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1、(10)授权公告号 CN 101213941 B (45)授权公告日 2011.01.12 CN 101213941 B *CN101213941B* (21)申请号 200810058044.4 (22)申请日 2008.01.18 A01H 4/00(2006.01) A01N 3/00(2006.01) C12N 5/04(2006.01) (73)专利权人 中国科学院昆明植物研究所 地址 650204 云南省昆明市蓝黑路 132 号 (72)发明人 龙春林 程治英 罗吉凤 (74)专利代理机构 云南协立专利事务所 53108 代理人 马晓青 CN 1631109 A,2005.06.2。
2、9, 全文 . CN 1656884 A,2005.08.24, 全文 . CN 1402971 A,2003.03.19, 全文 . 罗吉凤， 等 . 铁皮石斛快速繁殖和离体种质 保存的研究 . 广西植物 26 1.2006,26(1),69- 73. (54) 发明名称 石斛属的快繁与离体保存方法 (57) 摘要 石斛属的快繁与离体保存方法 ： (1) 取石斛 属果实内种子或茎尖或带腋芽的幼茎， 果实在纯 乙醇中沾一下， 然后在酒精灯火焰上燃烧然后取 出种子用于接种 ； 茎尖或幼茎在 70乙醇中浸一 下， 投入 0.2升汞 8min， 无菌水冲洗干净后接 种在培养基中， 待种子萌发长成原球。
3、茎或茎尖和 幼茎长成拟原球茎， 进行继代培养大量增殖， 然 后将原球茎或拟原球茎放在分化芽的培养基上， 待芽条高 2-3cm 时转入生根培养基， 长成具根和 4-5 片叶的试管苗 ； (2) 将步骤 (1) 中所说的试管 苗， 在培养基为 1/2MS+NAA1mg.L-1+S2， 温度为 15-20中进行离体保存。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王霞 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 10 页 CN 101213941 B1/2 页 2 1. 石斛属的快繁与离体保存方法， 其特征在于 ： (1) 取石斛属果实内种子或茎尖或带。
4、腋芽的幼茎， 果实在纯乙醇中沾一下， 然后在酒 精灯火焰上燃烧然后取出种子用于接种 ； 茎尖或幼茎在 70乙醇中浸一下， 投入 0.2升 汞 8min， 无菌水冲洗干净后接种在培养基中， 待种子萌发成原球茎或茎尖和幼茎长成拟原 球茎， 进行继代培养大量增殖， 然后将原球茎或拟原球茎放在分化芽的培养基上， 待芽条高 2-3cm 时转入生根培养基， 长成具根和 4-5 片叶的试管苗 ； (2) 将步骤 (1) 中所述的试管苗在培养基为 1/2MS+NAA1mg.L-1+S2， 温度为 15-20 中进行离体保存。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (1) 中所述试管苗的培育。
5、方法为 ： 取 野外采集或杂交授粉所结的果实， 完整的果实在酒精灯燃烧灭菌后， 在无菌条件下将果皮 打开， 将种子播种在花宝 1 号 N P K 7 6 193g.L-1的琼脂培养基上 ； 开裂果， 用尼龙布包裹散落种子， 在 0.2 HgCl2中消毒 6-8min， 无菌水冲洗干净后播种在花宝 1 号 N P K 7 6 193g.L-1的琼脂培养基上 ； 未成熟的果内种子播种在花宝 1 号 3g.L-1+NAA1mg.L-1的琼脂培养基上， 培养室温度 252， 光照强度为 1500-2000Lx， 光照 12h/d， 培养基 pH 为 5， 培养 8-12 天种子由黄色转绿， 呈球形增大。
