对西花蓟马进行RNA干扰的方法及装置.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810986896.3 (22)申请日 2018.08.28 (71)申请人 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 吴青君 袁江江 万岩然 郑晓斌 (74)专利代理机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 11129 代理人 吴泳历 (51)Int.Cl. A01K 67/033(2006.01) C12M 1/24(2006.01) (54)发明名称 对西花蓟马进行RNA干扰的方法及装置 (57)摘要 本发明公。

2、开了一种西花蓟马进行RNA干扰的 方法及装置， 包括： 以花粉为人工饲料， 将根据靶 标干扰基因的序列设计和合成的dsRNA混入花粉 溶液中作为饲喂液饲养西花蓟马试虫； 所述RNAi 管包含顶部开口的管体， 与顶部开口配合的可开 合管盖， 所述管体上设置200-230目的网眼结构 的若干透气孔， 所述管盖上设置有直径为0.3- 0.7cm的加样孔。 本发明公开的对西花蓟马进行 RNA干扰的方法及装置能够对虫体较小的西花蓟 马进行有效的RNA干扰， 实验数据显示， 其干扰效 率达到80左右； 解决了较小的虫体进行注射法 进行RNA干扰死亡率高的问题， 同时合成的dsRNA 能够有效对西花蓟马进行。

3、RNA干扰， 为今后进一 步克服西花蓟马的虫害的工作打下了基础。 权利要求书1页 说明书7页 序列表5页 附图1页 CN 109077028 A 2018.12.25 CN 109077028 A 1.一种对西花蓟马进行RNA干扰的方法， 其特征在于包括如下步骤： 以花粉为人工饲料， 将根据靶标干扰基因的序列设计和合成的dsRNA混入花粉溶液中 作为饲喂液饲养西花蓟马试虫； 在具有以下结构特点的RNAi管中进行所述饲养： 所述RNAi管包含顶部开口的管体， 与顶部开口配合的可开合管盖， 所述管体上设置 200-230目的网眼结构的若干透气孔， 所述管盖上设置有直径为0.3-0.7cm的加样孔；。

4、 饲养步骤如下： (1)取西花蓟马成虫置于所述RNAi管中， 然后用拉薄的封口膜覆盖所述顶部开口， 盖上 管盖； (2)从所述加样孔将所述饲喂液加到所述拉薄的封口膜上， 然后采用封口膜封闭所述 加样孔； (3)对所述RNAi管下部进行遮光饲养， 近顶部开口部位保持透光； 西花蓟马由于趋光性爬向顶部开口处， 通过其锉吸式口器， 刺过封口膜吸取所述饲喂 液。 2.根据权利要求1所述方法， 其特征在于： 所述RNAi管为5ml离心管， 在距底部1cm处平整切掉底部， 用具有200-230目网眼的纱网 封底作为所述若干透气孔， 在管盖上钻孔形成所述加样孔制成。 3.根据权利要求1所述方法， 其特征在于。

5、： 所述饲喂液中dsRNA的终浓度为400-500ng/ l， 花粉浓度为重量体积百分比8-15。 4.根据权利要求2所述方法， 其特征在于： 所述饲喂液的加样量为200ul， 持续饲养时间 为12-36小时。 5.根据权利要求1所述方法， 其特征在于： 饲养温度为25。 6.根据权利要求1-5任一所述的方法， 其特征在于： 所述dsRNA是基于西花蓟马65852基 因设计的dsRNA1， dsRNA2或dsRNA3， 所述dsRNA1的特异性片段序列为SEQ ID No.1， 所述 dsRNA2的特异性片段序列为SEQ ID No.2， 所述dsRNA3的特异性片段序列为SEQ ID No.。

6、3。 7.用于西花蓟马的RNAi管， 其特征在于： 所述RNAi管包含顶部开口的管体， 与顶部开口 配合的可开合管盖， 所述管体上设置网眼结构的若干透气孔， 所述管盖上设置有加样孔。 8.根据权利要求7所述RNAi管， 其特征在于， 所述网眼结构为200-230目。 9.根据权利要求7所述RNAi管， 其特征在于， 所述加样孔直径为0.3-0.7cm。 10.根据权利要求79所述RNAi管， 其特征在于， 所述RNAi管为5ml离心管， 在距底部 1cm处平整切掉底部， 用具有200-230目网眼的纱网封底作为所述若干透气孔， 在管盖上钻 孔形成所述加样孔而制成。 权 利 要 求 书 1/1 。

