蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN200810107052.3	申请日：	20080903
公开号：	CN101341854B	公开日：	20110831
当前法律状态：		有效性：	失效
法律详情：
IPC分类号：	A01H4/00,C12N5/04	主分类号：	A01H4/00,C12N5/04
申请人：	江西师范大学
发明人：	涂艺声,徐志祥,蔡险峰,张杨军
地址：	330022 江西省南昌市紫阳大道99号
优先权：	CN200810107052A
专利代理机构：	江西省专利事务所	代理人：	张静
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内容摘要

本发明公开了一种包括以下步骤：选择健壮无病虫害蜜橘结过果实的成年优株，取当年抽生20天以内的新枝为外植体；对外植体清洗消毒；外植体接种培养。腋芽启动培养基：MS或改良MS+6-BA0.1～0.6mg/L+Kt0.1～0.6mg/L+NAA0.01～0.1mg/L。改良MS+6-BA0.2～0.5mg/L+Kt0.04～0.4mg/L+Zt0.2～0.5mg/L+NAA0.01～0.05mg/L。本发明的培养方法及基质配方为蜜橘成年态茎节腋芽离体再生提供必需的环境条件。用本发明的方法进行南丰蜜橘的离体培养，可获得大量的再生芽。利用这样的柑橘离体再生芽既可作种质保存，又可进行试管嫁接培育大批量优质种苗。

权利要求书

1.一种蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，其特征在于：包括以下步骤：(1.1)选择健壮无病虫害蜜橘结过果实的成年优株，取当年抽生20天以内的新枝为外植体；(1.2)对外植体清洗消毒；(1.3)外植体接种在腋芽启动培养基上培养至腋芽生长点开始萌动，并在芽的基部四周出现黄绿色小凸点，继续在腋芽启动培养基上生长12～15天，此时主腋芽伸长迅速；腋芽启动培养基：MS或改良MS+6-BA0.1～0.6mg/L+Kt0.1～0.6mg/L+NAA0.01～0.1mg/L；改良MS培养基，大量元素、铁盐、微量元素三者与MS培养基中相同，改良MS含以下改良的有机成分：甘氨酸2.0mg/L，VB 1.0～2.0mg/L，VB 1.0～2.0mg/L，烟酸0.5～1.0mg/L，肌醇100mg/L，叶酸0.1～1.0mg/L，蔗糖40～55g/L；(1.4)培养30～40天时，将长出的腋芽从外植体上分割下来，接种到芽增殖培养基上诱导丛芽分化，培养30～40天，平均每个培养物分化出丛生芽4～6个，芽长2～3cm，芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.2～0.5mg/L+Kt0.04～0.4mg/L+NAA0.01～0.05mg/L；(1.5)分割继代，小芽成块继代培养，大芽切割成顶芽和茎节，接种到芽增殖培养基上继代培养，以后每30～40天转代一次，繁殖系数4～6；建成丛芽无性繁殖体系，繁殖的2cm以上芽可进行嫁接育苗，小苗作离体种质保存或继代扩繁。 2.根据权利要求1所述的蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，其特征在于：培养条件如下：(2.1)培养参数：恒温24±2℃，相对湿度60％～70％，光照强度为1000～1600lx，日照时长11～14小时/天；(2.2)技术参数：外植体污染率低于5％～10％；腋芽萌动诱导率75％～87％；芽丛生增殖系数4～6；继代周期30～40天。 3.根据权利要求1所述的蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，其特征在于：对外植体清洗消毒过程中先用偏酸性牙膏溶液浸洗杀菌，再用碱性洗衣粉液浸洗杀菌；最后用75％的乙醇溶液和0.1％～0.5％HgCl溶液消毒。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物生物技术，尤其涉及一种蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法。

背景技术

柑橘居世界百果生产之首，其果实营养丰富，色香味兼优，既可鲜食，又可加工果汁制品。南丰蜜橘是柑橘类宽皮橘中著名的优良品种。南丰蜜橘源出乳桔，又是乳桔中的精品，最突出特点在于皮薄金黄、酸甜适口、香气浓郁、汁多核少，誉为“橘中之王”驰名中外，它是我国特有的优良柑橘栽培品种。