6、， 基部有丝状毛的原球茎， 继代培养在 1/2MS+NAA1mg.L-1+ 土豆泥 3 + 香蕉泥 15的琼脂培养基上， 30 天后， 分化出 1cm 小芽和 0.5cm 丛芽， 又经过 1-2 个月的培养可得到高 2-3cm 芽条， 转入 1/2MS+NAA1mg. L-1+ 土豆泥 3 + 香蕉泥 15的生根壮苗培养基培养 1 个月后加强光照至 4000Lx 以上， 培 养一个月， 长成具根和 4-5 片叶试管苗。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (1) 中所述试管苗的培育方法为 ： 将 野外采集到的石斛属茎尖或带腋芽的幼茎切段灭菌后接种在 1/2MS+NAA1m。
7、g.L-1+ 土豆泥 3 + 香蕉泥 15的琼脂培养基上， 培养室温度保持为 252， 光照强度为 1500-2000Lx， 光照 12h/d， 培养基 pH 为 5， 培养 30-60 天， 腋芽处可抽生新枝， 新枝可切割重复培养， 茎尖 抽生新枝短呈丛芽状， 在上述培养基上继续培养， 长成完整试管苗 ； 也可接种在 1/2MS 或 1/2MS+BA0.5mg.L-1+NAA0.2mg.L-1的琼脂培养基上， 外植体基部可分化出大量拟原球茎， 拟 原球茎在1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3+香蕉泥15的琼脂培养基上培养30天后， 分化出 1cm小芽和0.5cm丛芽， 又经过1-2个月。
8、的培养可得到高2-3cm芽条， 再转入1/2MS+NAA1mg. L-1+ 土豆泥 3 + 香蕉泥 15的生根壮苗培养基培养 1 个月， 此时光照加强至 4000Lx， 长成 具根和 4-5 片叶试管苗。 4. 如权利要求 1 或 2 或 3 所述的方法， 其特征在于所述石斛属种优选长苏石斛 Dendrobium brymerianum 或球花石斛 D.chysiflorum 或鼓槌石斛 D.chrysotoxume 或 铁 皮 石 斛 D.candidum 或 金 钗 石 斛 杂 种 选 系 D.phalaenosis D.nobile 或 短 棒 石 斛 D.capillipes 或 兜 。
9、唇 石 斛 D.aphyllum 或 束 花 石 斛 D.chrysanthum 或 玫 瑰 石 斛 D.crepidatum 或叠鞘石斛 D.aurantiacum var.deuneanum 或密花石斛 D.densiflorum 流 苏石斛 D.fimbriatum 或棒节石斛 D.findlayanum 美花石斛 D.loddigesii 或金钗石斛 D.aobile 或长距石斛 D.longicorum 或报春石斛 D.primulinum 或大苞鞘石斛 D.wardianum 或霍山石斛 D.huoshanense 或齿瓣石斛 D.devonianum 或矮石斛 D.bellatu。
10、lum 或串珠石斛 D.falooneri或疏花石斛D.henryi或细茎石斛D.moniliforme或黑毛石斛D.williamsonii 或喉红石斛 D.christyanum 或晶帽石斛 D.crystallimun 或杯鞘石斛 D.gratiotissimum 权 利 要 求 书 CN 101213941 B2/2 页 3 或小黄花石斛 D.jenkinsii 或苏唇石斛 D.harveyanum 或梳唇石斛 D.strongylanthum 或 尖刀唇石斛 D.heterocarpum 或喇叭唇石斛 D.lieniflorum 或翅梗石斛 D.trigonopus 或 草石斛 D.。
