
1.绿原酸的提取：
本实施例中所使用的绿原酸，系由杜仲叶中提取、纯化得到的，纯度为99.25％。
2.绿原酸胶囊剂的制备：
2.1处方：
2.2制法：
取处方量的绿原酸和糖粉，混合均匀，加入80％乙醇溶液制成软材，干燥，整粒后按照胶囊剂的常规制备工艺制备2000粒胶囊，每粒胶囊含绿原酸50mg。
实施例11：用绿原酸制备颗粒剂
1.绿原酸的提取
本实施例中所使用的绿原酸，系由杜仲叶中提取、纯化得到的，纯度为98.74％。
2.绿原酸颗粒剂的制备
2.1处方：
2.2制法：
取聚维酮K30，加入注射用水，制成溶液。取处方量的绿原酸、甘露醇和蔗糖混合均匀之后，加入聚维酮K30溶液，制成软材。按照颗粒剂的常规制备工艺，对软材进行过筛、干燥和整粒之后，得到颗粒剂。在无菌条件下分装颗粒剂，制备400袋颗粒剂，每袋颗粒剂含绿原酸500mg。
实施例12：用绿原酸制备散剂
2.绿原酸的提取：
本实施例所用的绿原酸原料药，系由牛蒡叶中提取、纯化得到的，纯度为98.82％。
2.绿原酸散剂的制备：
2.1处方
纯度为98.82％的绿原酸1000g
2.2制法
取处方量绿原酸过筛后，按照散剂的常规制备工艺，无菌分装成含1000瓶/袋散剂，每瓶/袋散剂含绿原酸1000mg。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领 域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。