蜜橘成年树茎器官离体腋芽丛生培养对快速繁殖优质种苗和种质离体保存具有重要作用，它能较好地保持品种的遗传稳定性。我国利用组织培养进行柑橘快速繁殖的研究工作较广泛，上世纪七十年代王大元报道后至今，有不少文献报告了柑橘科属的多种植物离体不定芽或丛芽的产生，但选用的外植体几乎大都是未渡越童期的组织，很少见成年态营养体组织培养再生芽的报道。原因有两点：一是成年结果柑橘树的枝茎外植体表面灭菌困难；二是成年态柑橘营养器官组织离体再分化难。而柑橘成年态茎段离体培养是柑橘优良品系工厂化育苗及其种质离体保存等的重要技术平台，必须首先建立有效的离体培养再生体系。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，同时提供相应的培养基质。

本发明方法包括以下步骤：

(1.1)选择健壮无病虫害蜜橘结过果实的成年优株，取当年抽生20天以内的新枝为外植体；

(1.2)对外植体清洗消毒；

(1.3)外植体接种在腋芽启动培养基上培养至腋芽生长点开始萌动，并在芽的基部四周出现黄绿色小凸点，继续在腋芽启动培养基上生长12～15天，此时主腋芽伸长迅速；

(1.4)培养30～40天时，将长出的腋芽从外植体(母枝)上分割下来，接种到芽增殖培养基上诱导丛芽分化，培养30～40天，平均每个培养物分化出丛生芽4～6个，芽长2～3cm；

(1.5)分割继代，小芽成块继代培养，大芽切割成顶芽和茎节，接种到芽增殖培养基上继代培养，以后每30～40天转代一次，繁殖系数4～6；建成丛芽无性繁殖体系，繁殖的2cm以上芽可进行嫁接育苗，小苗作离体种质保存或继代扩繁。

本发明方法所用的培养基如下：

(1)改良MS培养基，改良MS含以下改良的有机成分：甘氨酸2.0mg/L，VB11.0～2.0mg/L，VB61.0～2.0mg/L，烟酸0.5～1.0mg/L，肌醇100mg/L，叶酸0.1～1.0mg/L，蔗糖40～55g/L，其它成分不变。

(2)腋芽启动培养基：MS+6-BA0.1～0.6mg/L+Kt0.1～0.6mg/L+NAA0.01～0.1mg/L。

(3)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.2～0.5mg/L+Kt0.04～0.4mg/L+Zt0.2～0.5mg/L+NAA0.01～0.05mg/L。

本发明的培养条件如下：

(1)培养参数：恒温24±2℃，相对湿度60％～70％，光照强度为1000～16000lx，日照时长11～14小时/天。

(2)技术参数：外植体污染率低于5％～10％；腋芽萌动诱导率75％～87％；芽丛生增殖系数4～6；继代周期30～40天。

本发明方法中对外植体清洗消毒过程中对外植体清洗消毒过程中先用偏酸性牙膏溶液浸洗杀菌，再用碱性洗衣粉液浸洗杀菌；最后用75％的乙醇溶液和0.1％～0.5％HgCl2溶液消毒。

本发明的培养方法及基质配方为蜜橘成年态茎节腋芽离体再生提供必需的环境条件。用本发明的方法进行南丰蜜橘的离体培养，可获得大量的再生芽。利用这样的柑橘离体再生芽既可作种质保存材料，又可切取1cm的茎端进行试管嫁接培育大批量优质种苗。这对南丰蜜橘以及柑橘类优良种质的离体繁殖或种质离体保存均具有广泛的实用价值。

附图说明

图1为本发明南丰蜜橘成年态茎节腋芽萌动诱导图；

图2为本发明芽丛生增殖培养图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：

(一)、选择健壮无病虫害南丰蜜橘成年优株果树，取当年抽生20d(天)以内的成年态茎抽生新枝；

(二)、用自来水洗去灰尘，再用偏酸性商品牙膏适量溶于水，浸泡嫩枝条6～10min，再用软毛笔刷洗枝叶后，自来水漂洗干净；再用碱性洗衣粉液浸洗6～10min，自来水细流水中漂洗干净，修整老叶枝后用蒸馏水冲洗1～3次，滤纸吸干水滴后装入无菌容器中进行表面灭菌处理；转至超净工作台上，先以75％的乙醇溶液浸泡20～30s，无菌水冲洗2～4次，再0.1％～0.5％HgCl2浸泡柑橘新枝6～10min，倾去药液后，用无菌水冲洗5～6次。然后在无菌条件下，将柑橘新枝切成长度为0.5～1cm左右的小段(带茎节)，接种到准备好的腋芽启动培养基上培养。