11、compactum 或秋石斛 D.phalaenosis 或石斛属一种 Dendrobium.sp. 或叉唇石斛 D.stuposum 或勐海石斛 D.minutiflorum 或肿节石斛 D.pendulum。 权 利 要 求 书 CN 101213941 B1/10 页 4 石斛属的快繁与离体保存方法 0001 技术领域 ： 本发明涉及生物技术领域， 具体地， 涉及云南药用石斛培养物的快速繁 殖与离体保存技术。 0002 背景技术 ： 云南省是商品石斛主要产地之一， 种类多， 资源丰富 ( 全国 76 种， 云南 58 种， 占全国种类的 76.3 4)。据冯国祥等 1 报导石斛药材原植物。
12、包含石斛属植物 39 种， 金石属植物 2 种和石仙桃属植物 4 种。石斛类植物是常见名贵中药材 ( 具有滋阴清热， 生津益胃。润肺止咳。明目强身等功效 )。人们长期无限制， 掠夺性和毁灭性的采挖和近年 来大量层次的研究开发 ( 发现石斛属许多种还具有抗肿瘤、 抗衰老、 增强机体免疫力、 扩张 血管及抗血小板凝集等作用 )。再加上石斛属物种在自然界结实率低， 种子因无胚乳， 萌发 率 5以下。远不能满足目前国内外需求。我国和国际组织 (IUCN) 都明文规定， 石斛属为 禁止贸易的物种加以保护。 现有技术中未见有云南药用石斛快速繁殖与离体保存技术的报 道。 0003 发明内容 ： 本发明的目的。
13、在于提供一种云南药用石斛快速繁殖与离体保存方法， 本发明选择石斛属 40 种物种成功进行了快速繁殖和离体保存， 对挽救濒危的石斛类物种， 使之成为可再生药源， 为石斛类 GAP 种植提供数百万优良、 一致种苗的技术和室内离体保 存技术。这是目前保护和持续开发利用石斛类名贵中药的多、 快、 好、 省的对策。 0004 为了实现本发明的上述目的， 本发明提供了如下技术方案 ： 0005 石斛属的快繁与离体保存方法 ： 0006 (1) 取石斛属果实内种子或茎尖或带腋芽的幼茎， 果实在纯乙醇中沾一下， 然后在 酒精灯火焰上燃烧然后取出种子用于接种 ； 茎尖或幼茎在 70乙醇中浸一下， 投入 0.2 。
14、升汞 8min， 无菌水冲洗干净后接种在培养基中， 待种子萌发成原球茎或茎尖和幼茎长成拟 原球茎， 进行继代培养大量增殖， 然后将原球茎或拟原球茎放在分化芽的培养基上， 待芽条 高 2-3cm 时转入生根培养基， 长成具根和 4-5 片叶的试管苗 ； 0007 (2) 将步骤 (1) 中所述的试管苗在培养基为 1/2MS+NAA1mg.L-1+S2， 温度为 15-20中进行离体保存。 0008 具体地方法为 ： 0009 (1) 取野外采集或杂交授粉所结的果实， 完整的果实在酒精灯燃烧灭菌后， 在无 菌条件下将果皮打开， 将种子播种在花宝 1 号 (N P K 7 6 19)3g.L-1的琼。
15、脂培 养基上 ； 开裂果， 用尼龙布包裹散落种子， 在 0.2 HgCl2中消毒 6-8min， 无菌水冲洗干净 后播种在花宝 1 号 (N P K 7 6 19)3g.L-1的琼脂培养基上 ； 未成熟的果内种 子播种在花宝 1 号 3g.L-1+NAA1mg.L-1的琼脂培养基上， 培养室温度 252， 光照强度为 1500-2000Lx， 光照 12h/d， 培养基 pH 为 5， 培养 8-12 天种子由黄色转绿， 呈球形增大， 基部 有丝状毛的原球茎， 继代培养在1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3+香蕉泥15的琼脂培养基 上， 30天后， 分化出1cm小芽和0.5cm丛芽， 又。
