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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201280074984.7 (22)申请日 2012.07.31 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104507334 A (43)申请公布日 2015.04.08 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2015.01.29 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/JP2012/069392 2012.07.31 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2014/020676 JA 2014.02.06 (73)专利权人 雪印惠乳业株式会社 地址 日本北海道 (7。
2、2)发明人 大町爱子 松山博昭 森田如一 石田祐子 奈良贵幸 加藤健 芹泽笃 (74)专利代理机构 北京林达刘知识产权代理事 务所(普通合伙) 11277 代理人 刘新宇 李茂家 (51)Int.Cl. A61K 38/22(2006.01) A61P 19/00(2006.01) A23L 33/18(2016.01) (56)对比文件 CN 1835766 B,2012.06.20, CN 102088995 A,2011.06.08, Y. TOBA,et.MilkBasic Protein:A Novel Protective Function of Milk Against Oste。
3、oporosis. Bone .2000,第27卷(第3期), 审查员 曾永昶 (54)发明名称 新蛋白材料 (57)摘要 本发明涉及蛋白材料， 其包含215mg/ 100mg的量的血管生成素和/或血管生成素水解 产物， 以及与血管生成素和/或血管生成素水解 产物的质量比为0.320的乳过氧化物酶和/或 乳过氧化物酶水解产物。 权利要求书1页 说明书10页 CN 104507334 B 2016.11.16 CN 104507334 B 1.一种蛋白材料， 其包含215mg/100mg的量的血管生成素和/或血管生成素水解产物 和与血管生成素和/或血管生成素水解产物的质量比为0.320的乳过氧化。
4、物酶和/或乳过 氧化物酶水解产物。 2.一种饮食品或饲料， 其包含根据权利要求1所述的蛋白材料。 3.一种骨强化剂， 其包含根据权利要求1所述的蛋白材料作为活性成分。 4.根据权利要求1所述的蛋白材料在制备通过骨强化方法来强化骨的药剂中的用途， 所述骨强化方法包括以5mg/天以上的量摄取根据权利要求1所述的蛋白材料。 5.一种制备根据权利要求1所述的蛋白材料的方法， 其包括下列步骤1)3)： 1)制备血管生成素和/或血管生成素水解产物； 2)制备乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶水解产物； 和 3)混合根据上述2)所述的乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶水解产物和根据上述1)所 述的血管生成素和/或血。
5、管生成素水解产物， 以使得乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶水解 产物与血管生成素和/或血管生成素水解产物的质量比为0.320。 6.一种制备根据权利要求1所述的蛋白材料的方法， 其包括从乳和/或源自乳的材料中 提取包含血管生成素和/或血管生成素水解产物以及乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶水 解产物的级分， 以使得乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶水解产物与血管生成素和/或血管 生成素水解产物的质量比为0.320的步骤。 7.根据权利要求6所述的方法， 其进一步包括另外的步骤， 即， 将包含于所述级分中的 血管生成素和/或乳过氧化物酶酶促分解的步骤。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 10450。