(三)、培养至腋芽生长点开始萌动，并在芽的基部四周出现黄绿色小凸点，继续在腋芽启动培养基上生长12～15天，此时主腋芽伸长迅速，

接种后培养30～40天时，将长出的腋芽从外植体(母枝)上分割下来，又接种到芽增殖培养基上诱导丛芽分化，培养30～40天，平均每个培养物分化出丛生芽4～6个，芽长2～3cm；

(四)、分割继代，小芽成块继代培养，大芽切割成顶芽和茎节，接种到芽增殖培养基上继代培养，以后每30～40天转代一次，繁殖系数4～6；建成丛芽无性繁殖体系，繁殖的2cm以上芽可进行嫁接育苗，小苗作离体种质保存或继代扩繁。

(五)培养条件

1.培养基配方

对培养基中的大量元素、微量元素、有机成分、植物激素、糖类等各个组成成分进行多次正交设计及梯度试验基础上得到。本发明基本培养基为改良MS：大量元素、铁盐、微量元素三者与MS培养基中相同；有机成分(改良)用量为：甘氨酸2.0/L，VB11.0～2.0mg/L，VB61.0～2.0mg/L，烟酸0.5～1.0mg/L，肌醇100mg/L，叶酸0.1～1.0mg/L；蔗糖改为40～55g/L。(1)腋芽启动培养基：MS(或改良MS)+6-BA0.1～0.6mg/L(单位下同)+Kt0.1～0.6+NAA0.01～0.1；(2)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.2～0.5+Kt0.04～0.4+Zt0.2～0.5+NAA0.01～0.1；以上培养基的pH值5.8～6.0、琼脂粉0.6％～0.62％，并在118～120℃高温高压下灭菌25min。

2.培养环境

提供培养环境：恒温(24±2)℃，相对湿度60％～70％，光照强度为1000～1600lx，日照时长11～14h(小时)/d(天)

实施例2：

选择健壮无病虫害蜜橘成年优株果树，取当年抽生20d(天)以内的成年态茎抽生新枝，对外植体清洗消毒时先以75％的乙醇溶液浸泡20～30s，无菌水冲洗2～4次，再0.1％浸泡柑橘新枝10min，在无菌条件下，将柑橘新枝切成长度为0.5～1cm左右的小段(带茎节)，接种到准备好的培养基上培养。(1)腋芽启动培养基：MS+6-BA0.1mg/L(单位下同)+Kt0.1+NAA0.01；(2)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.2+Kt0.04+Zt0.2+NAA0.01，其它与实施例1相同。

实施例3：

(1)腋芽启动培养基：改良MS+6-BA0.2mg/L(单位下同)+Kt0.6+NAA0.1；(2)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.3+Kt0.4+Zt0.5+NAA0.1，其它与实施例1或2相同。

实施例4：

(1)腋芽启动培养基：MS+6-BA0.3mg/L(单位下同)+Kt0.5+NAA0.08；(2)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.5+Kt0.08+Zt0.3+NAA0.08，其它与实施例1相同。

实施例5：

(1)腋芽启动培养基：MS+6-BA0.4mg/L(单位下同)+Kt0.3+NAA0.06；(2)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.4+Kt0.1+Zt0.4+NAA0.06，其它与实施例1相同。

实施例6：

(1)腋芽启动培养基：改良MS+6-BA0.5mg/L(单位下同)+Kt0.1+NAA0.05；(2)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.3+Kt0.2+Zt0.0.5+NAA0.05，其它与实施例1相同。

实施例7：

(1)腋芽启动培养基：改良MS+6-BA0.5mg/L(单位下同)+Kt0.1～0.4+NAA0.06；(2)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.2+Kt0.28+Zt0.3+NAA0.04，其它与实施例1相同。

实施例8：

(1)腋芽启动培养基：MS+6-BA0.6mg/L(单位下同)+Kt0.1+NAA0.01；(2)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.2+Kt0.3+Zt0.2+NAA0.03，其它与实施例1相同。

实施例9：

(1)腋芽启动培养基：改良MS+6-BA0.4mg/L(单位下同)+Kt0.2+NAA0.07；(2)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.3+Kt0.36+Zt0.4+NAA0.07。

实施例10：

(1)腋芽启动培养基：MS+6-BA0.2mg/L(单位下同)+Kt0.6+NAA0.1；(2)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.4+Kt0.4+Zt0.3+NAA0.1，其它与实施例1相同。

