技术领域
本发明涉及一种保肝药物组合物。属药物领域。
背景技术
近些年，由于社会的迅速发展，人们的物质生活得到改善，饮食结构日 渐丰富，人们生活、工作压力大，缺乏运动，经常饮酒熬夜，高血脂、肝炎 的发病率逐年上升，对人们工作生活带来很大不便，危及健康。高血脂、肝 损伤日渐受到人们的关注，投入了大量的人力物力进行相关药品的研发。中 药是我国传统的用于防治疾病的药物，是人们在跟疾病斗争中过程中总结出 的宝贵经验，具有悠久的历史，资源丰富，种植、采收成本低。但中药煎煮 繁琐，携带不便。
藤茶，俗称茅岩莓茶、端午茶、藤婆茶(又称山甜茶、龙须茶)，系葡萄 科蛇葡萄属显齿蛇葡萄科(Ampelopsis grossedentata)(Hand-Mazz)W.T.wang的 嫩茎叶。主要生长在中国江南山区各地。此茶色绿起白霜；微苦甘长，生津 止渴；其味甘甜性凉，具有清热解毒、抗菌消炎、祛风除湿、强筋骨、降血 压、降血脂、保肝护肝等功效。民间常用于高血压病、感冒发热、心脑血管 疾病、皮炎、湿疹等疾病的防治。
藤茶泡水后，茶水苦味较大，且苦中带涩，回味绵长，虽其后有甘，但 还是很大的影响了使用者的口感，且传统产品在生产过程中存在较多不足， 亟待提升。
藤茶民间用药历史可上溯到神农尝百草时期，最早的《诗经》称之为古 茶勾藤，《茶经》和《中华本草》亦有收录,至今已有两千多年的民间饮用历 史。福建产藤茶具有自身特点：起白霜、熟香、滋味厚实、先苦、后回甘、 生津止渴，是现代都市人的健康茶饮。目前，除了加工类茶产品外，藤茶还 有饮料、含片、挂面、胶囊、中药配方茶和袋泡茶等产品，花色繁多。
藤茶传统加工工艺为切断、炒黄、烘干、粉碎、包装，但是这种加工工 艺存在许多的不足。其一，藤茶均需要经过加工，在这一过程中藤茶总黄酮 和叶绿素破坏较严重，功效成分及色泽品质损失较明显；其二，藤茶自身存 在涩味重、汤色偏黄和香气低闷、有浊气的缺点；其三，目前藤茶生产没有 规范的生产标准，产品良莠不齐，质量不稳定，机械化程度不高，生产效率 低下。虽然加工类藤茶产品种类繁多，但总体上藤茶资源的开发利用尚处在 比较低的层次上。按照中医理论指导的藤茶产品基本没有，产品还有待于进 一步深入开发，且产品的加工工艺和标准也有待于建立。
申请号：97108163.8，发明名称：一种藤茶，本发明涉及由茶叶与中药 配方精制获得的保健藤茶，其特征是在茶叶中加入由显齿蛇葡萄藤与黄芪、 菊花、金银花、茉莉花、红参、三七花组成不同配方和功效的中药配方。其 制备方法为：将中药配方中的药材清洗晾干，按重量配比置于容积内粉碎混 拌均匀而得到中药配方，最后将中药配方按比例与普通茶叶混拌、烘烤干燥 即可。该专利公开的藤茶具有清热解毒、防暑降温、利尿之药性，还具有养 心安神和提高机体免疫系统之疗效。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种保肝药物组合物。本发明的另一技术方 案是提供了该药物组合物的制备方法和用途。
本发明提供了一种保肝药物组合物，它是由下述重量配比的原料药制备 而成的制剂：
藤茶24-36份、葛花12-18份、青果4-6份、甘草4.8-7.2份。
进一步优选地，它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：
藤茶30份、葛花15份、青果5份、甘草6份。
本发明药物组合物是由藤茶、葛花、青果、甘草的原生药粉、水或有机 溶剂提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的 制剂。
其中，所述的制剂是片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液。
其中，所述的片剂是泡腾片。
其中，所述的泡腾片中含崩解剂的重量百分含量为20-40％；所述的崩解 剂中酸材为柠檬酸、酒石酸中的一种；碱材为碳酸氢钠、碳酸钠中的一种； 酸材和碱材的重量配比为：1-1.2：1；所述的泡腾片中含稀释剂；所述的稀 释剂为溶性淀粉、乳糖、糖粉中的一种；所述的泡腾片中含有粘合剂；所述 的粘合剂为乙醇、淀粉浆、PVP中的一种；所述的泡腾片中含润滑剂；所述 的润滑剂为硬脂酸镁、聚乙二醇6000；所述的泡腾片中含矫味剂的重量百分 含量为：0.45-1.8％；所述的矫味剂为蔗糖、阿斯巴甜、甜菊糖苷、甘草甜素 中的一种；
