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1、(10)授权公告号 CN 102668979 B (45)授权公告日 2014.05.21 CN 102668979 B (21)申请号 201210005972.0 (22)申请日 2012.01.10 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 河南科技大学 地址 471003 河南省洛阳市涧西区西苑路 48 号 (72)发明人 周洲 李永丽 崔林开 胡艳红 范晶超 卢伟 (74)专利代理机构 郑州睿信知识产权代理有限 公司 41119 代理人 牛爱周 CN 101715731 A,2010.06.02,说明书第2页 实施例 1. CN 1299586 A,2001.06.20。
2、, 全文 . CN 101341853 A,2009.01.14, 全文 . CN 102293150 A,2011.12.28, 全文 . CN 101695279 A,2010.04.21, 全文 . CN 101836577 A,2010.09.22, 全文 . CN 101836589 A,2010.09.22, 全文 . 卢慧颖等 . 山杨组织培养苗瓶外生根技术的 研究 .黑龙江生态工程职业学院学报 .2011, 第 24 卷 ( 第 3 期 ), 第 22 页左栏 “1 材料与方法” 段 . 卢慧颖等 . 山杨组织培养苗瓶外生根技术的 研究 .黑龙江生态工程职业学院学报 .2011。
3、, 第 24 卷 ( 第 3 期 ), 第 22 页左栏 “1 材料与方法” 段 . (54) 发明名称 一种杨树组培苗生根培养方法 (57) 摘要 本发明涉及一种杨树组培苗生根培养方法， 包括以下步骤 ： 以蛭石为基质， 自来水漂洗 2 次后 晾干备用， 在透光培养瓶中铺蛭石厚度 2-3cm， 添 加蛭石 1-2 倍质量的营养液， 选择 3-5cm 高状态 较一致的抽茎苗用以生根， 每种培养基质处理接 种 50 株， 单株单瓶培养， 30d 后统计各处理的生 根率 ； 无菌苗生长至高 7cm 左右时， 于日光温室 中， 连同根部粘连的部分蛭石取出小苗， 移入含水 量 60 -75的营养土中，。
4、 压紧营养土， 喷水， 盖 塑料薄膜保湿 7d， 后逐渐掀开薄膜， 20d 后观察生 根。本发明的生根方法， 以蛭石提供支撑作用， 仅 添加 1/2MS 或 MS， 配制方便， 降低了成本， 由于不 含糖类物质， 杂菌不宜滋生， 基质透气性能优良， 生根健康， 生根苗继代培养或移栽成功率高。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 夏文静 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102668979 B CN 102668979 B 1/1 页 2 1. 一。
5、种杨树组培苗生根培养方法， 其特征在于 ： 包括下列步骤 ： 以市售粒径1-3mm的蛭石为基质， 自来水漂洗2次后晾干备用， 在玻璃或塑料透光培养 瓶中铺蛭石厚度 2-3cm， 添加蛭石 1-2 倍质量的营养液， 营养液为 MS 或 1/2MS， 营养液添加 植物生长调节物质萘乙酸、 吲哚丁酸、 吲哚乙酸 0.01-0.05mgL-1， pH 值为 6.5 ； 选择 3-5cm 高状态较一致的抽茎苗用以生根， 每种培养基质处理接种 50 株， 单株单瓶培养， 30d 后统计 各处理的生根率 ； 无菌苗生长至高 7cm 左右时， 于日光温室中， 用镊子连同根部粘连的部分 蛭石取出小苗， 移入含水。
6、量 70左右的营养土中， 稍压紧营养土， 喷少量水， 盖塑料薄膜保 湿 7d， 后逐渐掀开薄膜， 20d 后统计生根苗移栽成活结果 ； MS 营养液配方 ： NH4NO31650mgL-1、 KNO31900mgL-1、 MgSO47H2O370mgL-1、 KH2PO4170mgL-1、 CaCl22H2O440mgL-1、 H3BO36.2mgL-1、 MnSO44H2O22.3mgL-1、 CoCl26H2O0.025mgL -1、CuSO 45H2O0.025mgL -1、ZnSO 47H2O8.6mgL -1、 Na2MoO4 2H2O0.25mg L-1、 KI0.83mg L-1。