7、页 2 CN 109077028 A 2 对西花蓟马进行RNA干扰的方法及装置 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及对西花蓟马进行RNA干扰的方法及装置。 背景技术 0002 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由外源导入到细胞当中的双链RNA 引发的 特定基因转录后的沉默现象(Andrew Fire.1998),是近年来分子生物学领域的一项重大发 现。 最早由Guo等(1995)利用反义RNA技术研究秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans) 的par1基因功能时， 发现了基因沉默现象， 在此之后Fire等(1998)详细阐述了造成。

8、这种现 象的原因是在制备正义/反义RNA时混入了少量的双链RNA(dsRNA)引起的， 并将此现象称为 RNA干扰。 0003 昆虫的RNAi干扰方法， 目前报道的有注射、 浸泡、 饲喂、 转基因和病毒介导等， 这些 干扰方法各有优缺点， 根据不同种昆虫选择合适的dsRNA导入方法是成功实现昆虫RNAi的 关键。 例如Dzitoyeva(2001)将体外合成的微量的长dsRNA显微注射到昆虫果蝇体腔内成功 导致lacZ基因和nrf基因mRNA含量降低， 但是步骤较为繁琐， 而且注射压力以及由于注射造 成的伤口不可避免地影响到昆虫正常的生理活动， 而且采取此种方法会导致受试昆虫死亡 率升高。 E。

9、aton等(2002)发现将果蝇胚胎浸泡在dsRNA溶液中， 可以有效抑制基因的表达， 但 是只适用于那些容易从溶液中吸收dsRNA的特殊昆虫细胞组织和特定发育阶段的昆虫。 使 用转基因技术对昆虫进行RNAi首先被应用于果蝇上(Kennerdell and Carthew,2000)， 其 后又被广泛应用于埃及伊蚊和家蚕的基因功能研究中(Travanty et al,.2004； Sandrelli et al,.2007)， 但是这种方法会得到转基因昆虫， 而且转基因方法试验周期较长， 过程较繁 琐饲喂dsRNA是一种自然输入方式， 对昆虫造成的侵害较小， 不影响其他基因的表达。 目前 已在。

10、半翅目、 鞘翅目和鳞翅目多种昆虫中取得成功(Baum et al,.2007； Mao et al, .2007)。 0004 西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)属缨翅目Thysanoptera， 蓟马 科Thripidae。 关于西花蓟马的功能基因的研究仍然处于起步阶段， Rotenberg等(2015)采 用注射的方法将体外合成的V-ATPase-B dsRNA注射到西花蓟马雌虫体内， 显著降低了其相 关蛋白的含量， 但是西花蓟马虫体小， 对其损伤很大， 效率很低， 而且注射方法的操作性较 差。 为了研究西花蓟马相关基因功能， 有必要探索如何对。

11、其进行可行高效的基因沉默。 发明内容 0005 本发明建立了一种高效可行的西花蓟马RNA干扰方法。 0006 采用以下技术方案： 0007 一种对西花蓟马进行RNA干扰的方法， 其特征在于包括如下步骤： 0008 以花粉为人工饲料， 将根据靶标干扰基因的序列设计和合成的dsRNA混入花粉溶 液中作为饲喂液饲养西花蓟马试虫； 0009 在具有以下结构特点的RNAi管中进行所述饲养： 说 明 书 1/7 页 3 CN 109077028 A 3 0010 所述RNAi管包含顶部开口的管体， 与顶部开口配合的可开合管盖， 所述管体上设 置200-230目的网眼结构的若干透气孔， 所述管盖上设置有直径。

12、为0.3-0.7cm的加样孔； 0011 饲养步骤如下： 0012 (1)取西花蓟马成虫置于所述RNAi管中， 然后用拉薄的封口膜覆盖所述顶部开口， 盖上管盖； 0013 (2)从所述加样孔将所述饲喂液加到所述拉薄的封口膜上， 然后采用封口膜封闭 所述加样孔； 0014 (3)对所述RNAi管下部进行遮光饲养， 近顶部开口部位保持透光； 0015 西花蓟马由于趋光性爬向顶部开口处， 通过其锉吸式口器， 刺过封口膜吸取所述 饲喂液。 0016 所述RNAi管为5ml离心管， 在距底部1cm处平整切掉底部， 用具有200-230目网眼的 纱网封底作为所述若干透气孔， 在管盖上钻孔形成所述加样孔制成。

