技术领域
本发明属生物医学类技术领域，涉及Wip1抑制剂CCT007093在制备治 疗肝再生不足疾病药物中的应用。
背景技术
肝脏是人体中具有最强再生能力的组织器官，然而在许多急慢性肝病 中，仍然会出现肝细胞再生抑制导致再生不足，严重影响健康甚至生命。 如肥胖相关的非酒精性脂肪肝再生能力受到损害，更易受到酒精及病毒的 作用而出现肝硬化，原位移植物为脂肪肝时，由于肝再生受到抑制，移植 病人存活率降低；再生障碍性和爆发性肝衰竭病人由于缺乏有效的肝再生 而导致死亡；肝细胞增殖能力下降导致酒精性肝炎病人死亡率上升；肝再 生抑制是老龄化人群肝脏的典型表征，由此导致的>65岁人群肝病死亡率 占人群死亡率比例是<45岁人群的4-5倍。此外，肝硬化肝癌更是对人类 健康产生严重威胁的致死性疾病，在我国仅因慢性肝炎导致肝硬化致死的 病人每年就有28万，肝脏移植为晚期肝硬化和肝癌唯一的治疗手段，对肝 脏同种异体移植物需求的增长速度远远大于实际的供体数，致使等待肝移 植的人数增加，肝脏先天具备再生能力使得将小体积移植物应用于肝脏移 植。然而临床经验显示，移植时严重失代偿的受体往往在围手术期死亡率 明显升高，这种病人的不良结果提示，其中一些过程是抑制再生造成的。 因此，寻找有效的促进肝再生药物成为以上临床急慢性肝脏病人的需要。
肝脏再生调控是一个复杂的多分子参与过程，为了阐明这种复杂过程 的调节机制，科研人员最常用的模型为小鼠三分之二肝切除术及小鼠肝脏 毒性损伤。作为唯一能够观察哺乳动物体内细胞进程的模型，小鼠三分之 二肝脏切除术被研究人员认为是最为实用的再生模型，在肝再生研究中使 用也最为广泛。综合肝再生机制研究发现肝脏的再生主要由三大部分调节 网络构成，即细胞因子调控网络，生长因子调控网络和代谢调控网络。TNF α、IL-6等细胞因子第一时间参与肝脏再生的启动调控；肝素结合性表皮 生长因子(heparin-binding EGF-like growth factor)，双调蛋白 (amphiregulin)等生长因子紧随其后促进肝脏再生的进行，mTOR-PS6K 信号通路主导了代谢通路调控。
Wip1(Wild-type p53-induced phosphatase)是一种核蛋白，为丝 氨酸/苏氨酸特异蛋白磷酸酶2C型家族中的一员，由PPM1D(protein phosphatase magnesium-dependent 1delta)基因编码。作为一个磷酸酶， Wip1基因于1997年被发现，它的发现及命名都依赖于大名鼎鼎的原癌基 因P53，这和它的功能--抑制P53蛋白的磷酸化相关。随后Wip1大量下游 蛋白相继发现，如P38,ARF,ATR,CHK1,ATM,CHK2,MDM2,UNG2,NFκ B,γH2X。在许多人类癌症，如乳腺癌、卵巢透明细胞腺癌、成神经细胞 瘤、髓母细胞瘤、胃癌、胰腺癌中均检测到Wip1DNA和RNA的过表达， 而敲除PPM1D基因的小鼠能够抵抗乳腺癌的发生，提示Wip1基因是一个致 癌基因。Wip1在生理病理中的作用越来越受到科研人员的关注。近年来人 们在小鼠中研究发现敲除Wip1基因可通过ATM-mTOR信号通路影响细胞自 嗜功能有效抑制动脉粥样硬化的形成，在其癌症功能领域研究亦发现其可 调控DNA甲基化参与癌症生成的调节。鉴于Wip1敲除小鼠可正常出生并发 育，科研工作者将Wip1作为癌症和动脉粥样硬化的药物靶点。但在肝脏组 织中，Wip1的作用尚不知晓。
Wip1抑制剂CCT007093为小分子化合物，CAS number 176957-55-4, 分子量272.38518，化学命名为2,5-bis -(2-Thienylidene)cyclopentanone,，分子式为C15H12OS2,化学结构如下：