16、经过1-2个月的培养可得到高2-3cm芽条， 转 入 1/2MS+NAA1mg.L-1+ 土豆泥 3 + 香蕉泥 15的生根壮苗培养基培养 1 个月后加强光照 至 4000Lx 以上， 培养一个月， 长成具根和 4-5 片叶试管苗 ； 0010 (2) 将步骤 (1) 中的试管苗， 在培养基为 1/2MS+NAA1mg.L-1+S2， 温度为 15-20 说 明 书 CN 101213941 B2/10 页 5 中进行离体保存。 0011 另一种具体的方法为 ： 0012 (1) 将 野 外 采 集 到 的 石 斛 属 茎 尖 或 带 腋 芽 的 幼 茎 切 段 灭 菌 后 接 种 在 1/2。
17、MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3+香蕉泥15的琼脂培养基上， 培养室温度保持为252， 光照强度为 1500-2000Lx， 光照 12h/d， 培养基 pH 为 5， 培养 30-60 天， 腋芽处可抽生新枝， 新枝可切割重复培养， 茎尖抽生新枝短呈丛芽状， 在上述培养基上继续培养， 长成完整试管 苗供移栽 ； 也可接种在 1/2MS 或 1/2MS+BA0.5mg.L-1+NAA0.2mg.L-1的琼脂培养基上， 外植体 基部可分化出大量拟原球茎， 拟原球茎在1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3+香蕉泥15的琼 脂培养基上培养 30 天后， 分化出 1cm 小芽和 0.5cm 丛。
18、芽， 又经过 1-2 个月的培养可得到高 2-3cm 芽条， 再转入 1/2MS+NAA1mg.L-1+ 土豆泥 3 + 香蕉泥 15的生根壮苗培养基培养 1 个月， 此时光照加强至 4000Lx， 长成具根和 4-5 片叶试管苗 ； 0013 (2) 将步骤 (1) 中的试管苗， 在培养基为 1/2MS+NAA1mg.L-1+S2， 温度为 15-20 中进行离体保存。 0014 上述方法中石斛属种类优选长苏石斛 Dendrobium brymerianum 或球花石斛 D.chysiflorum 或鼓槌石斛 D.chrysotoxume 或铁皮石斛 D.candidum 或金钗石斛杂种 选。
19、系 D.phalaenosis D.nobile 或短棒石斛 D.capillipes 或兜唇石斛 D.aphyllum 或 束花石斛 D.chrysanthum 或玫瑰石斛 D.crepidatum 或叠鞘石斛 D.aurantiacum var. deuneanum 或密花石斛 D.densiflorum 流苏石斛 D.fimbriatum 或棒节石斛 D.findlayanum 美 花 石 斛 D.loddigesii 或 金 钗 石 斛 D.aobile 或 长 距 石 斛 D.longicorum 或 报 春 石 斛 D.primulinum 或大苞鞘石斛 D.wardianum 或。
20、霍山石斛 D.huoshanense 或齿瓣石斛 D.devonianum或矮石斛D.bellatulum或串珠石斛D.falooneri或疏花石斛D.henryi或细 茎石斛 D.moniliforme 或黑毛石斛 D.williamsonii 或喉红石斛 D.christyanum 或晶帽石 斛 D.crystallimun 或杯鞘石斛 D.gratiotissimum 或小黄花石斛 D.jenkinsii 或苏唇石斛 D.harveyanum或梳唇石斛D.strongylanthum或尖刀唇石斛D.heterocarpum或喇叭唇石斛 D.lieniflorum 或翅梗石斛 D.trig。