6、7334 B 2 新蛋白材料 技术领域 0001 本发明涉及新蛋白材料， 和包含该蛋白材料的药物、 饮食品或饲料， 并用于预防和 治疗骨疾病。 该蛋白材料具有促进成骨细胞增殖， 并抑制破骨细胞分化和破骨细胞的骨吸 收的功能。 因此， 该蛋白材料用于预防和治疗各种骨疾病， 如骨质疏松症、 骨折、 风湿病和关 节炎。 背景技术 0002 近年来， 在全球范围内伴随着社会老龄化等， 各种骨疾病， 例如骨质疏松、 骨折和 腰疼增加， 并且已变为严重的社会问题。 这些疾病由钙摄入不足， 钙吸收能力下降， 闭经期 后激素失衡等引起。 据认为， 从生命早期开始通过活化成骨细胞和骨形成尽可能地增加体 内骨量，。
7、 并且增加最大骨量和骨强度(骨密度+骨质)在预防各种骨疾病， 例如骨质疏松、 骨 折和腰疼方面是有效的。 注意术语 “骨质” 涉及骨显微结构、 代谢更新( metabolic turnover)、 微裂纹和钙化。 据称各种骨疾病， 例如骨质疏松、 骨折和腰疼可通过抑制破骨细 胞的骨吸收来预防。 骨以平衡的方式反复吸收和形成(重塑)。 然而， 当由于闭经期后激素平 衡变化等引起骨吸收超过骨形成时， 可发生各种骨疾病， 例如骨质疏松、 骨折和腰疼。 因此， 通过抑制破骨细胞的骨吸收和维持骨强度在恒定水平可使骨得到强化。 0003 考虑到上述情形， 为了强化骨， 已摄取了单独添加钙盐， 例如碳酸钙、。
8、 磷酸钙或乳 酸钙的钙盐或者天然钙制品， 例如乳清钙、 牛骨粉或鸡蛋壳的药物、 饮食品或饲料等。 还使 用包含此类钙制品以及具有钙吸收促进效果的物质， 例如酪蛋白磷肽或寡聚多糖的药物、 饮食品或饲料等来强化骨。 然而， 当摄取包含钙盐或天然钙制品的饮食品时钙吸收率为 50以下， 并且摄取的大部分钙可能排出体外而没有被吸收。 另外， 即使钙被吸收入体内， 由于对骨的亲和性可根据其形式或同时摄取的营养成分的类型而不同， 也未必显示骨代谢 改善效果或骨强化效果。 作为用于治疗骨质疏松或强化骨的药物已知雌激素制品、 活性维 生素D3制品、 维生素K2制品、 双膦酸盐制品和降钙素制品等， 并且还开发了新。
9、型药物例如抗 RANKL抗体。 然而， 这些药物可具有副作用例如耳鸣、 头痛或食欲不振。 另外， 从安全和成本 等观点， 目前上述物质处于不能将其添加到饮食品的状况。 因此， 已需要开发根据各种骨疾 病例如骨质疏松、 骨折和腰疼的性质， 可长期经口摄取， 通过促进骨形成和抑制骨吸收来增 加骨强度， 并且可期望具有预防或治疗各种骨疾病的效果的此类骨强化剂、 饮食品或饲料。 0004 存在几种意欲改善骨强度的食材， 例如， 已报道了源自乳的碱性蛋白质或其酶促 水解产物的肽级分显示成骨细胞增殖活性、 破骨细胞的骨吸收抑制活性， 以及由此的骨强 化作用(参见专利文献1)。 还已报道了包含在源自乳的碱性。
10、蛋白级分的血管生成素和乳过 氧化物酶独立地具有改善骨代谢的功能(参见专利文献24)。 0005 现有技术文献 0006 专利文献 0007 专利文献1JP-A-H08-151331 0008 专利文献2JP-A-H10-7585 说 明 书 1/10 页 3 CN 104507334 B 3 0009 专利文献3JP-A-2004-238320 0010 专利文献4JP-A-2005-60321 发明内容 0011 发明要解决的问题 0012 本发明的目的为提供新蛋白材料， 所述蛋白材料安全， 通过日常摄取促进成骨细 胞增殖， 同时抑制破骨细胞分化和破骨细胞的骨吸收， 因而可强化骨。 0013。
11、 本发明的另一目的为提供通过经口摄取用于预防和治疗各种骨疾病如骨质疏松 症、 骨折、 风湿病和关节炎的骨强化药物、 饮食品或饲料。 0014 用于解决问题的方案 0015 本发明人已发现， 有效促进成骨细胞增殖以及抑制破骨细胞分化和破骨细胞的骨 吸收的作用可通过摄取包含特定量血管生成素和/或血管生成素的水解产物， 并相对于血 管生成素和/或血管生成素的水解产物以特定的质量比进一步包含乳过氧化物酶和/或乳 过氧化物酶的水解产物的蛋白材料来获得。 该发现导致本发明的完成。 0016 具体地， 本发明包括以下方面： 0017 (1)一种蛋白材料， 其包含215mg/100mg的量的血管生成素和/或血。
12、管生成素的 水解产物， 以及以与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.320的乳过氧 化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物。 0018 (2)一种饮食品或饲料， 其包含根据(1)所述的蛋白材料。 0019 (3)一种骨强化剂， 其包含根据(1)所述的蛋白材料作为活性成分。 0020 (4)一种骨强化方法， 其包括以5mg/天以上的量摄取根据(1)所述的蛋白材料。 0021 (5)一种制备根据(1)所述的蛋白材料的方法， 其包括下列步骤1)3)： 0022 1)制备血管生成素和/或血管生成素的水解产物； 0023 2)制备乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物； 和 0024 3)混。