7、、 FeSO4 7H2O27.8mg L-1、 Na2EDTA 2H2O37.3mg L-1、 维生素 B10.1mgL-1、 维生素 B60.5mgL-1、 烟酸 0.5mgL-1、 肌醇 100mgL-1、 甘氨酸 2mgL-1； 营养土为泥炭土和蛭石， 两者的体积比为泥炭土蛭石 3 1 ； 其中， 所述杨树为 107 杨时， 在培养液 1/2MS+ 吲哚乙酸 0.02mgL-1+ 吲哚丁酸 0.02mg L-1时生根率最高， 生根率达 100% ； 或者， 当所述杨树为 108 杨时， 在营养液为 MS 添 加吲哚乙酸 0.05mgL-1后， 生根率 95%。 权 利 要 求 书 CN 。
8、102668979 B 2 1/5 页 3 一种杨树组培苗生根培养方法 技术领域 0001 本发明涉及一种杨树的生根方法， 尤其涉及一种杨树组培苗生根培养方法， 属于 植物培养技术领域。 背景技术 0002 杨树是世界范围内广泛分布的一种重要树种， 有重要的经济、 生态和社会效益。 杨 树具有生长迅速、 轮伐期短、 适应性强、 易繁殖等特点， 各地广泛用作用材林、 防护林和四旁 绿化树种。杨树组织培养的意义主要表现在以下几个方面 ： 0003 首先， 难生根的树种能够通过组织培养进行大量繁殖。 例如白杨派树种， 因根蘖繁 殖率低、 扦插生根难不能使用扦插进行大量繁殖， 但通过组织培养可以在短期。
9、内获得大量 组培苗 ； 0004 其次， 保存种质资源及选育杨树优良品种。杨树优良种质资源可通过愈伤组织及 组培苗的形式进行长期保存 ； 在组织培养的再生植株中选择突变体及通过体细胞杂交选择 新品种都是杨树良种选育的有效途径 ； 0005 再次， 杨树组织培养体系可作为一种模式体系， 来分析种质保存、 体细胞变异和基 因转移等方面存在的问题 ； 0006 最后， 杨树是木本植物的模式物种， 对研究外源基因转化木本植物具有重要的意 义。分布广泛、 容易进行离体实验和受土壤农杆菌的侵染使杨属植物成为转基因树木研究 的基础试验材料。 0007 在已有多个杨树品种成功的再生研究报道中， 其生根培养过程。
10、都是在生根培养基 中进行 ； 生根培养基需要添加琼脂起到支撑作用， 其中添加蔗糖作为碳源， 1/2MS 或 MS 提供 多种元素需求。由于以糖类物质做为培养基， 易滋生杂菌， 另外基质透气性不太好， 从而影 响到生根菌继代培养和移栽的成功率。 发明内容 0008 本发明的目的在于提供一种杨树组培苗生根培养方法， 以提高生根率和移栽的成 功率。 0009 为了实现上述目的， 本发明的技术方案采用了一种杨树组培苗生根培养方法， 具 体包括以下步骤 ： 以蛭石为基质， 自来水漂洗 2 次后晾干备用， 在玻璃或塑料透光培养瓶中 铺蛭石厚度 2-3cm， 添加蛭石 1-2 倍质量的营养液， 选择 3-5。
11、cm 高状态较一致的抽茎苗用 以生根， 每种培养基质处理接种 50 株， 单株单瓶培养， 30d 后统计各处理的生根率 ； 无菌苗 生长至高 5-8cm 时， 于日光温室中， 用镊子连同根部粘连的部分蛭石取出小苗， 移入含水量 70左右的营养土中， 压紧营养土， 喷水， 盖塑料薄膜保湿 7d， 后逐渐掀开薄膜， 20d 后统计 生根苗移栽成活结果。 0010 所述的蛭石粒径为 1-3mm。 0011 所 述 的 抽 茎 苗 为 欧 美 杨 108(Populuseuramercana cv.Guariento )， 欧 说 明 书 CN 102668979 B 3 2/5 页 4 美 杨 20。
12、01(Populuseuramercana cv.2001 )，欧 美 杨 107(Populuseuramercana cv.Neva )， 由河南科技大学林学院实验中心保存 ； 取三个杨树品种的幼嫩新枝， 以茎段、 叶柄和叶片为外植体， 分别剪成 0.5-1.5cm 的短段， 嫩叶横向深达主脉剪 3 道伤口， 接种在 丛生芽诱导培养基上， 经过丛生芽的诱导、 丛生芽的抽茎生长及壮苗阶段， 得到高 2-5cm 的 健康丛生芽， 培养温度 24-26， 光照时间 16hd-1， 光照度 2000lx。 0012 所述的丛生芽诱导培养基为 MS+TDZ 0.05mg.L-1+6-BA 0.05m。
