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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201110427983.3 (22)申请日 2011.12.19 A01K 61/00(2006.01) (73)专利权人 河南科技大学 地址 471003 河南省洛阳市涧西区西苑路 48 号 (72)发明人 汪洋 易力 史明艳 张才 刘一尘 张蕾 李小康 余祖华 张春杰 程相朝 (74)专利代理机构 郑州睿信知识产权代理有限 公司 41119 代理人 牛爱周 张姝娜 . 肺炎克雷伯杆菌生物被膜肺感染模 型的建立及对抗生素的敏感性研究 .中国医科 大学硕士学位论文 .2002, (54) 发明名称 一种体内细菌生物被膜感染动物模型的构建。
2、 方法 (57) 摘要 本发明涉及一种体内细菌生物被膜感染动 物模型的构建方法， 它包括以下步骤， (1) 细菌悬 液的准备 ； (2) 实验动物的麻醉及背部肌肉感染 ； (3) 鉴定动物模型相关指标。采用本发明的方法， 通过斑马鱼背部肌肉注射猪链球菌， 建立了细菌 形成生物被膜感染的体内动物模型， 有效地模拟 了细菌感染动物的真实情况， 发现猪链球菌在斑 马鱼背部肌肉中大量积聚， 形成生物被膜感染的 状态， 获得的体内动物模型符合实际且稳定性好， 从而为进一步了解细菌在动物体内存在的真实状 态， 了解细菌生物被膜在体内的形成机制及深入 理解细菌的致病机理， 开发相关药物提供了动物 模型。 同。
3、时， 该构建方法操作简单， 技术、 设备要求 低， 成功率高。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 冷婷婷 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102669017 B (45)授权公告日 2015.02.25 CN 102669017 B 1/1 页 2 1. 一种体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤， (1) 细菌悬液的准备 ； (2) 实验动物的麻醉及背部肌肉感染 ； (3) 鉴定动物模型相关指标 ； 步骤 (1) 中细菌悬液由以下方法获得 ： 将 -80温度。
4、下保存的用于接种的细菌划哥伦 比亚血平板， 挑单菌落在培养基中 37的温度下过夜培养 ； 然后取菌液加入 THB 培养基， 37摇床继续培养过夜， 涂片检查为纯培养后， 以1:100接种摇菌培养4-6小时获得对数生 长期的菌体， 以分光光度计测定 OD600 值为 0.8-1.0 之间 ； 将菌体清洗 2-3 遍后， 调节细菌 浓度为 106个 /ml 备用 ； 所述的实验动物为纯系斑马鱼 ； 实验动物的麻醉及背部肌肉感染为用浓度 95g/mL 的三卡因间氨苯酸乙脂甲磺酸盐将斑马鱼麻醉 ； 背部接种 5104个 / 鱼的细菌数量， 对照 组注射THB培养基， 感染24h后， 无菌采取背部感染的。
5、部位， 将背部肌肉固定于2的多聚甲 醛中 ； 所述的鉴定包括对背部肌肉甲醛固定制备组织切片， 进行 HE 染色、 革兰氏染色和扫描 电镜观察 ； 扫描电镜观察的样品处理方法为 ： 将无菌采取的斑马鱼背部肌肉组织放于 4戊二醛 固定6h ； 0.1M磷酸缓冲液清洗3次， 每次10min ； 2锇酸固定至样品黑透， 用0.1M磷酸缓冲 液清洗 3 次， 每次 10min ； 再依次用 30、 50、 70和 90乙醇脱水 15min ； 最后用 100 乙醇脱水两次， 每次 15min ； 放入干燥篮， 用临界点干燥仪进行干燥 ； 取出干燥样品， 用导电 胶粘在样品台上， 离子溅射仪进行喷金处理，。
6、 电流 15mA， 2min ； 所述用于接种的细菌为猪链球菌临床分离株。 2. 根据权利要求 1 所述的体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法， 其特征在于 ： 分别在感染 24 小时后将斑马鱼处死， 对斑马鱼相关指标进行鉴定。 权 利 要 求 书 CN 102669017 B 2 1/4 页 3 一种体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法 技术领域 0001 本发明涉及一种体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法， 属于医学动物模型 研究领域。 背景技术 0002 细菌生物被膜 (biofi lm， BF) 是指单一或多种类群细菌为了适应周围环境， 吸 附于异物或组织表面， 繁殖并分泌大量多。