13、。 0017 所述饲喂液中dsRNA的终浓度为400-500ng/ l， 花粉浓度为重量体积百分比8- 15。 0018 所述饲喂液的加样量为200ul， 持续饲养时间为12-36小时。 0019 饲养温度为25。 0020 所述dsRNA是基于西花蓟马65852基因设计的dsRNA1， dsRNA2或dsRNA3， 所述 dsRNA1的特异性片段序列为SEQ ID No.1， 所述dsRNA2的特异性片段序列为SEQ ID No.2， 所述dsRNA3的特异性片段序列为SEQ ID No.3。 0021 所述RNAi管包含顶部开口的管体， 与顶部开口配合的可开合管盖， 所述管体上设 置网眼结。

14、构的若干透气孔， 所述管盖上设置有加样孔。 0022 所述网眼结构为200-230目。 0023 所述加样孔直径为0.3-0.7cm。 0024 所述RNAi管为5ml离心管， 在距底部1cm处平整切掉底部， 用具有200-230目网眼的 纱网封底作为所述若干透气孔， 在管盖上钻孔形成所述加样孔而制成。 0025 本发明的贡献在于， 建立了基于饲喂方式的西花蓟马RNA干扰方法。 现有技术中， 西花蓟马的人工饲养饲料通常采用芸豆豆荚、 甜椒等植物材料作为西花蓟马人工饲养的饲 料和寄主(如CN102640729B中0003段记载)， 或者采用人工培养的嫩苗作为人工饲养的饲 料和寄主。 现有人工饲养。

15、方式和人工饲料不适合饲喂方式进行西花蓟马RNA干扰。 虽然饲喂 方式进行RNA干扰在其它昆虫中成功实现， 但是由于未找到适合于进行RNA干扰的西花蓟马 人工饲料， 以及人工饲喂方式， 因此， 本领域技术在通过RNA干扰/基因沉默的方式研究西花 蓟马功能基因方面鲜有进展。 0026 本发明地采用花粉作为西花蓟马的人工饲料， 设计了特殊结构的RNA干扰装置， 满 足西花蓟马的生物习性和营养需求， 不影响其存活率， 并利用其生物习性和身体特点， 饲喂 特定浓度比例的混合花粉和dsRNA的饲喂液， 实验数据显示， 选取的3条ds RNA干扰效率依 次达到64， 76和80,说明本发明的方法有效解决了较。

16、小虫体进行注射法进行RNA干扰 死亡率高的问题， 同时合成的dsRNA能够有效对西花蓟马进行RNA干扰， 为今后进一步克服 西花蓟马的虫害的工作打下了基础。 说 明 书 2/7 页 4 CN 109077028 A 4 附图说明 0027 图1对西花蓟马进行RNA干扰的装置示意图 0028 图2西花蓟马取食饲喂液后不同时间段内65852基因相对表达量 0029 1-管体， 2-网眼结构， 3-管盖， 4-封口膜， 5-加样孔。 具体实施方式 0030 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明， 但并不意味着限制， 仅作为示例 说明。 0031 实验生物材料及试剂： 0032 西花蓟马： 多杀菌。

17、素抗性品系(Spin-R),申请人单位有保存和饲养， 声明自申请日 起20年可向公众发放用于验证实验。 . 0033 油菜花花粉： 购自中国农业科学院南门蜂蜜店； 0034 PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit， 购自TaKaRa公司； 0035 PROMEGA dsRNA合成试剂盒， 购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司； 0036 FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)， 购自天根生化科技(北京)有限公司。 0037 一、 西花蓟马65852基因的生物信息学分析 0038 首先在西花蓟马转录组注释文件中发现在。