13、g.L-1+NAA0.05mg. L-1。 0013 所述的营养液为 MS 或 1/2MS。 0014 所述的营养液中还添加植物生长调节物质萘乙酸 (NAA)、 吲哚丁酸 (IBA)、 吲哚乙 酸 (IAA)0.01-0.05mg.L-1， pH 值为 6.5。 0015 所述 MS 营养液配方 ： NH4NO31650mg.L-1、 KNO31900mg.L-1、 MgSO4.7H2O 370mg.L-1、 KH2PO4170mg.L-1、 CaCl2.2H2O 440mg.L-1、 H3BO36.2mg.L-1、 MnSO4.4H2O 22.3mg.L-1、 CoCl2.6H2O 0.02。
14、5mg.L-1、 CuSO4.5H2O 0.025mg.L-1、 ZnSO4.7H2O 8.6mg.L-1、 Na2MoO4.2H2O 0.25mg.L-1、 KI 0.83mg.L-1、 FeSO4.7H2O 27.8mg.L-1、 Na2EDTA.2H2O 37.3mg.L-1、 维生素 B1 0.1mg.L-1、 维生素 B60.5mg.L-1、 烟酸 0.5mg.L-1、 肌醇 100mg.L-1、 甘氨酸 2mg.L-1。 0016 所述的营养土为泥炭土和蛭石， 两者的重量比为泥炭土蛭石 3 1。 0017 采用本发明的方法， 以三种黑杨派杨树组培苗的生长为例， 三者都可以健康生根 。
15、生长成活生根率都在 70以上， 欧美杨 107(Populuseuramercana cv.Neva ) 杨生根 率最高达 100， 欧美杨 108(Populuseuramercana cv.Guariento ) 杨生根率最高达 95， 欧美杨 2001(Populuseuramercana cv.2001 ) 杨生根率最高达 90； 另外， 采用 本发明的营养土 ( 泥炭土蛭石为 3 1) 后能够健康生长， 20d 后生根苗移栽成活率都在 95以上， 107 杨、 108 杨、 2001 杨移栽成活率分别为 98。本发明的生根方法， 以蛭石提供 支撑作用， 仅添加 1/2MS 或 MS，。
16、 与常规生根培养基相比， 配制方便， 降低了成本， 由于不含糖 类物质， 杂菌不宜滋生， 基质透气性能优良， 生根健康， 生根苗继代培养或移栽成功率高。 附图说明 0018 图 1 为三种黑杨派杨树不定芽的生根图片 ； 0019 图1a为107杨生根无菌苗的生长情况 ； 图1b为108杨生根无菌苗的生长情况 ； 图 1c 为 2001 杨生根无菌苗的生长情况 ； 0020 图 2 为三种黑杨派杨树无菌苗的移栽图片 ； 0021 图 2a 为 107 杨移栽苗 ； 图 2b 为 108 杨移栽苗 ； 图 2c 为 2001 杨移栽苗。 具体实施方式 0022 本发明的方法如下 ： 0023 材料。
17、与方法 0024 1.1 材料与培养条件 0025 1.2 方法以市售粒径 1-3mm 的蛭石为基质， 自来水漂洗 2 次后晾干备用， 在玻 璃或塑料透光培养瓶中铺蛭石厚度 2-3cm， 添加蛭石 1-2 倍质量的营养液， 营养液为 MS 或 1/2MS， 营养液可添加植物生长调节物质萘乙酸 (NAA)、 吲哚丁酸 (IBA)、 吲哚乙酸 说 明 书 CN 102668979 B 4 3/5 页 5 (IAA)0.01-0.05mg.L-1， pH 值为 6.5。选择 3-5cm 高状态较一致的抽茎苗用以生根， 每种培 养基质处理接种50株， 单株单瓶培养， 30d后统计各处理的生根率。 无菌。
18、苗生长至高7cm左 右时， 于日光温室中， 用镊子连同根部粘连的部分蛭石取出小苗， 移入含水量 70左右的营 养土 ( 泥炭土蛭石为 3 1) 中， 稍压紧营养土， 喷少量水， 盖塑料薄膜保湿 7d， 后逐渐掀 开薄膜， 20d 后统计生根苗移栽成活结果。 0026 以蛭石为基质， 自来水漂洗 2 次后晾干备用， 在玻璃或塑料透光培养瓶中铺蛭石 厚度 2-3cm， 添加蛭石 1-2 倍质量的营养液， 选择 3-5cm 高状态较一致的抽茎苗用以生根， 每种培养基质处理接种 50 株， 单株单瓶培养， 30d 后统计各处理的生根率 ； 无菌苗生长至高 7cm 左右时， 于日光温室中， 用镊子连同根。