7、糖基质、 纤维蛋白、 脂蛋白等多糖蛋白复合物， 使得细菌相互聚集、 粘连、 缠绕， 形成具有三维立体结构的膜样物， 是细菌微菌落聚集体 (Hall-Stoodley L， Costerton JW， Stoodley P.Bacterial biofi lms ： from the natural environment to infectious diseases.Nat Rev Microbiol， 2004， 2 ： 95-108)。在自然界 中， 任何细菌在成熟条件下都可以形成生物被膜， 并且 90以上的微生物是以生物被膜的 形式生存生长的(Costerton JW， Stewart 。
8、PS， Greenberg EP.Bacterial biofi lms ： a common cause of persistent infections.Science， 1999， 284 ： 1318-1322)。美国疾病控制预防 中心专家估计 65以上的人类细菌感染与 BF 有关 (Potera C， Forging a link between biofi lms and disease.Science， 1999， 283 ： 1837， 1839)， 因而有关生物被膜的研究日益成 为热点。已有越来越多的实验证明生物被膜可能是细菌在宿主体内真实的存在形式， 这提 示如果能有效预防。
9、控制 BF 感染， 在临床感染治疗中将具有重要意义。生物被膜状态下的细 菌性质于浮游状态的细菌有较大不同， 其对抗生素及宿主的免疫反应不敏感， 临床上发现 即使多次试验证明有效的药物， 也不能彻底清除生物被膜， 这就导致感染迁延不愈， 浪费了 大量的人力及物力， 形成了公共卫生问题。所以， 建立一种新型的更符合临床实际情况的、 简单、 可靠的体内细菌生物被膜动物感染模型， 用以研究细菌在动物体内真实存在形成， 从 而理解细菌的致病机理， 以期控制疫病。 0003 近年来， 体内生物被膜模型的建立方法有大量的报道， 但大部分是都是人为外源 性的把部分器械 ( 导管， 组织套管等 ) 埋于动物体内。
10、， 造成体内感染的动物模型， 此类方法 都不能很好的模拟真实的细菌感染的途径， 定植于组织的部位， 与理想的体内感染有一定 差异。目前在脊髓动物模型上埋植导管等建立的体内模型主要包括中心静脉导管模型、 皮 下异源物质的感染模型、 腹膜内外源物质的感染模型、 尿道感染模型、 呼吸道感染模型和 骨髓炎感染模型等。研究者首次利用大鼠模型来研究金黄色葡萄球菌 (Ulphani JS， Rupp ME， Model of Staphylococcus aureus central venous catheter-associated infection in rats.Lab Anim Sci， 199。
11、9， 49 ： 283-287) 和 表 皮 葡 萄 球 菌 (Rupp ME， Ulphani JS， Fey PD， Mack D， Characterization of Staphylococcus epidermidis polysaccharide intercellular adhesin/hemagglutinin in the pathogenesis of intravascular catheter-associated infection in a rat model.Infect Immun， 1999， 67 ： 2656-2659) 在动物体内生物被膜的形成。在这。
12、种模型上， 硅胶导管被埋至于大鼠的静脉导管上， 以细 菌接种静脉导管。皮下异源物质感染模型主要用到一种由聚四氟乙烯材质的组织套管， 里面包含玻璃珠和其他材料， 这种外源的物体被埋入皮下， 使得细菌生物被膜能在上面生 说 明 书 CN 102669017 B 3 2/4 页 4 成。该模型的主要优点在于微生物细胞可以很容易的在组织套管中定植， 并不需移出。在 很多体内生物被膜研究中， 细菌能够在埋入兔子和老鼠腹膜腔内的生物材料上形成生物 被膜。这种情况是在埋入生物材料后接种一定量的细菌 (Buret A， Ward KH， Olson ME， Costerton JW， An in vivo m。