13、合根据上述2)所述的乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物以及根据 上述1)所述的血管生成素和/或血管生成素的水解产物， 以使乳过氧化物酶和/或乳过氧化 物酶的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.320。 0025 (6)一种制造根据(1)所述的蛋白材料的方法， 其包括从乳和/或源自乳的材料提 取包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的 水解产物的级分， 以使得乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物与血管生成素和/或 血管生成素的水解产物的质量比为0.320。 0026 (7)根据(6)所述的方法， 其进一步包括将包含于所述级分中。
14、的血管生成素和/或 乳过氧化物酶酶促水解的另外的步骤。 0027 发明的效果 0028 本发明的蛋白材料通过促进成骨细胞增殖以及抑制破骨细胞分化和破骨细胞的 骨吸收而显示显著地骨强化作用。 本发明的药物、 饮食品或饲料强化骨， 且用于预防和治疗 各种骨疾病， 如骨质疏松症、 骨折、 风湿病和关节炎。 具体实施方式 说 明 书 2/10 页 4 CN 104507334 B 4 0029 本发明的蛋白材料的特征在于， 该蛋白材料包括特定量的血管生成素和/或血管 生成素的水解产物， 并且相对于血管生成素和/或血管生成素的水解产物以特定质量比进 一步包含乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物。 0。
15、030 本发明的蛋白材料可为通过以特定质量比混合包含血管生成素和/或血管生成素 的水解产物的级分以及包含乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物的级分获得的混 合物， 或者通过从乳或源自乳的材料如脱脂乳或乳清等直接提取以特定质量比包含血管生 成素和/或血管生成素的水解产物以及乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物的级 分来制备的材料等。 本发明的蛋白材料还可包括通过酶促水解血管生成素和/或乳过氧化 物酶制备的材料。 0031 当通过混合包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物的级分以及包含乳过氧 化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物的级分来制备本发明的蛋白材料时， 由哺乳动物如 人、 奶牛、 。
16、水牛、 山羊或绵羊的乳制备的级分， 通过基因工程生产的级分， 或由血液或内脏器 官纯化的级分等可用作包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物的级分以及包含乳过 氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物的级分。 也可使用商购可得的纯化的血管生成素 或乳过氧化物酶试剂。 在该情况下， 本发明的蛋白材料可通过调整乳过氧化物酶和/或乳过 氧化物酶的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比来制备。 0032 使用一种以上的蛋白酶通过酶促水解上述包含血管生成素的级分、 血管生成素试 剂、 包含乳过氧化物酶的级分或乳过氧化物酶试剂等获得的产物可用作血管生成素的水解 产物或乳过氧化物酶的水解产物。 。
17、0033 当通过从乳或源自乳的材料如脱脂乳或乳清直接提取包含特定质量比的血管生 成素和/或血管生成素的水解产物以及乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物的级 分来制备本发明的蛋白材料时， 例如， 乳或源自乳的材料可与阳离子交换树脂相接触， 接着 吸附于树脂上的乳源蛋白可在0.12.0M的盐浓度下洗脱， 使用反渗透膜、 电透析膜、 超滤 膜或微滤膜等脱盐和浓缩， 之后任选地使用蛋白酶如胰蛋白酶、 胰酶、 胰凝乳蛋白酶、 胃蛋 白酶、 木瓜蛋白酶、 激肽释放酶、 组织蛋白酶、 嗜热菌蛋白酶或V8蛋白酶进行有限的水解至 8000以下的分子量。 当使用蛋白酶进行有限水解时， 优选分子量的下限为500。