实施例11：

(1)腋芽启动培养基：改良MS+6-BA0.3mg/L(单位下同)+Kt0.3+NAA0.09；(2)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.4+Kt0.32+Zt0.4+NAA0.09，其它与实施例1相同。

实验结果如表1、表2：

表1：激素配方对柑橘芽启动和增殖的影响**

培养基编号6-BAmg/L Ktmg/L NAAmg/L 接种外植体数(个) 初代腋芽平均萌动数(个) 诱导率(％) 继代生长或平均增殖数(株*)代增殖平均数(倍)*11.01.01.0400— ——21.00.40.1400———31.00.040.01400———40.51.00.1400———50.50.40.01403485902.6560.50.041.040250070.11.00.014037.541.3380.10.41.04012.50090.10.040.1403075481.6

**：基本培养基为MS

*：基本培养基为改良MS

在表1筛选结果的基础上，继续深入研究了激素单因素、多因素效应，找出了几种激素对柑橘芽萌动和丛生芽发生的适宜配比范围。

柑橘成年态再生芽的成功培养还在于初代以后的继代培养。通常实验切取外植体母枝萌发的初代离体腋芽继代培养时，在继代培养基MS基本培养加外源激素(优选的激素配合范围)上，培养物离体柑橘芽10天内几乎都发生不可逆的脱分化，产生一团无定性的、疏松的含水高的愈伤组织。通过改良MS有机成分用量的一系列研究，发现了改良的有机成分用量组合配与激素组合能有效的维持芽的再分化，获得了再生芽继代培养的成功。表2是研究改良有机成分的其中1例。

表2改良MS配方对柑橘芽增殖的影响**

培养基编号VB1mg/LVB6mg/L烟酸mg/L蔗糖g/L叶酸mg/L再生芽平均增殖数继代芽生长情况

(倍) 1*0.40.50.5300.00.00芽愈伤化2 0.4 1.0 1.0 40 0.1 1.23 芽生长增殖慢3 0.4 2.0 2.0 50 0.5 1.06 芽生长增殖慢4 0.4 4.0 4.0 60 1.0 0.68 大部分芽愈伤化5 0 0.5 1.0 50 1.0 0.56 大部分芽愈伤化6 0 1.0 0.5 60 0.5 0.78 大部分芽愈伤化702.04.0300.10.00芽愈伤化8 0 4.0 2.0 40 0.0 0.65 大部分芽愈伤化9 1.0 0.5 2.0 60 0.1 1.78 芽生长增殖慢10 1.0 1.0 4.0 50 0.0 1.85 芽生长增殖慢111.02.00.5401.03.93芽增殖好12 1.0 4.0 1.0 30 0.5 1.35 芽生长增殖慢13 2.0 0.5 4.0 40 0.5 2.32 芽增殖较好有畸形芽14 2.0 1.0 2.0 30 1.0 1.24 芽生长增殖慢15 2.0 2.0 1.0 60 0.0 4.21 芽增殖多有畸形芽16 2.0 4.0 0.5 50 0.1 2.54 芽增殖较好伸长慢

*：1号培养基成分与MS相同

**：1～16号培养基中使用的其它成分和激素均相同。

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1、(10)授权公告号 CN 101341854 B (45)授权公告日 2011.08.31 CN 101341854 B *CN101341854B* (21)申请号 200810107052.3 (22)申请日 2008.09.03 A01H 4/00(2006.01) C12N 5/04(2006.01) (73)专利权人江西师范大学地址 330022 江西省南昌市紫阳大道 99 号 (72)发明人涂艺声徐志祥蔡险峰张杨军 (74)专利代理机构江西省专利事务所 36100 代理人张静 (54) 发明名称蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法 (57) 摘要本发明公开了一种。

2、包括以下步骤：选择健壮无病虫害蜜橘结过果实的成年优株，取当年抽生 20 天以内的新枝为外植体；对外植体清洗消毒；外植体接种培养。腋芽启动培养基： MS 或改良 MS+6-BA0.1 0.6mg/L+Kt0.1 0.6mg/ L+NAA0.01 0.1mg/L。改良 MS+6-BA0.2 0.5mg/L+Kt0.04 0.4mg/L+Zt0.2 0.5mg/ L+NAA0.01 0.05mg/L。本发明的培养方法及基质配方为蜜橘成年态茎节腋芽离体再生提供必需的环境条件。用本发明的方法进行南丰蜜橘的离体培养，可获得大量的再生芽。利用这样的柑橘离体再生芽既可。