2008年在对高表达Wip1肿瘤细胞的小分子化合物筛选中被发现，其可特 异性杀死高表达Wip1蛋白的肿瘤细胞如乳腺癌细胞，卵巢透明细胞癌细 胞。但其在体内是否具有Wip1磷酸酶抑制效果尚未有文献报道。
在本项专利中，我们首次发现CCT007093在肝再生相关疾病中的应用。 具体的，本专利发现CCT007093在体内可发挥抑制Wip1去磷酸化的作用, 加速肝脏再生，降低大部分切肝术后死亡率，同时并未引起再生肝脏组织 及再生肝脏中炎症细胞的改变。本项专利亦揭示了其用于肝再生相关疾病 的作用机制。CCT007093在肝脏再生过程中抑制Wip1蛋白的去磷酸化作用， Wip1以mTOR为靶蛋白抑制肝脏损伤后再生。本项专利亦首次揭示mTOR为 Wip1的靶蛋白。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提出了Wip1抑制剂CCT007093在制备 治疗肝再生不足疾病药物中的应用。
本发明以70﹪切肝术建立小鼠肝再生模型，小鼠肝脏可在11天恢复 切肝前比重，符合肝再生表现，造模成功。我们发现抑制Wip1基因表达可 促进肝脏组织再生。抑制Wip1基因表达激活了mTOR-PS6K-PS6信号通路， 促进细胞增殖。进一步实验表明Wip1蛋白可直接去磷酸化mTOR。本发明 首次揭示mTOR为Wip1磷酸酶靶点。同时我们发现在体内给予Wip1抑制剂 CCT007093可起相同的实验效果，并且CCT007093可提高大部分切肝术后 小鼠的生存率。以上实验结果揭示了CCT007093在促进肝脏再生中的作用 及机理。
CCT007093的有效用量为3.2mg/kg，药物配成溶剂，以腹腔注射方式 给药。该剂量可促进小鼠70﹪肝切除术后肝再生并显著提高80﹪肝切除术 后小鼠存活率。
本发明的有益效果是CCT007093能够促进肝脏组织再生，在肝脏组织 大部分丢失时降低死亡率。CCT007093可促进肝脏细胞增殖，增加再生肝 脏比重。CCT007093通过直接激活mTOR信号通路促进细胞增殖。本发明揭 露了CCT007093可用于制备治疗肝脏再生不足相关疾病的药物，以及 CCT007093用于促进肝脏再生的作用机制。
附图说明
图1为Wip1基因敲除可增加再生肝脏比重；
图2为Wip1基因敲除可增加BRDU标记再生肝细胞数目；
图3为Wip1基因敲除可增加再生肝脏细胞有丝分裂指数；
图4为Wip1基因敲除可增加再生肝脏中增殖细胞核蛋白抗原 (Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)表达水平；
图5为Wip1基因敲除可增加再生肝脏中细胞周期蛋白cyclin D蛋白表达 水平；
图6为Wip1基因敲除激活再生肝脏中蛋白合成通路和脂肪酸调控通路；
图7为Wip1基因敲除激活再生肝脏中mTOR-P70S6K信号通路；
图8为mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin；Rapa)可逆转Wip1基因敲除 小鼠中再生肝脏比重增加表型；
图9为mTOR抑制剂雷帕霉素可逆转Wip1基因敲除小鼠再生肝脏中PCNA表 达增高表型；
图10为饥饿后给胰岛素刺激可激活HT293细胞内mTOR蛋白活性(磷酸化 mTOR表达升高)；
图11为在激活mTOR蛋白的细胞内转染Wip1cDNA可降低细胞内mTOR信号 通路活性(磷酸化mTOR及其下游磷酸化PS6蛋白的表达)
图12为Wip1和mTOR蛋白可直接相互结合，Wip1和PS6K蛋白不存在相互 结合；
图13为体外磷酸酶实验证实Wip1去磷酸化mTOR Ser2448,Ser2481两个 位点，且该去磷酸化作用可被Wip1抑制剂CCT007093抑制；
图14为CCT007093在小鼠体内抑制Wip1去磷酸化作用剂量实验设计图； 图15为以磷酸化p53蛋白的表达为检测指标，检测三种实验设计摸索 CCT007093在小鼠体内腹腔注射抑制Wip1蛋白磷酸化实验；