18、以上。 由此获 得的蛋白材料可通过冷冻干燥或喷雾干燥等干燥。 0034 当使本发明的蛋白材料进行LC/MS/MS分析时， 在以常用方式使用消化酶于还原条 件下进行修饰和有限水解， 从而进行蛋白材料的蛋白质组分析， 之后， 证实蛋白材料包含至 少一种蛋白质， 例如 s1-酪蛋白、 s2-酪蛋白、 -酪蛋白或 -酪蛋白， 以及除了血管生成素 和/或血管生成素的水解产物以及乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物以外的其 蛋白水解产物。 0035 本发明的蛋白材料包含215mg/100mg的量的血管生成素和/或血管生成素的水 解产物， 并且相对于血管生成素和/或血管生成素的水解产物以0.320的质量。
19、比包含乳过 氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物。 0036 如下述试验例所示， 当乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物与血管生成 素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.320时， 骨强化作用可比单独摄取血管生成 素和/或血管生成素的水解产物或者乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物的情况 更有效地获得。 说 明 书 3/10 页 5 CN 104507334 B 5 0037 注意， 仅供参考， 在牛乳中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为约 0.001， 且在牛乳中乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物与血管生成素和/或血 管生成素的水解产物的质量比为约20。 在乳清蛋。
20、白浓缩物(WPC)中血管生成素和/或血管生 成素的水解产物的含量为约0.1， 且在乳清蛋白浓缩物中乳过氧化物酶和/或乳过氧化物 酶的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为约30。 0038 本发明的蛋白材料可通过适当添加蛋白材料作为活性成分而制备为骨强化剂。 本 发明的蛋白材料可直接用作骨强化剂。 当配制为骨强化剂时， 可混合通常用于药物、 饮食品 和饲料的原料等， 例如糖类、 脂质、 蛋白质、 维生素、 矿物质或风味剂， 并且还可以常用方式 配制成粉末状药物、 颗粒剂、 片剂、 胶囊剂或可饮用的制剂等。 本发明的蛋白材料可与也显 示骨强化作用的其它成分如钙、 维生素D、 维。
21、生素K或异黄酮一起使用。 0039 如下述动物实验所示， 当以5mg以上/kg体重的量经口摄取时本发明的蛋白材料可 强化骨。 由于该实验动物的摄取量对应于以血药浓度计的成人的摄取量(参见Mitsuyoshi Nakajima(1993), “Yakkou Hyoka Vol.8” ,Hirokawa-Shoten Ltd.,pp.2-18)， 期望获得骨 强化作用， 特别是可通过成人一人一日摄取5mg以上本发明的蛋白材料来预防或治疗各种 骨疾病如骨质疏松症、 骨折、 风湿病和关节炎。 因此， 当与骨强化剂等混合时， 蛋白材料可加 入其中以便摄入上述必要量。 0040 本发明的蛋白材料可加入普通。
22、饮食品， 例如酸奶、 饮料、 华夫饼(wafer)或甜点 (dessert)中。 在该情况下， 本发明的蛋白材料优选根据饮食品的形式以0.251000mg/ 100g饮食品的量添加。 期望骨强化作用可通过保持上述混合量来获得。 本发明的蛋白材料 还可加入饲料， 如牲畜饲料或宠物食品， 从而制备骨强化饲料。 在该情况下， 优选以0.25 1000mg/100g饲料的量添加本发明的蛋白材料。 0041 当以药物、 饮食品或饲料的形式制备并使用本发明的蛋白材料时， 本发明的蛋白 材料可通过悬浮或溶解于去离子水中并搅拌混合来使用。 搅拌/混合条件不特别限定， 只要 蛋白材料均匀混合即可。 还可使用超分。
23、散器或TK均质混合器等搅拌来混合。 0042 蛋白材料的溶液可任选使用反渗透膜等脱盐或浓缩， 或者冷冻干燥以使溶液可容 易用于药物、 饮食品或饲料。 0043 尤其证实了本发明的蛋白材料， 即使在蛋白材料进行在药物、 饮食品或饲料生产 中常用的灭菌处理时也维持骨强化活性。 当蛋白材料用作粉末时， 蛋白材料可进行干燥加 热灭菌。 本发明的蛋白材料可以以各种形式如液体、 凝胶、 粉末或颗粒用于药物、 饮食品或 饲料。 0044 下面借助参考例、 实施例和试验例进一步更加详细地描述本发明。 注意， 下列实施 例仅意于说明目的， 且不应理解为限定本发明。 0045 参考例1 0046 血管生成素级分的。