3、作种质保存，又可进行试管嫁接培育大批量优质种苗。 (51)Int.Cl. 审查员吴涛 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 5 页附图 1 页 CN 101341854 B1/1 页 2 1. 一种蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，其特征在于：包括以下步骤： (1.1) 选择健壮无病虫害蜜橘结过果实的成年优株，取当年抽生 20 天以内的新枝为外植体； (1.2) 对外植体清洗消毒； (1.3) 外植体接种在腋芽启动培养基上培养至腋芽生长点开始萌动，并在芽的基部四周出现黄绿色小凸点，继续在腋芽启动培养基上生长 12 。

4、15 天，此时主腋芽伸长迅速；腋芽启动培养基： MS 或改良 MS+6-BA0.1 0.6mg/L+Kt0.1 0.6mg/L+NAA0.01 0.1mg/L ；改良 MS 培养基，大量元素、铁盐、微量元素三者与 MS 培养基中相同，改良 MS 含以下改良的有机成分：甘氨酸 2.0mg/L， VB1 1.0 2.0mg/L， VB6 1.0 2.0mg/L，烟酸 0.5 1.0mg/L，肌醇 100mg/L，叶酸 0.1 1.0mg/L，蔗糖 40 55g/L ； (1.4) 培养 30 40 天时，将长出的腋芽从外植体上分割下来，接种到芽增殖培养基上诱。

5、导丛芽分化，培养 30 40 天，平均每个培养物分化出丛生芽 4 6 个，芽长 2 3cm，芽增殖培养基：改良 MS+6-BA0.2 0.5mg/L+Kt0.04 0.4mg/L+NAA0.01 0.05mg/L ； (1.5) 分割继代，小芽成块继代培养，大芽切割成顶芽和茎节，接种到芽增殖培养基上继代培养，以后每3040天转代一次，繁殖系数46 ；建成丛芽无性繁殖体系，繁殖的2cm 以上芽可进行嫁接育苗，小苗作离体种质保存或继代扩繁。 2. 根据权利要求 1 所述的蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，其特征在于：培养条件如下： (2.1) 培养参数。

6、：恒温 242，相对湿度 60 70，光照强度为 1000 1600lx，日照时长 11 14 小时 / 天； (2.2) 技术参数：外植体污染率低于 5 10；腋芽萌动诱导率 75 87；芽丛生增殖系数 4 6 ；继代周期 30 40 天。 3. 根据权利要求 1 所述的蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，其特征在于：对外植体清洗消毒过程中先用偏酸性牙膏溶液浸洗杀菌，再用碱性洗衣粉液浸洗杀菌；最后用 75的乙醇溶液和 0.1 0.5 HgCl2溶液消毒。权利要求书 CN 101341854 B1/5 页 3 蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培。

7、养方法技术领域 0001 本发明涉及一种植物生物技术，尤其涉及一种蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法。 0002 背景技术 0003 柑橘居世界百果生产之首，其果实营养丰富，色香味兼优，既可鲜食，又可加工果汁制品。南丰蜜橘是柑橘类宽皮橘中著名的优良品种。南丰蜜橘源出乳桔，又是乳桔中的精品，最突出特点在于皮薄金黄、酸甜适口、香气浓郁、汁多核少，誉为 “橘中之王” 驰名中外，它是我国特有的优良柑橘栽培品种。 0004 蜜橘成年树茎器官离体腋芽丛生培养对快速繁殖优质种苗和种质离体保存具有重要作用，它能较好地保持品种的遗传稳定性。我国利用组织培养进行柑橘快速繁。

8、殖的研究工作较广泛，上世纪七十年代王大元报道后至今，有不少文献报告了柑橘科属的多种植物离体不定芽或丛芽的产生，但选用的外植体几乎大都是未渡越童期的组织，很少见成年态营养体组织培养再生芽的报道。原因有两点：一是成年结果柑橘树的枝茎外植体表面灭菌困难；二是成年态柑橘营养器官组织离体再分化难。而柑橘成年态茎段离体培养是柑橘优良品系工厂化育苗及其种质离体保存等的重要技术平台，必须首先建立有效的离体培养再生体系。 0005 发明内容 0006 本发明的目的在于：提供一种蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，同时提供相应的培养基质。 0007 本发明方法包括以下步骤。