图16为CCT007093在小鼠体内可激活mTOR信号通路(Ser2448, Ser2481,Ser2159三个mTOR磷酸化位点及下游蛋白磷酸化P70S6K(T389), 磷酸化S6(Ser235/236)蛋白的表达)；
图17为CCT007093在293T细胞系激活mTOR信号通路剂量效应关系；对照 组(DMSO)，25μM CCT组，50μM CCT组,随着CCT剂量的增加，mTOR信号 通路(Ser2448,Ser2481,Ser2159三个mTOR磷酸化位点及下游蛋白磷酸 化P70S6K(T389),磷酸化S6(Ser235/236)蛋白的表达)越来越高；
图18为CCT007093可提高再生肝脏比重；
图19为CCT007093可增加再生肝脏中PCNA表达水平；
图20为CCT007093可提高大部分切肝术后小鼠的存活率；
图21为大部分切肝术后小鼠的存活率与肝比重存在相关性；
图22为腹腔注射CCT007093并未引发小鼠白细胞亚群(中性粒细胞，淋巴 细胞，单核细胞)的绝对数目改变；
图23为腹腔注射CCT007093并未引发小鼠白细胞亚群(中性粒细胞，淋巴 细胞，单核细胞)的比例改变；
图24为腹腔注射CCT007093并未引发小鼠大部分切肝术后肝组织结构的病 理改变；
图25为腹腔注射CCT007093并未引发小鼠大部分切肝术后肝组织细胞凋 亡。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，而非限定本发明。
本发明使用的Wip1敲除(Wip1-/-)小鼠为Lawrence A.Donehower教 授赠送，p21和p53敲除小鼠来自Karl Lenhard Rudolph教授实验室。Wip1 敲除小鼠分别与p21,p53敲除小鼠交配产生Wip1/p21，Wip1/p53双基因 敲除小鼠。清洁级C57BL/6小鼠购自Jackson Lab,饲养于杭州师范大学实 验动物中心清洁级动物房，实验时小鼠为6-8周龄。在整个体内实验过程 中，所有操作均遵守国家及杭州师范大学伦理委员会制定的《实验动物使 用条例》。雷帕霉素购自美国LC Laboratories；二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine, BRDU),CCT007093,BRDU抗体，β-肌动蛋白(β-actin)抗体等从美国 Sigma-Aldrich公司购买；HT293细胞细胞株由杭州师范大学衰老研究所干 细胞实验室常规保存；质粒pCMV6-AC-GFP-PPM1D购自美国Origene公司。 本发明中所使用的所有抗体，除特别说明，均购自美国Cell Signaling Technology公司。所有实验结果均是由独立的三次重复实验得到，采用不 配对的t检验分析数据，均用士SEM表示。P值<0.05为显著性差异标准 (*<0.05，**<0.01)。
实施例一：Wip1基因敲除可促进小鼠肝脏再生
对Wip1基因敲除和同窝对照野生型小鼠实施70﹪肝切除手术，检测 并分析比较手术后不同时间点肝比重、增殖细胞数量、增殖细胞核抗原 (PCNA)表达及细胞周期蛋白Cyclin D的表达，分析Wip1对肝再生的作 用。结果表明，Wip1-/-小鼠肝切除术后肝比重,肝脏增殖细胞,细胞增殖相 关蛋白较Wip1+/+组显著增加。Wip1-/-组小鼠术后肝重占原肝重比值显著高 于Wip1+/+组(每个时间点n≥12)(图1)。免疫组化显示术后Wip1-/-和Wip1+/+组BrdU阳性细胞，Wip-/-组小鼠术后BrdU阳性细胞数占细胞总数比值在36h 显著高于Wip1+/+组(图2)。HE染色显示术后有丝分裂细胞,Wip1-/-组小鼠 术后有丝分裂细胞数占细胞总数比值在36h,48h显著高于Wip1+/+组(图3)。 Western blot图显示肝切除术后各时间点PCNA，Cyclin D蛋白表达，Wip1-/-组小鼠PCNA蛋白表达量在24h,48h显著高于Wip1+/+组(图4)。Wip-/-组小 鼠Cyclin D蛋白表达量在36h,48h，72h显著高于Wip1+/+组(图5)。