进一步优选地，所述的崩解剂为酒石酸、碳酸氢钠；所述的稀释剂为乳 糖；所述的粘合剂为聚乙烯吡咯烷酮K30；所述的润滑剂为聚乙二醇6000； 所述的矫味剂为甘草甜素，原辅料的重量配比为：
藤茶60份、葛花30份、青果10份、甘草12份、酒石酸42.5份、碳酸 氢钠30.6份、乳糖247.0份、甘草甜素8.5份、PEG60009.0份、5％PVP 0.4 份。
本发明还提供了制备该药物组合物的方法，它包括如下步骤：
a、称取各重量配比的原料药；
b、藤茶、葛花、青果、甘草加水煎煮，滤过，滤液浓缩成流浸膏，放冷， 加乙醇沉淀，静置，取上清液，回收乙醇，浓缩成稠膏；加入药学上可接受 的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。
本发明还提供了该药物组合物在制备保肝药物中的用途。
进一步优选地，所述的药物是治疗或/预防肝损伤的药物。
本发明药物原料药由藤茶、葛花、青果、甘草组成，可以调节血脂，提 高人体免疫力，对化学性肝损伤具有保护作用。君药藤茶为系葡萄科葡萄属 显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata的嫩茎叶，主要有效成份为二氢杨梅素， 它具有抗高血压、降脂、保肝等作用；臣药葛花，为豆科植物葛Puerarialobata (Willd.)Ohwi的干燥花，临床试验表明其成份鸢尾黄素、鸢尾苷有强的保肝活 性，槐花皂苷-Ⅲ(KS-Ⅲ)能降低Ⅰ型酶黄嘌呤氧化酶和醛氧化酶活性发挥降 低血糖和血脂作用；佐药青果，为橄榄科植物橄榄Canarium album Raeusch 的干燥成熟果实，其成份中的没食子酸等具有保肝作用；使药甘草，豆科植 物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch的干燥根及根茎，成份中的甘草酸有抗肝 损伤的作用，同时调节机体免疫力，调和诸药。
本发明药物用于保肝，尤其是肝损伤，药效明确，制备成的泡腾片溶解 于温开水后服用，口感适宜，提高患者顺应性，具有良好的市场前景。
附图说明
图1正常对照组小鼠肝组织 HE×200
图2肝损伤模型组小鼠肝组织 HE×200
图3阳性对照组小鼠肝组织 HE×200
图4本发明药物泡腾片低剂量组小鼠肝组织 HE×200
图5本发明药物泡腾片高剂量组小鼠肝组织 HE×200
具体实施方式
实施例1本发明泡腾片的制备
(1)处方：
(2)制备工艺:将藤茶、葛花、青果、甘草加水煎煮三次，每次30分钟， 分次滤过，合并滤液，浓缩成流浸膏，放冷，加乙醇适量，静置，取上清液， 回收乙醇，浓缩成稠膏，备用。加入酒石酸、乳糖、甘草甜素，混匀，以5％PVP 乙醇溶液为粘合剂，制粒，干燥，整粒，加入PEG6000和碳酸氢钠，混匀， 压制成1000片，即得。
实施例2本发明药物提取工艺筛选试验
1仪器与试药
(1)实验仪器
(2)实验试药
葛花产地：安徽 北京三和药业有限公司
藤茶(产地：广西)、青果(产地：广东)、甘草(产地：甘肃)：均购 于福州回春中药饮片有限公司，经鉴定均符合《中华人民共和国药典》(2010) 年版一部相关规定。
2提取工艺条件的研究
2.1正交试验筛选
称取藤茶、葛花、青果、甘草各0.5倍处方量为1份，共9份，以加水 量(A)，提取时间(B)，提取次数(C)为考察因素，按表1的因素水平进 行L9(34)正交试验，根据总黄酮含量、浸膏得率进行评价，用紫外分光光度 计测定其吸光度，考察最佳提取工艺条件。
2.1.1水提取液浸膏得率的测定
吸取2.1项下提取的每份药液15ml，转移到干燥的蒸发皿内，置于水 浴锅内蒸发水份至流浸膏后，放入烘箱于100℃烘干到恒重，称重，记录结 果并计算。
2.1.2水提取液总黄酮的含量测定