9、： 0008 (1.1) 选择健壮无病虫害蜜橘结过果实的成年优株，取当年抽生 20 天以内的新枝为外植体； 0009 (1.2) 对外植体清洗消毒； 0010 (1.3) 外植体接种在腋芽启动培养基上培养至腋芽生长点开始萌动，并在芽的基部四周出现黄绿色小凸点，继续在腋芽启动培养基上生长 12 15 天，此时主腋芽伸长迅速； 0011 (1.4) 培养 30 40 天时，将长出的腋芽从外植体 ( 母枝 ) 上分割下来，接种到芽增殖培养基上诱导丛芽分化，培养 30 40 天，平均每个培养物分化出丛生芽 4 6 个，芽长 2 3cm ； 0012 (1.5) 分割。

10、继代，小芽成块继代培养，大芽切割成顶芽和茎节，接种到芽增殖培养基上继代培养，以后每 30 40 天转代一次，繁殖系数 4 6 ；建成丛芽无性繁殖体系，繁殖的 2cm 以上芽可进行嫁接育苗，小苗作离体种质保存或继代扩繁。 0013 本发明方法所用的培养基如下： 0014 (1) 改良 MS 培养基，改良 MS 含以下改良的有机成分：甘氨酸 2.0mg/L， VB11.0 2.0mg/L， VB61.0 2.0mg/L，烟酸 0.5 1.0mg/L，肌醇 100mg/L，叶酸 0.1 1.0mg/L，蔗糖 40 55g/L，其它成分不变。说明书 CN 1。

11、01341854 B2/5 页 4 0015 (2) 腋芽启动培养基： MS+6-BA0.1 0.6mg/L+Kt0.1 0.6mg/L+NAA0.01 0.1mg/L。 0016 (3) 芽增殖培养基：改良 MS+6-BA0.2 0.5mg/L+Kt0.04 0.4mg/L+Zt0.2 0.5mg/L+NAA0.01 0.05mg/L。 0017 本发明的培养条件如下： 0018 (1)培养参数：恒温242，相对湿度6070，光照强度为100016000lx，日照时长 11 14 小时 / 天。 0019 (2) 技术参数：外植体污染率低于 5 10；腋芽。

12、萌动诱导率 75 87；芽丛生增殖系数 4 6 ；继代周期 30 40 天。 0020 本发明方法中对外植体清洗消毒过程中对外植体清洗消毒过程中先用偏酸性牙膏溶液浸洗杀菌，再用碱性洗衣粉液浸洗杀菌；最后用 75的乙醇溶液和 0.1 0.5 HgCl2溶液消毒。 0021 本发明的培养方法及基质配方为蜜橘成年态茎节腋芽离体再生提供必需的环境条件。用本发明的方法进行南丰蜜橘的离体培养，可获得大量的再生芽。利用这样的柑橘离体再生芽既可作种质保存材料，又可切取 1cm 的茎端进行试管嫁接培育大批量优质种苗。这对南丰蜜橘以及柑橘类优良种质的离体繁殖或种质离体保存均具有广泛的实。

13、用价值。 0022 附图说明 0023 图 1 为本发明南丰蜜橘成年态茎节腋芽萌动诱导图； 0024 图 2 为本发明芽丛生增殖培养图。 0025 具体实施方式 0026 以下结合实施例对本发明进行详细说明。 0027 实施例 1 ： 0028 ( 一 )、选择健壮无病虫害南丰蜜橘成年优株果树，取当年抽生 20d( 天 ) 以内的成年态茎抽生新枝； 0029 ( 二 )、用自来水洗去灰尘，再用偏酸性商品牙膏适量溶于水，浸泡嫩枝条 6 10min，再用软毛笔刷洗枝叶后，自来水漂洗干净；再用碱性洗衣粉液浸洗 6 10min，自来水细流水中漂洗干净，修整老叶枝后用蒸馏水。

14、冲洗13次，滤纸吸干水滴后装入无菌容器中进行表面灭菌处理；转至超净工作台上，先以75的乙醇溶液浸泡2030s，无菌水冲洗 2 4 次，再 0.1 0.5 HgCl2浸泡柑橘新枝 6 10min，倾去药液后，用无菌水冲洗 5 6 次。然后在无菌条件下，将柑橘新枝切成长度为 0.5 1cm 左右的小段 ( 带茎节 )，接种到准备好的腋芽启动培养基上培养。 0030 ( 三 )、培养至腋芽生长点开始萌动，并在芽的基部四周出现黄绿色小凸点，继续在腋芽启动培养基上生长 12 15 天，此时主腋芽伸长迅速， 0031 接种后培养 30 40 天时，将长出的腋芽从外植体。