24、制备(1) 0047 填充有30kg阳离子交换树脂的柱(磺化Chitopearl； 由Fuji Spinning Co.,Ltd. 制造)用去离子水充分洗涤， 然后将1000升未灭菌的脱脂乳(pH6.7)施加到柱。 用去离子水 充分洗涤柱后， 吸附的蛋白质用线性梯度的0.12.0M氯化钠洗脱。 包含血管生成素的洗脱 级分使用S-琼脂糖阳离子交换层析(由Amersham Bioscientific制造)分级， 所得包含血管 生成素的级分在90下加热处理10分钟， 并离心除去沉淀。 包含血管生成素的级分进一步 说 明 书 4/10 页 6 CN 104507334 B 6 继续凝胶过滤层析(柱： 。
25、Superose 12)。 所得洗脱物使用反渗透膜脱盐， 并将脱盐的洗脱物 冷冻干燥， 从而获得16.5g的血管生成素级分， 其血管生成素纯度为90。 这些连续操作重 复30次。 0048 参考例2 0049 血管生成素级分的制备(2) 0050 填充有10kg肝素琼脂糖的柱(由GE Healthcare制造)用去离子水充分洗涤， 然后 将1000升未灭菌的脱脂乳(pH6.7)施加到柱。 用0.6M氯化钠溶液洗涤柱后， 吸附的蛋白质用 1.5M氯化钠溶液洗脱。 洗脱物使用反渗透膜脱盐， 并将脱盐的洗脱物冷冻干燥， 从而获得 32g的血管生成素级分， 其血管生成素纯度为2。 上述连续操作重复50。
26、次。 0051 参考例3 0052 乳过氧化物酶级分的制备 0053 填充有600g阳离子交换树脂(磺化Chitopearl， 由Fuji Spinning Co.,Ltd.制造) 的柱(直径： 5cm， 高度： 30cm)用去离子水充分洗涤， 然后将360升未灭菌的脱脂乳(pH6.7)以 25ml/分钟的流速施加到柱。 用去离子水充分洗涤柱后， 吸附的蛋白质用含有2.0M氯化钠的 0.02M碳酸盐缓冲液(pH 7.0)洗脱。 含有乳过氧化物酶的洗脱级分吸附在S-Sepharose FF 柱(由Amersham Bioscientific制造)上， 并用去离子水充分洗涤柱。 用10mM磷酸盐缓。
27、冲液 (pH 7.0)平衡后， 用02.0M线性梯度的氯化钠洗脱吸附的级分， 从而收集包含乳过氧化物 酶的级分。 该级分使用HiLoad 16/60 Superdex 75pg(由Amersham Bioscientific制造)进 行凝胶过滤色谱。 使用反渗透膜使获得的洗脱物脱盐， 并冷冻干燥脱盐的洗脱物以获得27g 乳过氧化物酶级分， 其乳过氧化物酶纯度为90。 重复这些连续操作25次。 0054 实施例1 0055 混合零点五九毫克(0.59mg)参考例1中获得的血管生成素、 98.58mg参考例2中获 得的血管生成素级分， 和0.83mg参考例3中获得的乳过氧化物酶级分， 从而制备蛋白。
28、材料 (实施例制品1)， 其中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为2.5mg/100mg， 乳过 氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质 量比为0.3。 0056 实施例2 0057 混合零点七三毫克(0.73mg)参考例1中获得的血管生成素、 92.33mg参考例2中获 得的血管生成素级分， 和6.94mg参考例3中获得的乳过氧化物酶级分， 从而制备蛋白材料 (实施例制品2)， 其中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为2.5mg/100mg， 乳过 氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质 量比为2。
29、.5。 0058 实施例3 0059 混合一点八三毫克(1.83mg)参考例1中获得的血管生成素、 42.61mg参考例2中获 得的血管生成素级分， 和55.56mg参考例3中获得的乳过氧化物酶级分， 从而制备蛋白材料 (实施例制品3)， 其中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为2.5mg/100mg， 乳过 氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质 量比为20。 0060 比较例1 说 明 书 5/10 页 7 CN 104507334 B 7 0061 混合零点五七毫克(0.57mg)参考例1中获得的血管生成素、 99.15mg参考例2中获 得。