21、onopus 或草石斛 D.compactum 或秋石斛 D.phalaenosis 或石斛属一种 Dendrobium.sp. 或叉唇石斛 D.stuposum 或勐海石斛 D.minutiflorum 或肿 节石斛 D.pendulum。 0015 具体实施方式 ： 0016 下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容， 但并不以此限定本发 明。 0017 实施例 1 ： 0018 一、 石斛经快速繁殖得石斛培养物 ： 0019 1 材料与方法 0020 1.1 供试材料 0021 1 长苏石斛 Dendrobium brymerianum 西双版纳 0022 2 球花石斛 D.c。
22、hysiflorum(2 个居群 ) 景洪、 昆明 0023 3 鼓槌石斛 D.chrysotoxume(4 个居群 ) 勐海、 保山、 思茅、 景洪 0024 4 铁皮石斛 D.candidum(9 个居群 ) 广南、 思茅、 文山 (3 个居群 ) 浙江、 盈江、 安 宁、 小哨 说 明 书 CN 101213941 B3/10 页 6 0025 5 金钗石斛杂种选系 D.phalaenosis D.nobile 0026 6 短棒石斛 D.capillipes(2 个居群 ) 西双版纳、 鲁甸 0027 7 兜唇石斛 D.aphyllum(2 个居群 ) 腾冲、 景洪 0028 8 束花。
23、石斛 D.chrysanthum(3 个居群 ) 丽江、 思茅、 景洪 0029 9 玫瑰石斛 D.crepidatum 文山 0030 10 叠鞘石斛 D.aurantiacum var.deuneanum(2 个居群 ) 昆明、 勐海 0031 11 密花石斛 D.densiflorum 0032 12 流苏石斛 D.fimbriatum(9 个居群 ) 缅甸、 越南、 高黎贡山、 西双版纳等 0033 13 棒节石斛 D.findlayanum(2 个居群 ) 景洪、 思茅 0034 14 美花石斛 D.loddigesii 0035 15 金钗石斛 D.aobile(8 个居群 ) 石。
24、屏、 景洪 (2 个居群 )、 勐腊、 保山、 兰坪、 勐 海、 昆明 0036 16 长距石斛 D.longicorum 0037 17 报春石斛 D.primulinum 0038 18 大苞鞘石斛 D.wardianum(2 个居群 ) 昆明、 景洪 0039 19 霍山石斛 D.huoshanense 0040 20 齿瓣石斛 D.devonianum(2 个居群 ) 屏边、 景洪 0041 21 矮石斛 D.bellatulum(2 个居群 ) 文山、 景洪 0042 22 串珠石斛 D.falooneri 0043 23 疏花石斛 D.henryi 0044 24 细茎石斛 D.m。
25、oniliforme(2 个居群 ) 高黎贡山、 丽江 0045 25 黑毛石斛 D.williamsonii 0046 26 喉红石斛 D.christyanum 昆明 0047 27 晶帽石斛 D.crystallimun(2 个居群 ) 腾冲、 景洪 0048 28 杯鞘石斛 D.gratiotissimum(3 个居群 ) 鲁甸、 景洪、 思茅 0049 29 小黄花石斛 D.jenkinsii(2 个居群 ) 文山、 景洪 0050 30 苏唇石斛 D.harveyanum 景洪 0051 31 梳唇石斛 D.strongylanthum 0052 32 尖刀唇石斛 D.hetero。
26、carpum(3 个居群 ) 昆明、 景洪、 思茅 0053 33 喇叭唇石斛 D.lieniflorum(2 个居群 ) 腾冲、 镇康 0054 34 翅梗石斛 D.trigonopus 0055 35 草石斛 D.compactum(2 个居群 ) 思茅、 腾冲 0056 36 秋石斛 D.phalaenosis(2 个居群 ) 泰国、 安宁 0057 37 石斛属一种 Dendrobium.sp. 麻栗坡 0058 38 叉唇石斛 D.stuposum 0059 39 勐海石斛 D.minutiflorum 0060 40 肿节石斛 D.pendulum 0061 1.2 方法 0062。