13、odel to study the pathobiology of infectious biofi lms on biomaterial surfaces.J Biomed Mater Res， 1991， 25 ： 865-874)。 该模型的优势是让机 体建立一种慢性感染， 使得宿主长期处于细菌感染状态 (Gagnon RF， Richards GK， A mouse model of implant-associated infection.Int J Artif Organs， 1993， 16 ： 789-798)。 Satoh 等 (Satoh M， Munakata K， Ki。
14、toh K， Takeuchi H， Yoshida O， A newly designed model for infection-induced bladder stone formation in the rat.J Urol， 1984， 132 ： 1247-1249) 利用此模型把锌碟片埋植于大鼠的膀胱中， 然后经膀胱接种变形杆菌， 随后证 实尿道感染中细菌生物被膜的形成和基质的产生在尿道感染中起重要作用 (Nickel JC， Olson M， McLean RJ， Grant SK， Costerton JW， An ecological study of infected u。
15、rinary stone genesis in an animal model.Br J Urol， 1987， 59 ： 21-30)。气管导管动物模型主 要是将灭菌的导管插入动物气管后， 将一定量菌液通过导管注入肺内， 该方法与临床上气 管感染生物被膜的实际形成过程不相符合， 且主要反映的不是气管内真实的情况。以上方 法都存在手术放置外源异物造成动物机体的感染， 不是真实反映病原菌天然感染的真实状 态， 由于手术放置外源异物给动物体带来了较大刺激， 并有可能导致手术后其他细菌的感 染， 从而干扰实验结果。 0004 因此， 建立真实反映机体生物被膜感染的体内模型， 深入研究细菌生物被膜在动。
16、 物体内形成的机制， 就显得尤为重要。 随着相关技术的不断更新和发展， 人们对细菌生物被 膜的认识和理解将越发深入和透彻， 也就可以更好地控制生物被膜， 造福社会。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种简单易行、 对研究者技术要求低， 模型制作成功率高， 能真实模拟细菌体内生物被膜感染的动物模型的构建方法。 0006 为了实现上述目的， 本发明的技术方案采用了一种体内细菌生物被膜感染动物模 型的构建方法， 包括以下步骤 ： 0007 (1) 细菌悬液的准备 ； 0008 (2) 实验动物的麻醉及背部肌肉感染 ； 0009 (3) 鉴定动物模型相关指标。 0010 步骤 (1) 中细菌悬。
17、液由以下方法获得 ： 将 -80温度下保存的用于接解的细菌划 哥伦比亚血平板， 挑单菌落在培养基中 37的温度下过夜培养 ； 然后取菌液加入新鲜 THB 培养基， 37摇床继续培养过夜， 涂片检查为纯培养后， 以 1 100 接种摇菌培养 4-6 小时 获得对数生长期的菌体， 以分光光度计测定 OD600 值为 08-1.0 之间 ； 将菌体以无菌 THB 清 洗 2-3 遍后 ； 以 THB 培养基调节细菌浓度为 106个 /ml 备用。 0011 所述用于接种的细菌为猪链球菌临床分离株。 0012 所述的实验动物为纯系斑马鱼。 0013 实验动物的麻醉及背部肌肉感染为用浓度 95g/mL 。
18、的三卡因间氨苯酸乙脂甲磺 酸盐 (MS-222) 将斑马鱼麻醉 ； 背部接种 5104/ 鱼的细菌数量， 对照组注射 THB 培养基， 感 说 明 书 CN 102669017 B 4 3/4 页 5 染后 24h， 无菌采取背部感染的部位， 将背部肌肉固定于 2的多聚甲醛中。 0014 分别在感染 24 小时后将所述实验方法的斑马鱼处死， 对斑马鱼相关指标进行鉴 定。 0015 所述的鉴定包括对背部肌肉制备冰冻组织切片， 进行 HE 染色、 革兰氏染色和扫描 电镜 (SEM) 观察。 0016 采用本发明的方法， 通过斑马鱼背部肌肉注射猪链球菌， 建立了细菌形成生物被 膜感染的体内动物模型，。