以上结果表明Wip1缺失可通过增加进入增殖周期细胞数量加速肝组 织再生。
实施例二：mTOR信号通路是Wip1促进肝再生的靶点
1.部分切肝术后肝再生过程中，mTOR信号通路在Wip1-/-组小鼠中高表 达。
为进一步探讨Wip1基因缺失促进肝脏再生的分子机制，我们对Wip-/-组和Wip1+/+组小鼠70﹪肝脏切除术后24和36小时的再生肝组织进行基因 芯片分析，对差异蛋白高表达进行信号通路分析，结果表明Wip-/-组小鼠蛋 白和脂肪酸代谢信号通路显著高于Wip1+/+组(图6)。根据文献(1.Espeillac, C.,et al.,S6kinase 1is required for rapamycin-sensitive liver proliferation after mouse hepatectomy.J Clin Invest,2011.121(7): p.2821-32.2.Goggin,M.M.,et al.,Rapamycin-sensitive induction of eukaryotic initiation factor 4F in regenerating mouse liver. Hepatology,2004.40(3):p.537-44.)报道，部分切肝术后mTOR信号 通路为调控代谢的主要通路。我们对部分肝脏切除术后Wip1-/-和Wip1+/+组 小鼠再生肝组织进行中的mTOR信号通路蛋白进行western blot分析发现， 磷酸化mTOR及其下游蛋白磷酸化p70S6K蛋白表达在Wip1-/-组显著高于 Wip1+/+组，表明在肝再生过程中mTOR信号通路在Wip-/-组显著活跃于Wip1+/+组(图7)。
2.mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)可逆转Wip1-/-组小鼠在部分肝 脏切除术后肝再生加速表型
在部分切肝术前2小时开始对Wip1-/-组小鼠腹腔注射雷帕霉素2.5 mg/kg/d，部分肝切除术后36小时牺牲小鼠，取出再生肝组织，称重，结 果发现，雷帕霉素注射后Wip1-/-组和Wip1+/+组小鼠再生肝重比体重较注射 前均显著下降，且两组小鼠下降至同一水平(图8)。对再生肝组织进行 Western blot检测，发现雷帕霉素注射后PCNA蛋白在Wip1-/-组和Wip1+/+组表达均显著下调，且下调后的PCNA蛋白表达在Wip1-/-组和Wip1+/+组无显 著差异(图9)。以上结果提示Wip1-/-组小鼠部分肝切除术后再生加速依赖 于mTOR信号通路。
3.Wip1蛋白可与mTOR蛋白特异性结合并直接去磷酸化mTOR蛋白。
对HT293细胞进行无血清培养16小时，随后加入10﹪血清和100nM胰 岛素37℃培养10分钟，可检测到磷酸化mTOR蛋白(ser2448,ser2481) 高表达(图10)。在该细胞中过表达Wip1cDNA可显著降低磷酸化mTOR及 其下游蛋白磷酸化S6(Ser235/236)表达水平(图11)。Wip1蛋白分别和 mTOR蛋白、p70S6K蛋白进行免疫共沉淀，发现Wip1蛋白可直接结合mTOR 蛋白并不与p70S6K蛋白进行直接结合(图12)。
为进一步确认Wip1蛋白是否可以直接去磷酸化mTOR蛋白，我们进行 了体外磷酸酶实验，具体如下，裂解过表达mTOR蛋白的细胞，使用mTOR 蛋白抗体和免疫磁珠纯化磷酸化mTOR蛋白，加入过表达Wip1cDNA细胞的 裂解液，进行Western blot分析，发现磷酸化mTOR蛋白表达显著下降。 加入Wip1抑制剂CCT007093后该抑制作用可被逆转(图13)。以上结果提 示Wip1蛋白可直接去磷酸化mTOR蛋白。