27、 培养室温度252， 保存室温度15-20， 光照强度为1500-2000Lx， 光照12h/d。 说 明 书 CN 101213941 B4/10 页 7 培养基随培养目的和不同发育阶段有所不同。培养基 pH 为 5。 0063 外植体来源于石斛属各种的果实内种子或茎尖， 果在纯乙醇中沾一下， 然后在酒 精灯火焰上烧后用于接种。茎尖或幼茎在 70乙醇中浸一下， 投入 0.2升汞 8min 左右， 无菌水冲洗干净后接种。 0064 2 结果 0065 2.1 组织培养和快速繁殖技术 0066 在我们收集保存的石斛属 40 个种中， 据查资料表明仅有 8 种发表过文章， 它们是 铁皮石斛、 美花。
28、石斛、 密花石斛和流苏石斛， 兜唇石斛， 金钗石斛， 霍山石斛和鼓槌石斛。而 32种是我们首次报导。 我们为了保持遗传性稳定和规模化生产目的采用了种子无菌培养和 茎尖、 茎节分生组织培养两种方式。 0067 2.1.1 种子无菌培养 0068 种子来源于野外采集和自己杂交授粉所结的果实。野外采集的开裂果， 收集种子 用尼龙布包裹， 在 0.2 HgCl2中消毒 7min， 无菌水冲洗干净后播种在花宝 1 号 (N P K 7619)3g.L-1的琼脂培养基上。 完整的果实在酒精灯燃烧灭菌后即可将果皮打开将 种子播种在上述培养基上。未成熟的果内种子可播种在花宝 1 号 3g.L-1+NAA1mg。
29、.L-1( 单位 下同 ) 的琼脂培养基上。石斛属种子大多呈黄色， 培养约 10 天左右即可转绿， 增大， 继而长 成顶端有叶尖或冒出的芽， 基部有丝状毛的原球茎， 显示种子萌发且萌发率较高 ( 达 95 以上 )。 0069 2.1.2 分生组织培养 0070 将野外采集到的石斛属茎尖或带腋芽的幼茎切段灭菌后接种在 1/2MS+NAA1mg. L-1+ 土豆泥 3 + 香蕉泥 15的琼脂培养基上， 培养 30 天左右， 胚芽处可抽生新枝， 新枝可 切割重复培养， 茎尖抽生新枝短呈丛芽状。 在此培养基上， 它们可长成完整试管苗， 供移栽。 0071 如果把茎尖和幼茎接种在 1/2MS 或 1/。
30、2MS+BA0.5mg.L-1+NAA0.2mg.L-1的琼脂培养 基上， 外植体基部可分化出大量拟原球茎。拟原球茎在 1/2MS+NAA1mg.L-1+ 土豆泥 3 + 香 蕉泥 15的琼脂培养基上， 也可以长成大苗供移栽。 0072 2.1.3 继代繁殖 0073 石斛属原球茎增殖速度 30 天至 60 天 ( 依种量 ) 平均可达 1 6-10 倍， 由 5 个人 组成的生产车间， 年产石斛试管苗可达 120 万。 0074 上一步骤原球茎和拟原球茎培养基30天左右， 可得到101cm小芽和100.5cm 丛芽， 又经过 1-2 个月的培养可得到高约 2-3cm 芽条 ( 占 50左右 。
31、)， 转入生根壮苗培养基 (1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3+香蕉泥15)， 培养1个月后加强光照(4000Lx及以上)， 培养一个月左右， 试管苗可达到移苗标准。整个生产周期 4.5 个月到 6 个月。 0075 2.1.4 试管苗移栽 0076 当试管苗至少4-5片伸展叶根系正常， 健康， 高度达6cm左右时， 即可出瓶供移栽， 出瓶时要小心不能折伤叶片和根尖， 清除根系上的琼脂， 3-5 株一丛种植， 种植基质有锯末、 树皮、 苔藓和陶粒等， 基质要用 20 1 的水甲醛密封消毒 24h 或用热蒸汽消毒。栽后放 在大棚内荫蔽度约70， 棚内温度控制在20-28， 注意保湿和排水。