19、 有效地模拟了细菌感染动物的真实情况， 发现猪链球菌在斑马鱼 背部肌肉内大量积聚， 形成生物被膜感染的状态， 获得的体内动物模型符合实际且稳定性 好， 从而为进一步了解细菌在动物体内存在的真实状态， 了解细菌生物被膜在体内的形成 机制及深入理解细菌的致病机理， 开发相关药物提供了动物模型。 同时， 该构建方法操作简 单， 技术、 设备要求低， 成功率高。 附图说明 0017 图 1 为斑马鱼背部肌肉冰冻切片 HE 染色结果 ； 0018 图 2 为斑马鱼背部肌肉冰冻切片革兰氏染色结果 ； 0019 图 3 为斑马鱼背部肌肉扫描电镜结果。 具体实施方式 0020 实施例 ： 0021 1. 细菌。
20、悬液的准备 0022 将 -80保存的猪链球菌菌株划哥伦比亚血平板， 挑单菌落在培养基中 37过夜 培养。然后取菌液加入新鲜 THB 培养基 ( 市售 )， 37摇床继续培养过夜， 涂片检查为纯培 养后， 以 1 100 接种摇菌培养 4-6 小时获得对数生长期的菌体， 以分光光度计测定 OD600 值为 08-1.0 之间。将菌体以无菌 THB 清洗 2-3 遍后。以 THB 培养基调节细菌浓度为 106个 /ml 备用。 0023 2. 实验动物的麻醉及背部肌肉感染 0024 斑马鱼的饲养方法按一般热带鱼的饲养方法饲养。用浓度 95g/mL 的三卡因间 氨苯酸乙脂甲磺酸盐 (MS-222)。
21、( 杭州动物药品厂 ) 将斑马鱼麻醉。根据实验室报道确定的 进行预实验确认接种的细菌剂量。背部接种 5104/ 鱼的细菌数量， 对照组注射 THB 培养 基， 感染后 24h， 无菌采取背部感染的部位， 将背部肌肉固定于 2的多聚甲醛中或液氮中。 0025 3. 动物模型相关指标的鉴定 0026 (1) 冰冻切片的制备 0027 将制备好的斑马鱼背部肌肉组织切成大约 24242mm 的大小速放于冷冻台上， 冰冻。调好欲切的厚度， 进行切片。 0028 (2) 常规 HE 染色步骤 0029 冰冻切片固定(1030s)-稍水洗(12s)-苏木精液染色(3060s)-流水 洗去苏木精液 (5 10。
22、s)-1盐酸乙醇 (1 3s)- 稍水洗 (1 2s)- 促蓝液返蓝 (5 10s)-流水冲洗(1530s)-0.5曙红液染色(3060s)-蒸馏水稍洗(12s)-80 乙醇 (1 2s)-95乙醇 (1 2s)- 无水乙醇 (1 2s)- 石炭酸二甲苯 (2 3s)- 二 说 明 书 CN 102669017 B 5 4/4 页 6 甲苯 (I)(2 3s)- 二甲苯 (II)(2 3s)- 中性树胶封固。 0030 (3) 常规革兰氏染色 0031 将制备好的冰冻切片进行常规革兰氏染色。革兰氏阴性菌呈红色， 而革兰氏阳性 菌保有原来的紫色。 0032 (4) 扫描电镜观察 0033 将无菌。
23、采取的斑马鱼背部肌肉组织放于 4戊二醛固定 6h ； 0.1M 磷酸缓冲液清洗 3 次， 每次 10min ； 2锇酸固定至样品黑透， 用 0.1M 磷酸缓冲液清洗 3 次， 每次 10min ； 再依 次用 30、 50、 70和 90乙醇脱水 15min ； 最后用 100乙醇脱水两次， 每次 15min ； 放 入干燥篮， 用临界点干燥仪进行干燥 ； 取出干燥样品， 用导电胶粘在样品台上， 离子溅射仪 进行喷金处理 ( 电流 15mA， 2min)。按需要调节观察条件， 在扫描电镜下对处理好的样品进 行观察并拍摄电镜照片。 0034 4. 模型建立的评价结果 0035 (1) 肉眼分析 。
24、0036 所有细菌接种组都可见背部肌肉有坏死灶并有渗出液， 显示感染迹象。空白对照 组创面相对清洁， 几乎无渗出。 0037 (2)HE 染色光学显微镜下分析 0038 由图 1 显示猪链球菌在斑马鱼肌肉组织中出现明显的集群现象。 0039 A ： 斑马鱼肌肉丛切 HE 染色 B ： 斑马鱼肌肉横切 HE 染色 0040 (3) 革兰氏染色结果 0041 由图 2 显示猪链球菌在斑马鱼肌肉组织中出现明显的细菌聚团成簇的现象， 可见 明显形成生物被膜的细菌集落。 0042 (4) 扫描电镜分析 0043 由图 3 可知， 扫描电镜显示在感染的创面有有多糖包裹的类似于 “生物被膜” 样的 膜样结构， 把细菌包裹形成细胞簇， 包裹形成的膜不同于宿主本身的细胞膜， 厚度厚于细胞 壁。 说 明 书 CN 102669017 B 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102669017 B 7 。