18、ivf03(敏感)和NIL-R(近等基因系抗 性)种群中表达量差异较大的基因id5302， 然后将该序列在unigene库中进行本地blast找 到cds序列， 该cds序列名为comp65852_c0， 该cds序列为SEQ ID No.4， 利用该序列设计特异 性引物进行克隆测序。 0039 二、 合成dsRNA的过程 0040 1、 引物设计 0041 通过果蝇基因中的siRNA结合位点网站http:/www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_ find_primers.pl设计西花蓟马65852基因(西花蓟马65852基因的测序结果见SEQ ID No.5)的dsRNA。

19、引物， 具体合成步骤如下： 0042 (1)将比对后的测序结果复制到在ORF Finder中预测ORF区域， 并将该ORF区域输 入到http:/www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl网站中， 选择产物长度在 300-600bp之间， 点击Finder Primers For These Sequences筛选出Pair Penalty较低的 三对引物。 0043 ( 2 ) 分 别 在 三 对 引 物 的 上 下 游 引 物 的 5端 添 加 T 7 启 动 子 序 列 - TAATACGACTATAGGG-， 分别将三对引物命名为ds1、 。

20、ds2、 ds3， 如下表所示。 0044 表1实验所用dsRNA1， dsRNA2和dsRNA3的引物 说 明 书 3/7 页 5 CN 109077028 A 5 0045 0046 2、 cDNA合成， 所用试剂盒为PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa公司)， 具体合成过程如下： 0047 (1)在Microtube中配制由以下组分组成的混合液， 见表2； 0048 表2混合液组分表 0049 试剂用量 Oligo dT Primer(50uM)1 l dNTP Mixture(10nM)1 l 西花蓟马RNA1 g。

21、 RNase Free ddH2OUp to 10 l 0050 (2)将上述混合液在65反应5min， 然后置于4； 0051 (3)在上述Microtube管中配置由以下组分组成的反转录反应液， 总量为20 l， 见 表3； 0052 表3反转录反应液组分表 0053 0054 0055 (4)将上述反转录反应液缓慢混匀； 0056 (5)在42温育1h， 然后在70温育15min； 0057 (6)反应完成后， -20保存以备后续实验使用。 0058 3、 PCR扩增体系与程序 0059 以西花蓟马cDNA为模板， 在如下反应体系和反应程序下分别扩增表1中三对引物， 即ds1、 ds2、。

22、 ds3， 反应体系见表4， 反应程序见表5。 说 明 书 4/7 页 6 CN 109077028 A 6 0060 表4 PCR扩增反应体系 0061 0062 表5 PCR扩增反应程序 0063 0064 反应完成后， 回收与目的条带大小一致的片段， 进行测序验证序列， 准确无误后应 用PROMEGA dsRNA合成试剂盒T7 RiboMAX Express RNAi system进行dsRNA合成。 0065 4、 dsRNA合成 0066 dsRNA合成步骤为： 0067 (1)使用干净的RNA专用PCR管， 加入RiboMAXTM Express T7 2X Buffer 10.0。

23、 L； linear DNA template 1.0 g(依据DNA浓度换算需要加入的体积)； Enzyme Mix， T7 Express 2.0 L； Nuclease-Free Water补充到20.0 L； 37温育30分钟(温育时间可以延长 2-6个小时， 有利于增加产量)， 7010分钟， 然后室温放置20分钟， 缓慢冷却形成dsRNA。 0068 (2)DNA和单链RNA消除： 加入1/200的RNase(用RNase Nuclease-Free Water稀释 两百倍)和1.0 L RQ1RNase-Free DNase， 37温育30分钟， 以除去反应体系中的模板DNA和 。

24、单链RNA。 0069 (3)dsRNA纯化： 每管加入0.1倍体积的3M Sodium Acetate(pH 5.2)和1倍体积的 异丙醇， 缓慢混匀后冰上放置5分钟， 可以观察到管内出现絮状物沉淀， 然后415000rpm离 心15分钟， 然后加入0.5mL 70的乙醇进行漂洗， 8000rpm离心5分钟， 然后室温晾干大约15 分钟， 加入适量的ddH2O， 存储在-20(-80长期保存)。 0070 通过上述方法合成dsRNA1(Sequence ID No.1)， dsRNA2(Sequence ID No.2)和 dsRNA3(Sequence ID No.2)。 0071 三、 。