15、( 母枝 ) 上分割下来，又接种到芽增殖培养基上诱导丛芽分化，培养 30 40 天，平均每个培养物分化出丛生芽 4 6 个，芽长 2 3cm ； 0032 ( 四 )、分割继代，小芽成块继代培养，大芽切割成顶芽和茎节，接种到芽增殖培养基上继代培养，以后每 30 40 天转代一次，繁殖系数 4 6 ；建成丛芽无性繁殖体系，繁殖的 2cm 以上芽可进行嫁接育苗，小苗作离体种质保存或继代扩繁。说明书 CN 101341854 B3/5 页 5 0033 ( 五 ) 培养条件 0034 1. 培养基配方 0035 对培养基中的大量元素、微量元素、有机成分、植。

16、物激素、糖类等各个组成成分进行多次正交设计及梯度试验基础上得到。本发明基本培养基为改良 MS ：大量元素、铁盐、微量元素三者与 MS 培养基中相同；有机成分 ( 改良 ) 用量为：甘氨酸 2.0/L， VB11.0 2.0mg/L， VB61.0 2.0mg/L，烟酸 0.5 1.0mg/L，肌醇 100mg/L，叶酸 0.1 1.0mg/L ；蔗糖改为 40 55g/L。(1) 腋芽启动培养基： MS( 或改良 MS)+6-BA0.1 0.6mg/L( 单位下同 )+Kt0.1 0.6+NAA0.01 0.1 ； (2) 芽增殖培养基：改良 MS+6-BA。

17、0.2 0.5+Kt0.04 0.4+Zt0.20.5+NAA0.010.1 ；以上培养基的pH值5.86.0、琼脂粉0.60.62，并在 118 120高温高压下灭菌 25min。 0036 2. 培养环境 0037 提供培养环境：恒温 (242)，相对湿度 60 70，光照强度为 1000 1600lx，日照时长 11 14h( 小时 )/d( 天 ) 0038 实施例 2 ： 0039 选择健壮无病虫害蜜橘成年优株果树，取当年抽生 20d( 天 ) 以内的成年态茎抽生新枝，对外植体清洗消毒时先以 75的乙醇溶液浸泡 20 30s，无菌水冲洗 2 4 次，再 0.。

18、1浸泡柑橘新枝 10min，在无菌条件下，将柑橘新枝切成长度为 0.5 1cm 左右的小段 ( 带茎节 )，接种到准备好的培养基上培养。(1) 腋芽启动培养基： MS+6-BA0.1mg/L( 单位下同)+Kt0.1+NAA0.01 ； (2)芽增殖培养基：改良MS+6-BA0.2+Kt0.04+Zt0.2+NAA0.01，其它与实施例 1 相同。 0040 实施例 3 ： 0041 (1)腋芽启动培养基：改良MS+6-BA0.2mg/L(单位下同)+Kt0.6+NAA0.1 ； (2)芽增殖培养基：改良 MS+6-BA0.3+Kt0.4+Zt0.5+NAA0.1，。

19、其它与实施例 1 或 2 相同。 0042 实施例 4 ： 0043 (1) 腋芽启动培养基： MS+6-BA0.3mg/L( 单位下同 )+Kt0.5+NAA0.08 ； (2) 芽增殖培养基：改良 MS+6-BA0.5+Kt0.08+Zt0.3+NAA0.08，其它与实施例 1 相同。 0044 实施例 5 ： 0045 (1) 腋芽启动培养基： MS+6-BA0.4mg/L( 单位下同 )+Kt0.3+NAA0.06 ； (2) 芽增殖培养基：改良 MS+6-BA0.4+Kt0.1+Zt0.4+NAA0.06，其它与实施例 1 相同。 0046 实施例 6 ： 00。

20、47 (1) 腋芽启动培养基：改良 MS+6-BA0.5mg/L( 单位下同 )+Kt0.1+NAA0.05 ； (2) 芽增殖培养基：改良 MS+6-BA0.3+Kt0.2+Zt0.0.5+NAA0.05，其它与实施例 1 相同。 0048 实施例 7 ： 0049 (1) 腋芽启动培养基：改良 MS+6-BA0.5mg/L( 单位下同 )+Kt0.1 0.4+NAA0.06 ； (2) 芽增殖培养基：改良 MS+6-BA0.2+Kt0.28+Zt0.3+NAA0.04，其它与实施例 1 相同。 0050 实施例 8 ： 0051 (1) 腋芽启动培养基： MS+6-。