30、的血管生成素级分， 和0.28mg参考例3中获得的乳过氧化物酶级分， 从而制备蛋白材料 (比较例制品1)， 其中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为2.5mg/100mg， 乳过 氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质 量比为0.1。 0062 比较例2 0063 混合二点零八毫克(2.08mg)参考例1中获得的血管生成素、 31.25mg参考例2中获 得的血管生成素级分， 和66.67mg参考例3中获得的乳过氧化物酶级分， 从而制备蛋白材料 (比较例制品2)， 其中血管生成素和/或血管生成素的水解产物的含量为2.5mg/100mg， 乳过 氧化。
31、物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质 量比为24。 0064 试验例1 0065 确定实施例制品13和比较例制品1和2的成骨细胞增殖效果、 破骨细胞的骨吸收 的抑制效果和破骨细胞分化的抑制效果。 0066 成骨细胞增殖效果如下所述确定。 成骨细胞的细胞系(MC3T3-E1)以2103细胞/ 孔的浓度接种于96孔细胞培养板上， 并使用增补有10胎牛血清(FBS)的 -MEM培养基(由 GIBCO制造)培养24小时。 培养基完全除去后， 将90 l的无FBS的 -MEM培养基， 和10 l的包含 实施例制品13和比较例制品1和2任一种的溶液添加至各孔。 细胞进。
32、一步培养24小时。 在 添加包含于细胞增殖试剂盒(Cell Proliferation Kit， 由GE Healthcare制造)的溴脱氧 尿苷(BrdU)之后， 将细胞培养2小时， 并与过氧化物酶标记的抗-BrdU抗体反应。 在添加3, 3 ,5,5 -四甲基联苯胺(底物)后， 成骨细胞增殖活性通过借助测定450nm下的吸光度测定 BrdU引入细胞的量来确定。 当450nm下的吸光度显著高于其中实施例制品13和比较例制 品1和2都不添加至培养基的组(对照)的450nm下的吸光度时， 成骨细胞增殖活性确定为阳 性。 0067 破骨细胞的骨吸收的抑制效果如下所述确定。 从兔(5日大)中取出胫骨。
33、和股骨。 除 去软组织后， 将这些骨机械切碎并将包含破骨细胞的全骨髓细胞分散于增补有5FBS的 - MEM培养基中， 接着以1106细胞/孔的浓度接种于结晶性磷酸钙板(由Corning制造)的孔 上。 在开始培养之后2小时完全除去培养基， 并将180 l的增补有5FBS的 -MEM培养基， 和 20 l的包含实施例制品13和比较例制品1和2任一种的溶液添加至各孔。 细胞培养72小 时。 通过添加5的次氯酸钠溶液除去细胞后， 使用立体显微镜拍摄形成于磷酸钙板的孔上 的吸收窝(pits)， 并通过图像分析测定其面积， 从而确定破骨细胞的骨吸收的抑制效果 (Takeshi Seno等，“Manual。
34、 of selected cultured cell lines for bioscience biotechnology” ,pp.199-200,1993)。 当窝面积显著小于其中实施例制品13和比较例制 品1和2都不添加至培养基的组(对照)的面积时， 对破骨细胞的骨吸收的抑制活性确定为阳 性。 0068 破骨细胞分化的抑制效果如下所述确定。 从ddy小鼠(7或8周大， 雄性)的股骨采集 的骨髓细胞以4104细胞/孔的浓度接种于96孔板上， 并在37和5CO2下在200 l增补有 10FBS和M-CSF(25ng/ml)的 -MEM培养基中培养。 在开始培养之后2小时完全除去培养基， 并将。
35、180 l的增补有10FBS、 RANKL(5ng/ml)和M-CSF(25ng/ml)的 -MEM培养基， 和20 l的 说 明 书 6/10 页 8 CN 104507334 B 8 包含实施例制品13和比较例制品1和2任一种的溶液添加至各孔， 并在37和5CO2的条 件下培养2天。 在更换培养基后， 细胞进一步培养1天。 在培养完成后， 除去培养液， 用PBS洗 涤， 并用丙酮-乙醇(1:1)溶液处理1分钟以固定细胞。 之后， 添加1.5mg/ml的对硝基苯基磷 酸二钠盐-20mM酒石酸钠-50mM柠檬酸缓冲液(pH 4.5)(100 l/孔)， 并室温下反应30分钟， 接着加入1M氢氧。
36、化钠溶液(50 l/孔)终止反应。 测量405nm下的吸光度， 并当作破骨细胞分 化/突变的指标。 当添加实施例制品13或比较例制品1或2的组的405nm下的吸光度显著低 于其中实施例制品13和比较例制品1和2都不添加至培养基的组(对照)的405nm下的吸光 度时， 对破骨细胞分化的抑制活性确定为阳性。 0069 结果示于表1。 0070 表1 0071 0072 如表1所示， 对应于本发明蛋白材料的实施例制品13在所有细胞测定中显示阳 性活性。 比较例制品1和2在某些细胞测定中也显示阳性活性， 但有一个细胞测定显示阴性 活性。 0073 实施例4 0074 填充有600g阳离子交换树脂(磺化。