25、对西花蓟马进行RNA干扰的装置 0072 由图1所示， 对西花蓟马进行RNA干扰的RNAi管， 包含透明的管体1， 纱网， 与管体管 说 明 书 5/7 页 7 CN 109077028 A 7 口尺寸匹配的管盖3和拉薄的Parafilm封口膜4； 管体是5mL离心管截去底部1cm所得， 酒精 灯微烤切口边缘使其呈现微熔状态后迅速与200230目纱网充分粘附用以保持其良好透 气效果； 管盖3是离心管的盖， 管盖3设置有加样孔5， 用于用注射器通过加样孔5加入饲料， 加样孔5直径为0.30.7cm； 拉薄的Parafilm封口膜4封住管状机构的另一侧开口， 将盖3盖 在封有封口膜的开口外。 加完。

26、饲料后加样孔5由封口膜封住。 0073 四、 对西花蓟马进行RNA干扰的方法 0074 郅军锐等(2006)的研究结果发现寄主植物花粉可以普遍增加西花蓟马的繁殖力， 在本实验最初的研究中发现花粉溶液可以维持西花蓟马的生理活动， 所以在本实验中将花 粉溶液和dsRNA混合制成饲喂液。 0075 将西花蓟马分成五组， 每组25头， 其中三组分别饲喂混有dsRNA1， dsRNA2， dsRNA3 的饲料， 其余两组分别饲喂饲料和egfp(400-500ng/ul)作为对照组。 0076 (1)饲料的准备 0077 称取一定量的油菜花花粉溶于ddH2O中配制成质量份数为10的花粉溶液作为饲 料， 然。

27、后用花粉溶液将体外合成的dsRNA稀释到500ng/ul配成饲喂液； 0078 (2)西花蓟马的饲喂 0079 将25头西花蓟马装入事先清洗消毒干燥的RNAi管， 取200 l饲喂液通过加样孔中 加到封口膜上， 不刺穿封口膜， 完毕后再用Parafilm封口膜将加样孔封闭， 一方面可以避免 饲喂液损失， 另一方面可以避免饲喂液被杂菌污染， 最后将装有虫体和饲喂液的离心管置 于管架上， 离心管下部用黑色塑料袋遮住， 仅留顶部透光， 最后把整个装置放在25培养箱 中， 并分别在饲喂后12h、 18h、 24h、 48h、 72h取样检测该基因表达水平。 0080 (3)检测基因表达水平的方法 00。

28、81 将(2)中收取的实验组和对照组样本西花蓟马分别提取RNA， 并将模板RNA定量在 1ug进行反转录， 然后使用试剂盒FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)进行定量分析， 加样 体系见表6， 将表6中的试剂混匀后在QuantStudio 3中， 按照表7的反应程序进行反应。 0082 表6检测基因表达水平的加样体系 0083 0084 表7检测基因表达水平的反应程序 说 明 书 6/7 页 8 CN 109077028 A 8 0085 0086 反应结束后将定量结果输出到Excel中进行计算。 0087 0088 结果与分析： 0089 如图2所示， 在不同时间。

29、段内饲喂egfp和花粉溶液(CK)65852基因相对表达量差异 不显著。 除饲喂dsRNA1饲喂液外， 饲喂含dsRNA2和dsRNA3饲喂液的西花蓟马65852基因在 12h-24h时间段内其相对表达量均有不同程度的降低， 但在24h时效果最好3条dsRNA干扰效 果稳定， 干扰效率依次达到64， 76和80， 存活率都为100。 说 明 书 7/7 页 9 CN 109077028 A 9 SEQUENCE LISTING 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 对西花蓟马进行RNA干扰的方法及装置 P180512-SCH 11 PatentIn version 3.3 1 316 DNA Arti。

30、ficial sequence dsRNA1的特异性片段序列 1 taatacgact cactataggg caggatgttt tggtgtcacg cgacgaaagc actcaacggg 60 aaattcttgt ggaacctctt tgcgaccgag atggacggcc ggtgacagat gctgtggcag 120 ccgagcgtcg gatgaagaga gacaaatggc gtctgggcgt taacccagct catccgggca 180 gtagtggaaa ccgcacttgt gttagcagca caatgcctaa cctgcgtcgt gct。