21、BA0.6mg/L( 单位下同 )+Kt0.1+NAA0.01 ； (2) 芽增殖培养基：改良 MS+6-BA0.2+Kt0.3+Zt0.2+NAA0.03，其它与实施例 1 相同。 0052 实施例 9 ：说明书 CN 101341854 B4/5 页 6 0053 (1) 腋芽启动培养基：改良 MS+6-BA0.4mg/L( 单位下同 )+Kt0.2+NAA0.07 ； (2) 芽增殖培养基：改良 MS+6-BA0.3+Kt0.36+Zt0.4+NAA0.07。 0054 实施例 10 ： 0055 (1) 腋芽启动培养基： MS+6-BA0.2mg/L( 单位下。

22、同 )+Kt0.6+NAA0.1 ； (2) 芽增殖培养基：改良 MS+6-BA0.4+Kt0.4+Zt0.3+NAA0.1，其它与实施例 1 相同。 0056 实施例 11 ： 0057 (1) 腋芽启动培养基：改良 MS+6-BA0.3mg/L( 单位下同 )+Kt0.3+NAA0.09 ； (2) 芽增殖培养基：改良 MS+6-BA0.4+Kt0.32+Zt0.4+NAA0.09，其它与实施例 1 相同。 0058 实验结果如表 1、表 2 ： 0059 表 1 ：激素配方对柑橘芽启动和增殖的影响 * 0060 培养基编号 6-BAmg/ L Ktmg/ L。

23、 NAAmg/ L 接种外植体数 ( 个 ) 初代腋芽平均萌动数 ( 个 ) 诱导率 ( ) 继代生长或平均增殖数 ( 株 *) 代增殖平均数 ( 倍 )* 11.01.01.0400 21.00.40.1400 31.00.040.01400 40.51.00.1400 50.50.40.01403485902.65 60.50.041.0402500 70.11.00.014037.541.33 80.10.41.04012.500 90.10.040.1403075481.6 0061 * ：基本培养基为 MS 0062 * ：基本培养基为改良 MS 0063。

24、在表 1 筛选结果的基础上，继续深入研究了激素单因素、多因素效应，找出了几种激素对柑橘芽萌动和丛生芽发生的适宜配比范围。 0064 柑橘成年态再生芽的成功培养还在于初代以后的继代培养。通常实验切取外植体母枝萌发的初代离体腋芽继代培养时，在继代培养基MS基本培养加外源激素(优选的激素配合范围)上，培养物离体柑橘芽10天内几乎都发生不可逆的脱分化，产生一团无定性的、疏松的含水高的愈伤组织。通过改良 MS 有机成分用量的一系列研究，发现了改良的有机成分用量组合配与激素组合能有效的维持芽的再分化，获得了再生芽继代培养的成功。表 2 是研究改良有机成分的其中 1 例。 00。

25、65 表 2 改良 MS 配方对柑橘芽增殖的影响 * 0066 说明书 CN 101341854 B5/5 页 7 培养基编号 VB1mg/LVB6mg/L烟酸 mg/L 蔗糖 g/L 叶酸 mg/L 再生芽平均增殖数继代芽生长情况 ( 倍 ) 1*0.40.50.5300.00.00芽愈伤化 20.41.01.0400.11.23芽生长增殖慢 30.42.02.0500.51.06芽生长增殖慢 40.44.04.0601.00.68大部分芽愈伤化 500.51.0501.00.56大部分芽愈伤化 601.00.5600.50.78大部分芽愈伤化 702.04.0300.10.00芽愈伤。

26、化 804.02.0400.00.65大部分芽愈伤化 91.00.52.0600.11.78芽生长增殖慢 101.01.04.0500.01.85芽生长增殖慢 111.02.00.5401.03.93芽增殖好 121.04.01.0300.51.35芽生长增殖慢 132.00.54.0400.52.32芽增殖较好有畸形芽 142.01.02.0301.01.24芽生长增殖慢 152.02.01.0600.04.21芽增殖多有畸形芽 162.04.00.5500.12.54芽增殖较好伸长慢 0067 * ： 1 号培养基成分与 MS 相同 0068 * ： 1 16 号培养基中使用的其它成分和激素均相同。说明书 CN 101341854 B1/1 页 8 图 1 图 2 说明书附图。

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