实施例三：Wip1抑制剂CCT007093可促进肝再生，并显著改善大部分 切肝术后小鼠的生存率
1.CCT007093可在体内发挥Wip1抑制剂效果
CCT007093在DMSO中稀释为2.5mg/ml，分不同剂量和次数对进行70 ﹪切肝术的野生型C57小鼠进行腹腔注射(图14)，收集术后36小时再生 肝脏组织，Western blot分析Wip1经典下游蛋白磷酸化p53的表达检测 CCT007093抑制效果，结果发现CCT007093在使用3.2mg/kg的注射剂量， 四次注射的情况下可达到对Wip1的最佳抑制效果(图15)。
2.CCT007093可激活mTOR信号通路
对野生型小鼠四次注射3.2mg/kg的CCT007093，并进行70﹪切肝术， 收集术后36小时再生肝组织，Western blot检测mTOR信号通路蛋白表达 水平，发现CCT007093可显著升高磷酸化mTOR(ser2448,ser2481,ser2159) 及其下游蛋白磷酸化p70S6K(T389),磷酸化S6(Ser235/236)的表达(图 16)。
在HT293细胞中通过血清饥饿实验激活mTOR信号通路，随后分别加入 25μM和50μM CCT007093，结果发现磷酸化mTOR(ser2448,ser2481,ser2159) 及其下游蛋白磷酸化p70S6K(T389),磷酸化S6(Ser235/236)的表达水平 随着CCT007093剂量的升高而升高。该实验结果提示CCT007093的加入与 mTOR信号通路的表达存在剂量效应关系(图17)。
3.CCT007093可加速70﹪切肝术后小鼠肝组织再生
对野生型小鼠四次注射3.2mg/kg的CCT007093，并进行70﹪切肝术， 术后36小时牺牲小鼠，取出再生肝组织，称重，结果发现，CCT007093注 射后小鼠再生肝重比体重较注射前均显著升高(图18)。对再生肝组织进 行Western blot检测，发现CCT007093注射后PCNA蛋白表达显著升高(图 19)。以上结果提示CCT007093注射可加速小鼠部分肝切除术后再生。
4.CCT007093可降低大部分切肝术后小鼠的死亡率
对野生型小鼠进行80﹪切肝术，并在术前12小时注射3.2mg/kg的 CCT00709312小时每次，记录CCT007093组及对照组小鼠死亡时间，统计 发现，CCT007093可显著延长80﹪切肝术后小鼠存活时间(图20)，并且 小鼠存活时间延长与小鼠肝重之间存在相关性(图21)。以上结果提示 CCT007093可通过加速大部分切肝术后小鼠肝组织再生改善小鼠术后生存 率。
实施例四：Wip1抑制剂CCT007093腹腔注射并未在体内引起免疫细胞 改变，破坏肝组织结构或引起细胞凋亡等不良反应
CCT007093组及对照组小鼠取血，抗凝，全自动血细胞计数仪进行血 细胞计数分析小鼠体内白细胞，发现白细胞中中性粒细胞，单核细胞，嗜 酸性粒细胞的绝对数目(图22)和比例(图23)均无改变。对大部分切肝 术24，48小时后小鼠的肝组织进行固定，包埋，石蜡切片，HE染色发现， CCT007093组小鼠肝组织结构正常(图24)。对大部分切肝术24小时后小 鼠的肝组织进行固定，包埋，石蜡切片，TUNEL染色分析细胞凋亡情况发 现CCT007093组小鼠肝组织细胞并未出现细胞凋亡及坏死(图25)。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例， 只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。