31、gactggg 240 tgctgtttga ttcggcggca ggcaaggagg cgctctccaa ggtgttcaaa gaagccccct 300 atagtgagtc gtatta 316 2 322 DNA Artificial sequence dsRNA2的特异性片段序列 2 taatacgact cactataggg cctggacagg atgttttggt gtcacgcgac gaaagcactc 60 aacgggaaat tcttgtggaa cctctttgcg accgagatgg acggccggtg acagatgctg 120 tggcagccga。

32、 gcgtcggatg aagagagaca aatggcgtct gggcgttaac ccagctcatc 180 cgggcagtag tggaaaccgc acttgtgtta gcagcacaat gcctaacctg cgtcgtgctg 240 actgggtgct gtttgattcg gcggcaggca aggaggcgct ctccaaggtg ttcaaagaag 300 ccccctatag tgagtcgtat ta 322 3 321 DNA Artificial sequence dsRNA3的特异性片段序列 序 列 表 1/5 页 10 CN 10907702。

33、8 A 10 3 taatacgact cactataggg ggcttctttg aacaccttgg agagcgcctc cttgcctgcc 60 gccgaatcaa acagcaccca gtcagcacga cgcaggttag gcattgtgct gctaacacaa 120 gtgcggtttc cactactgcc cggatgagct gggttaacgc ccagacgcca tttgtctctc 180 ttcatccgac gctcggctgc cacagcatct gtcaccggcc gtccatctcg gtcgcaaaga 240 ggttccacaa g。

34、aatttcccg ttgagtgctt tcgtcgcgtg acaccaaaac atcctgtcca 300 gccctatagt gagtcgtatt a 321 4 1487 DNA Artificial sequence comp65852_c0 4 ctcgtgttta agtatgacga aagttacaga ttatcataaa aaaaaatacc accagataac 60 acatgtatca tctttgggta gtgcaaatgc gatgaaggcc tacagagaaa cctttagata 120 accaggatca ttgagagcat tcagtgc。

35、agc agaaaacaat tttaattaga gttgtattta 180 caattctaca aaatgctaaa aactaaagac gcacgctctt acaacaacaa aatagatttt 240 tcttaggcag atggaggcct ttcaccaaga acaaaaacgt caaactgaag agaccagttt 300 cctaggttcg agtgtatgtg gtactttgca ctccgagatg aaggaggggc caatttcttt 360 cccggcctga tgcgacccac tgtcagtacg gtaggatcgc aggcg。

36、atggt cgaaccaaca 420 actgggatag gggcggcacc cacagggcag gcgtcgccca actccggcaa agtcgagcgt 480 gactccttgg cctgcacact accgtcccct ggagcactgt cactgtggtc ctcttctggg 540 ccgcagccgc caccgcgcag ccgatatacg agatgcaact tggaccctgg tacaatgttg 600 tagtcggata gagttctgcc gtcctcgagc tgctttccgg cgtaaatgag acgctgttga 660。

37、 tctattggaa cgccatcctc gtcctgaatg atgtctttaa ccgtctcaat gggagacgac 720 cgctcacaga aaatttgaag agtttgtccc gtcagcgttt tgatgaaata gccttcagcc 780 aagaccagct gcagctgctt agccatggct tcttcagaca ccttggagag cgccttctgg 840 cctgccgcca aatcaaacag cacccactca gcaggacgca agttgggcat tctgctgcta 900 acacaagtgc ggttacca。

38、cc actgcccgga tgagctgggt taacgccaag acgccatttg 960 tctctcttca tgcgacgctc ggctgccaca gcatctgtca ccggccggcc atctcggtcg 1020 caaagaggtt ccacaagaat ttcccgttga gtgctttcgt cgcgtgacac caaaacatcc 1080 tgtccaggtt tgatgaggct aataagattg acccctttaa tgcggtcggc cgtcaggtcc 1140 gcccatgagt cgtcgacgcc catctccgct cgc。

39、tgcagcc ggaaacttag cgccggtctc 1200 accgctgcgt tttgcatcct aaagctcagg cagccggcct tggtcgccac gaacctgagg 1260 ttcgacaaac cggtggacgg gtctgtcgtg gagacggcgc taaggggagc gccgtcacag 1320 agcacctgga ggcccataag cggcactccg tccgtcgtta ccagcacggc caagctttga 1380 ggagtatctt ccatttccgc gtcggattcc tcgctcgcac ggcggtaa。