19、部粘连的部分蛭石取出小苗， 移入含水量 70左 右的营养土中， 压紧营养土， 喷水， 盖塑料薄膜保湿 7d， 后逐渐掀开薄膜， 20d 后统计生根苗 移栽成活结果。 0027 其中， 蛭石粒径为 1-3mm。 0028 所述的丛生芽诱导培养基为 MS+TDZ 0.05mg.L-1+6-BA 0.05mg.L-1+NAA 0.05mg. L-1。 0029 营养液为MS或1/2MS， 营养液中还添加植物生长调节物质萘乙酸(NAA)、 吲哚丁酸 (IBA)、 吲哚乙酸 (IAA)0.01-0.05mg.L-1， pH 值为 6.5。MS 营养液配方 ： NH4NO31650mg.L-1、 KNO3。
20、1900mg.L-1、 MgSO4.7H2O 370mg.L-1、 KH2PO4170mg.L-1、 CaCl2.2H2O440mg.L-1、 H3BO36.2mg. L-1、 MnSO4.4H2O 22.3mg.L-1、 CoCl2.6H2O 0.025mg.L-1、 CuSO4.5H2O 0.025mg.L-1、 ZnSO4.7H2O 8.6mg.L-1、 Na2MoO4.2H2O 0.25mg.L-1、 KI 0.83mg.L-1、 FeSO4.7H2O 27.8mg.L-1、 Na2EDTA.2H2O 37.3mg.L-1、 维生素 B1 0.1mg.L-1、 维生素 B60.5mg.。
21、L-1、 烟酸 0.5mg.L-1、 肌醇 100mg.L-1、 甘氨 酸 2mg.L-1。 0030 营养土为泥炭土和蛭石， 两者的体积比为泥炭土蛭石 3 1。 0031 2 结果与分析 0032 在本生根培养条件下， 供试三种黑杨派杨树组培苗都可以健康生根生长成活 ( 图 1)， 生根率都在 70以上， 107 杨生根率最高达 100， 108 杨生根率最高达 95， 2001 杨生 根率最高达 90。 0033 107 杨在营养液为 MS 时， 生根率 70 ； 植物生长调节物质对试管苗生根有促进作 用， 添加 IAA 0.05g.L-1后， 营养液为 1/2MS 时比 MS 生根率高，。
22、 降低培养基质中离子浓度有 利生根 ； 在培养液1/2MS+IAA 0.02g.L-1+IBA 0.02g.L-1时生根率最高， 生根率达100(表 1)。 0034 表 1107 杨不定芽生根率 0035 说 明 书 CN 102668979 B 5 4/5 页 6 0036 108 杨在营养液为 MS 时生根率 85， 添加 IAA 0.05g.L-1后生根率 95， 植物生 长调节物质对试管苗生根有促进作用 ； 营养液为 1/2MS 时， 分别添加 NAA 0.05g.L-1、 IAA 0.05g.L-1或IBA 0.05g.L-1后， 或IAA 0.02g.L-1+IBA 0.02g.。
23、L-1时， 生根率最高仅90， 108 杨生根过程更适应较高的离子浓度， 营养丰富的体系促进其生根 ( 表 2)。 0037 表 2108 杨不定芽生根率 0038 0039 2001 杨在营养液为 MS 时生根率 70， 添加 IAA 0.05g.L-1后生根率没有变化 ； 营 养液为 1/2MS 时， 分别添加 NAA 0.05g.L-1、 IAA 0.05g.L-1或 IBA 0.05g.L-1后， 生根率有所 提高， 分别为 75、 85和 78， 植物生长调节物质对生根表现出促进作用 ； 当 NAA 0.02g. L-1+IBA 0.02g.L-1时， 生根率最高达 90， 2001。
24、 杨生根过程要求较低的离子浓度 ( 表 3)。 0040 表 32001 杨不定芽生根率 说 明 书 CN 102668979 B 6 5/5 页 7 0041 0042 生长至 7cm 左右高的无菌苗， 于日光温室中移栽营养土 ( 泥炭土蛭石为 3 1) 后能够健康生长 ( 图 2)， 20d 后生根苗移栽成活率都在 95以上， 107 杨、 108 杨、 2001 杨移 栽成活率分别为 98、 99、 95。 0043 3 结论与讨论 0044 以蛭石提供支撑作用， 仅添加 1/2MS 或 MS， 与常规生根培养基相比， 配制方便， 降 低了成本， 由于不含糖类物质， 杂菌不宜滋生， 基质透气性能优良， 生根健康， 生根苗继代培 养或移栽成功率高。 说 明 书 CN 102668979 B 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102668979 B 8 。