37、Chitopearl， 由Fuji Spinning Co.,Ltd.制造) 的柱(直径： 5cm， 高度： 30cm)用去离子水充分洗涤， 并将40升未灭菌的脱脂乳(pH 6.7)以 25ml/min的流速施加到柱。 用去离子水充分洗涤后， 吸附于树脂上的蛋白质使用含有0.78M 氯化钠的0.02M碳酸盐缓冲液(pH 7.0)洗脱。 使用反向渗透膜脱盐洗脱物， 并冷冻干燥脱盐 的洗脱物以获得18g粉状蛋白材料(实施例制品4)。 蛋白材料包含2mg/100mg的血管生成素 和/或血管生成素的水解产物， 乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物与血管生成素 和/或血管生成素的水解产物的质量比为1。
38、8。 蛋白材料可直接用作骨强化剂或骨强化剂的 活性成分。 作为蛋白质组分析的结果， 发现蛋白材料包含 -酪蛋白的水解产物和 -酪蛋白 的水解产物。 0075 实施例5 0076 填充有30kg阳离子交换树脂(SP Toyopearl； 由Tosoh Corporation制造)的柱(直 径： 20cm， 高度： 100cm)用去离子水充分洗涤， 并将于75下加热灭菌15分钟的3t乳清(pH 6.2)以10l/min的流速施加到柱。 用去离子水充分洗涤后， 吸附于树脂上的蛋白质使用含 0.68M氯化钠的0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.7)洗脱。 使用反向渗透膜脱盐洗脱物， 并冷冻干燥 脱盐的洗脱。
39、物。 上述连续操作重复20次， 从而获得3.3kg粉末状蛋白材料(实施例制品5)。 蛋 白材料包含量为15mg/100mg的血管生成素和/或血管生成素的水解产物， 乳过氧化物酶和/ 或乳过氧化物酶的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.8。 蛋 白材料可直接用作骨强化剂或骨强化剂的活性成分。 作为蛋白质组分析的结果， 发现蛋白 材料包含 s1-酪蛋白和 -酪蛋白的水解产物。 说 明 书 7/10 页 9 CN 104507334 B 9 0077 实施例6 0078 四克(4g)实施例制品4的蛋白材料溶于800ml水中。 以0.02wt的终浓度添加胰酶 (由Sigma制造。
40、)(其为蛋白酶)后， 接着将混合物于37进行酶促处理8小时。 通过90热处 理5分钟使酶蛋白失活后， 将混合物冷冻干燥， 从而获得3.2g的蛋白材料(实施例制品6)。 由 此获得的蛋白材料包含量为2.0mg/100mg的血管生成素的水解产物， 乳过氧化物酶的水解 产物与血管生成素的水解产物的质量比为16， 蛋白材料的分子量为8000以下。 因此， 蛋白材 料可直接用作骨强化剂或骨强化剂的活性成分。 作为蛋白质组分析的结果， 发现蛋白材料 包含 -酪蛋白和 -酪蛋白的水解产物。 0079 实施例7 0080 四克(4g)实施例制品5的蛋白材料溶于800ml水中。 添加胰蛋白酶(由Sigma制造)。
41、 (其为蛋白酶)以获得0.03wt的终浓度之后， 将混合物于37进行酶促处理8小时。 通过90 热处理5分钟使酶蛋白失活后， 将混合物冷冻干燥， 从而获得3.0g的蛋白材料(实施例制 品7)。 由此获得的蛋白材料包含量为14mg/100mg的血管生成素的水解产物， 蛋白材料中乳 过氧化物酶的水解产物与血管生成素的水解产物的质量比为0.7， 且蛋白材料的分子量为 8000以下。 因此， 蛋白材料可直接用作骨强化剂或骨强化剂的活性成分。 作为蛋白质组分析 的结果， 发现蛋白材料包含 s1-酪蛋白和 -酪蛋白的水解产物。 0081 比较例3 0082 将十毫克(10mg)参考例3中获得的乳过氧化物酶。
42、级分和100mg实施例制品4的蛋白 材料混合， 从而制备蛋白材料(比较例制品3)， 其中血管生成素和/或血管生成素的水解产 物的含量为1.8mg/100mg， 乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物与血管生成素和/ 或血管生成素的水解产物的质量比为22.5。 0083 比较例4 0084 一克(1g)参考例1中获得的血管生成素级分和2g实施例制品5的蛋白材料混合并 溶解于800ml水中。 以0.02wt的终浓度添加胰蛋白酶(由Sigma制造)(其为蛋白酶)之后， 将混合物于37进行酶促处理12小时。 通过90热处理5分钟使酶蛋白失活后， 将混合物冷 冻干燥， 从而获得2.8g的蛋白材料(比较。