32、。 待试管苗长出新根 或新叶后， 7-15 天用 1/10MS 液， 喷施一次， 促进幼苗生长， 和提前收护。依石斛属种类不同 一般 1-3 年均可收护。 说 明 书 CN 101213941 B5/10 页 8 0077 二、 取上述所得石斛培养物进行离体保存 ： 0078 选择石斛属种子萌发后产生胚性组织即原球茎或茎尖和茎基部形成的胚性组织， 拟原球茎， 丛芽和具根和 4-5 片叶试管苗 3 个发育阶段的材料， 在培养基为 1/2MS+NAA1mg. L-1+S2 .， 温度为 15-20中进行离体保存。 0079 1、 离体低温保存试验 ： 0080 石斛属植物大多分布在热带和亚热带， 。
33、本发明采用 15-20保存培养物， 延缓了生 长速度， 延长了继代周期。 0081 1.1 温度对培养物保存的影响 0082 本发明设计保存温度为 15-20， 对照为 252的培养物成活率下降到 80时 进行恢复培养来统计继代周期结果 ( 见表 1) 表明 ： 培养物成活率下降速度存在物种特异 性， 在15-20下铁皮石斛继代周期长达21个月。 而鼓槌石斛等才12个月。 低温(15-20) 下， 培养物继代周期比 252下培养物明显延长 1 倍以上或 1 倍。25 土 2下培养物半年 左右需继代 1 次。而低温下培养物 1 年至一年半以上才需要更新一次。 0083 表 1 温度对培养物保存的。
34、影响 说 明 书 CN 101213941 B6/10 页 9 0084 0085 附 ： 培养基为花宝 3g+NAA0.5mg.L-1+AC0.05 0086 1.2 石斛不同发育阶段保存效果比较 0087 选择石斛属种子萌发后产生胚性组织 ( 原球茎 ) 或茎尖和茎基部形成的胚性 组织， 拟原球茎， 丛芽和具根和 4-5 片叶试管苗 3 个发育阶段的材料做试验， 培养基为 1/2MS+NAA1mg.L-1+S2 . 结果见表 2。 0088 表 2 不同发育阶段材料保存效果比较 说 明 书 CN 101213941 B7/10 页 10 0089 0090 由表 2 可以看出 ： 15-2。
35、0下保存石斛属物种比对照延长继代周期， 原球茎和拟原 球茎发育阶段最有利于保存， 其次为完整试管苗。丛生芽阶段保存效果最差。 0091 1.3 不同培养基组合对离体保存的影响 0092 试验材料为原球茎， 保存在 15-20条件下， 由表 3 可以看出不同激素组合对石斛 属保存的培养物继代周期有影响。效果最好的培养基配方为 1/2MS+NAA1mg.L-1。另外石斛 属不同基因型也影响保存效果， 在试验条件下保存后继代周期超过 1 年半甚至 2 年的种有 铁皮石斛、 矮石斛、 球花石斛、 美花石斛、 喇叭唇石斛、 疏花石斛、 晶帽石斛、 大苞鞘石斛、 霍 山石斛、 兜唇石斛， 秋石斛等。 00。
36、93 表 3 不同培养基组合对离体保存的影响 0094 说 明 书 CN 101213941 B8/10 页 11 0095 说 明 书 CN 101213941 B9/10 页 12 0096 本发明具体的方法步骤可概括为 ： 0097 第一种 ： (1) 取野外采集或杂交授粉所结的石斛属果实， 完整的果实在酒精灯燃 烧灭菌后， 在无菌条件下将果皮打开， 将种子播种在花宝1号(NPK7619)3g. L-1的琼脂培养基上 ； 开裂果， 用尼龙布包裹散落种子， 在 0.2 HgCl2中消毒 6-8min， 无菌 水冲洗干净后播种在花宝 1 号 (N P K 7 6 19)3g.L-1的琼脂培养。