40、cg gcgggtgctt 1440 cacagtcggc gctgatgatg agggtagcag aacagagcgc gggctgc 1487 序 列 表 2/5 页 11 CN 109077028 A 11 5 1487 DNA Artificial sequence 西花蓟马65852基因的测序结果 5 ctcgtgttta agtatgacga aagttacaga ttatcataga aaataaaata ccaccagata 60 acacatgtat catctttggg tagtgcaagt gcgatgaagg cctacagaga aaccctcaga 120 ta。

41、accaggat cattgagagc attcagtgca gcagaaaaca attttaatta gagttgtatt 180 tacaattcta caaaatgcta aaaactaaag acgcacgctc ttacaacaac aaaatagatt 240 tttcttaggc agatggaggc ctttcaccaa gaacaaaaac gtcaaactga agagaccagt 300 ttcctaggtt cgagtgtatg tggtactttg cactccgaga tgaaggaggg gccaatttct 360 ttcccggcct gatgcgaccc 。

42、actgtcagta cggtaggatc gcaggcgatg gtcgaaccaa 420 caactgggat aggggcggca cccacagggc aggcgtcgcc caactccggc aaagtcgagc 480 gcgactcctt ggcctgctca ctatcgtccc cttgagcact gccactgttg tcctctattg 540 gggcgcagcc accaccgcgc agccgacgca caacatgcag cgtggaccct ggtacaatgt 600 ggtagtcgaa aagcgttttg ccgtcctcga gctggcgtc。

43、c ggagtaaatg agacgctggt 660 catcgattgg agtgccctcc tggtcctgaa ttatgtcctt aaccgtctca attgtagacg 720 accgctcaca gaaaatttga agagtttgtc ccgtcagcgt tttgatgaaa tagccttcag 780 ccaagaccag ctgcagctgc ttagccatgg cttcttcaga caccttggag agcgccttct 840 ggcctgccgc caaatcaaac agcacccact cagcaggacg caagttgggc attctgc。

44、tgc 900 taacacaagt gcggttacca ccactgcccg gatgagctgg gttaacgcca agacgccatt 960 tgtctctctt catgcgacgc tcggctgcca cagcatctgt caccggccgg ccatctcggt 1020 cgcaaagagg ttccacaaga atttcccgtt gagtgctttc gtcgcgtgac accaaaacat 1080 cctgtccagg tttgatgagg ctaataagat tgaccccttt aatgcggtcg gccgtcaggt 1140 ccgcccatg。

45、a gtcgtcgacg cccatctccg ctcgctgcag ccggaaactt agcgccggtc 1200 tcaccgctgc gttttgcatc ctaaagctca ggcagccggc cttggtcgcc acgaacctga 1260 ggttcgacaa accggtggac gggtctgtcg tggagacggc gctaagggga gcgccgtcac 1320 agagcacctg gaggcccata agcggcactc cgtccgtcgt taccagcacg gccaagcttt 1380 gaggagtatc ttccatttcc gcg。

46、tcggatt cctcgctcgc acggcggtaa cggcgggtgc 1440 ttcacagatg atgagggatg agggtggcag aacagagcgc gggctgc 1487 6 40 DNA Artificial sequence ds1引物 6 序 列 表 3/5 页 12 CN 109077028 A 12 taatacgact cactataggg caggatgttt tggtgtcacg 40 7 40 DNA Artificial sequence ds1引物 7 taatacgact cactataggg ggcttctttg aacaccttgg。

47、 40 8 40 DNA Artificial sequence ds2引物 8 taatacgact cactataggg cctggacagg atgttttggt 40 9 40 DNA Artificial sequence ds2引物 9 taatacgact cactataggg ggcttctttg aacaccttgg 40 10 40 DNA Artificial sequence ds3引物 10 taatacgact cactataggg acctggacag gatgttttgg 40 11 40 DNA Artificial sequence ds3引物 序 列 表 4/5 页 13 CN 109077028 A 13 11 taatacgact cactataggg ggcttctttg aacaccttgg 40 序 列 表 5/5 页 14 CN 109077028 A 14 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 15 CN 10907。