43、例制品4)。 由此获得的蛋白材料包含量为39mg/ 100mg的血管生成素的水解产物， 乳过氧化物酶的水解产物与血管生成素的水解产物的质 量比为0.2。 0085 比较例5 0086 填充有100g阳离子交换树脂(CM Sepharose FF； 由GE Healthcare制造)的柱(直 径： 5cm， 高度： 5cm)用去离子水充分洗涤， 并将40升未灭菌的脱脂乳(pH 6.7)以40ml/min的 流速施加到柱。 用去离子水充分洗涤后， 吸附于树脂上的蛋白质使用含0.98M氯化钠的 0.02M碳酸盐缓冲液(pH6.8)洗脱。 使用反向渗透膜脱盐洗脱物， 并冷冻干燥脱盐的洗脱物， 从而获得。
44、20g粉末状蛋白材料(比较例制品5)。 蛋白材料包含量为1.5mg/100mg的血管生成 素和/或血管生成素的水解产物， 乳过氧化物酶和/或乳过氧化物酶的水解产物与血管生成 素和/或血管生成素的水解产物的质量比为30。 0087 试验例2 0088 实施例制品4和5以及比较例制品3和5的各骨强化作用通过动物实验确定。 C3H/ HeJ小鼠(5周大， 雄性)用于动物实验。 1周适应环境后， 将小鼠分成五组(6只小鼠/组)。 小鼠 说 明 书 8/10 页 10 CN 104507334 B 10 使用管以每1kg体重5mg的量经口投予实施例制品4或5或者比较例制品3或5， 每日一次， 共4 周。。
45、 对照组不投予任何实施例制品4和5， 也不投予比较例制品3和5。 在完成投予后(第四 周)， 使用micro-CT(由Rigaku Corporation制造)测定各小鼠的右腔骨的骨密度。 结果示于 表2。 0089 表2 0090 骨密度(mg/cm3) 对照组130010 实施例制品4132711 实施例制品5133212 比较例制品3130110 比较例制品513049 0091 如表2所示， 经口投予为本发明蛋白材料的实施例制品4或5的组， 与对照组和经口 投予比较例制品3或5的组相比， 显示显著增加的骨密度。 0092 试验例3 0093 实施例制品6和7以及比较例制品4和5的各骨强。
46、化作用由动物实验确定。 四十八只 SD大鼠(51周大， 雌性)用于动物实验。 0094 将大鼠分成六组(8只大鼠/组)。 五组进行卵巢切除术， 并将剩余一组进行假手术 (sham surgery)。 在4周恢复期后， 进行卵巢切除术的大鼠使用管以每1kg大鼠体重5mg的量 经口投予实施例制品6或7或者比较例制品4或5， 每天一次， 共16周。 对照组不投予任何实施 例制品6和7以及比较例制品4和5。 4周恢复期后， 进行假手术的大鼠以与对照组相同的方式 喂食16周。 在完成投予后(第16周)， 使用micro-CT(由Rigaku Corporation制造)测定各大 鼠的右腔骨的骨密度。 结。
47、果示于表3。 0095 表3 0096 骨密度(mg/cm3) 对照组55110 假手术组6029 实施例制品659811 实施例制品759412 比较例制品455713 比较例制品555511 0097 如表3所示， 经口投予为本发明蛋白材料的实施例制品6或7的组， 与对照组和投予 比较例制品4或5的组相比， 显示显著增加的骨密度。 此外， 骨密度接近假手术组的骨密度。 0098 实施例8 0099 骨强化液态营养增补剂的制备 0100 五克(5g)实施例制品4的蛋白材料溶于4995g去离子水中。 使用TK-均质混合器(TK ROBO MICS； 由Tokushu Kika Kogyo co。
48、.,ltd.制造)在6000rpm下搅拌溶液30分钟， 从而获 得包含100mg/100g的量的实施例制品4的溶液。 接着， 向5.0kg溶液添加4.0kg酪蛋白、 5.0kg 说 明 书 9/10 页 11 CN 104507334 B 11 大豆蛋白、 1.0kg鱼油、 3.0kg紫苏子油、 18.0kg糊精、 6.0kg矿物质混合物、 1.95kg维生素混 合物、 2.0kg乳化剂、 4.0kg稳定化剂和0.05kg香精。 将混合物装入蒸煮袋(retort pouch) (200ml)中并使用灭菌釜(retort sterilizer)(1类压力容器， RCS-4CRTGN； 由Hisaka Works,Ltd.制造)在121下灭菌20分钟， 从而生产50kg的骨强化液态营养增补剂。 未观察 到任何沉淀， 并且在由此获得的骨强化液态营养组合物中没有感觉到异常风味。 0101 实施例9 0102 骨强化凝胶样食品的制备 0103 两克(2g)实施例制品5的蛋白材料溶于708g去离子水中。 使用超分散器(ULTRA- TURRAX T-25； 由IKA Japan制造)在9500rpm下搅拌溶液30分钟。 将40g山梨糖醇、 2g酸味剂、 2g香精、 5g果胶、 5g乳清蛋白浓缩物、 。