37、基上 ； 未成熟 的果内种子播种在花宝 1 号 3g.L-1+NAA1mg.L-1的琼脂培养基上， 培养室温度 25 土 2， 光 照强度为 1500-2000Lx， 光照 12h/d， 培养基 pH 为 5， 培养 8-12 天种子由黄色转绿， 呈球形 增大， 基部有丝状毛的原球茎， 继代培养在 1/2MS+NAA1mg.L-1+ 土豆泥 3 + 香蕉泥 15的 琼脂培养基上， 30 天后， 分化出 1cm 小芽和 0.5cm 丛芽， 又经过 1-2 个月的培养可得到高约 2-3cm 芽条， 转入 1/2MS+NAA1mg.L-1+ 土豆泥 3 + 香蕉泥 15的生根壮苗培养基培养 1 个 。
38、月后加强光照至 4000Lx 以上， 培养一个月， 长成具根和 4-5 片叶试管苗 ； 0098 (2) 选择石斛属培养物即 3 个不同发育阶段的培养材料也就是由石斛属种子萌 发后产生的胚性组织即原球茎或茎尖和茎基部形成的拟原球茎， 由原球茎或拟原球茎分 化产生的丛芽， 由丛芽分化产生的具根和 4-5 片叶的试管苗， 在培养基为 1/2MS+NAA1mg. L-1+S2， 温度为 15-20中进行离体保存。 0099 第二种 ： 将野外采集到的石斛属茎尖或带腋芽的幼茎切段灭菌后接种在 1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3+香蕉泥15的琼脂培养基上， 培养室温度保持为252， 光照强度为 。
39、1500-2000Lx， 光照 12h/d， 培养基 pH 为 5， 培养 30-60 天， 腋芽处可抽生新枝， 新枝可切割重复培养， 茎尖抽生新枝短呈丛芽状， 在上述培养基上继续培养， 长成完整试管 说 明 书 CN 101213941 B10/10 页 13 苗供移栽 ； 也可接种在 1/2MS 或 1/2MS+BA0.5mg.L-1+NAA0.2mg.L-1的琼脂培养基上， 外植体 基部可分化出大量拟原球茎， 拟原球茎在1/2MS+NAA1mg.L-1+土豆泥3+香蕉泥15的琼 脂培养基上培养 30 天后， 分化出 1cm 小芽和 0.5cm 丛芽， 又经过 1-2 个月的培养可得到高 。
40、2-3cm 芽条， 再转入 1/2MS+NAA1mg.L-1+ 土豆泥 3 + 香蕉泥 15的生根壮苗培养基培养 1 个月， 此时光照加强至 4000Lx， 长成具根和 4-5 片叶试管苗 ； 0100 (2) 选择石斛属培养物即 3 个不同发育阶段的培养材料也就是由石斛属种子萌 发后产生的胚性组织即原球茎或茎尖和茎基部形成的拟原球茎， 由原球茎或拟原球茎分 化产生的丛芽， 由丛芽分化产生的具根和 4-5 片叶的试管苗， 在培养基为 1/2MS+NAA1mg. L-1+S2， 温度为 15-20中进行离体保存。 0101 离体保存石斛属种质， 使之不易丢失， 便于交换和利用。本发明提供石斛属离。
41、体 库， 保存方法最有效和最安全， 保存材料恢复生长情况良好， 增值率可达 1 6-10 以上， 保 存成活率 80以上。然后根据种的特性和实验结果及时进行恢复性培养， 恢复培养物要在 252下过渡 15d 后， 又放回低温保存室。每隔半年或 8 个月检查一次污染 (5以上 ) 及 变异状况 (0.04以下 )。另外注意原球茎保存复壮， 方法是采用 1/2MS 或 1/2MS+ 土豆 3 较理想。种的遗传稳定性评价是一项重要工作， 一般一年检测一次或是在出库利用前 1 个 月进行。 检测方法有形态解剖结构比较， 细胞学检查， 分子技术， 化学成分分析等。 如果形态上有肉眼看得见的变异必须进行分子技术的检测。保存不是目的， 更重要是发挥 它们的经济和利用价值， 使石斛属种质资源保存和可持续利用相结合， 相促进， 共同发展。 说 明 书 。