对照品溶液的制备：称芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量 稀释至每1ml含0.2mg的芦丁溶液，制得对照品溶液。
供试品溶液的制备：取上述9份提取物各1ml，于50ml容量瓶中，并 用水稀释至刻度。
芦丁对照品标准曲线制备：精密吸取芦丁对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0， 4.0，5.0，6.0ml，分别置25ml(V3)量瓶中，加水至6ml，加入1ml的5％ NaNO2，混匀，放置6min，往容量瓶里加入1ml的10％Al(NO3)3，混匀后静 置6min，加入10ml NaOH试液，混匀，加蒸馏水至刻度，混匀，静置15 分钟，以0.0ml对照品溶液制备的溶剂为空白对照，在510nm波长下测定各 组的吸光度值。以吸光度为纵坐标(A)，浓度为横坐标(mg/ml)，绘制标准 曲线。
样品测定：吸取待测溶液10ml(V2)于25ml容量瓶中，照芦丁对照品 标准曲线制备自“加入1ml的5％NaNO2”起，在波长510nm下测定样品的 吸光度，根据标准曲线求出样品中总黄酮的含量(X)。
结果计算：
X = C × V 1 × V 3 × 100 V 2 × M × 100 ]]>
X—试样中总黄酮百分含量，以芦丁(C27H30O16)计，g/100g(ml)；
C—标准曲线上读出供试品溶液中总黄酮的浓度，mg/ml；
V1—试样定容体积，ml；
V2—吸取供试液体积，ml；
V3—显色定容体积，ml；
M—试样取样量，g(ml)。
结果见表2，表3.
表1提取正交试验因素水平表
注：以D因素为误差项
采用加权平均法对浸膏得率、总黄酮含量进行综合评估，由于含量对泡 腾片疗效的影响较大，因此，分别给予浸膏得率、总黄酮含量40％、60％的 权重进行分配。浸膏的率越高，患者最终单次的给药量越多，较低较好，以 最低得率19.808％为最高得分，而总黄酮为主要有效成份，宜越高越好，故 以1.969为最高得分。以序号1为例计算综合评分： (19.808/19.808)*0.4+(0.796/1.969)*0.6＝0.643，同理，可求得其余各综合评分， 结果见表2.
表2提取正交试验结果(n＝9)
表3提取正交试验方差分析
由表3可知，根据水提取液中总黄酮含量与浸膏得率进行评估，各因素 对结果的影响大小：提取次数>加水量>提取时间，即主要影响因素是提取次 数，其次是加水量，提取时间影响最小。以实验结果为参考，结合实际生产 情况，最终确定提取工艺为：加水20倍量，每次提取0.5h，提取3次。
2.2提取正交验证实验
根据以上所选最佳提取工艺条件，加水20倍量，每次提取0.5h，提取 3次，平行3份，对水提取液的浸膏得率与总黄酮含量进行测定，按1.2.1.2 项下的方法计算综合评分后，求平均得分，结果见表4.
表4提取正交实验验证结果(n＝3)
由表4可知，3份平行实验最终的平均得分为0.830，接近于正交设计中 的A3B1C3综合评分，且评分最高，有良好的重复性和较高的准确率，所筛 选的提取工艺条件基本稳定，可作为本发明药物泡腾片的提取方法。
3小结与讨论
在提取工艺的探讨过程中，用正交试验的方法研究加水量、提取时间、 提取次数对药液浸膏得率和总黄酮含量的影响，获得最适提取条件为：20倍 量水，提取3次，每次提取0.5h。试验中发现，青果为橄榄的干燥果实，本 处方中用量较少，为方便称取，同时提高没食子酸等有效成份的提取率，宜 先将其进行粉碎；藤茶、葛花密度小，提取过程中浮于水面，应将其充分润 湿，使其浸没于水中，以免影响各成份的提取率；若直接加热煎煮，提取过 程中水分蒸发严重，实验结果重现性差，宜采用冷凝回流的方法进行提取。
实施例3本发明药物纯化工艺研究
1仪器与试药
(1)实验仪器
其余所用仪器与“1.1”项下相同。
(2)实验试药
无水乙醇(AR) 国药集团化学试剂有限公司
其余所用试药与“1.1”项下相同。
2泡腾片醇沉工艺条件的研究
2.1醇沉正交试验筛选
称取药材藤茶、葛花、青果、甘草各0.5倍处方量，共1份，按“1.2.1” 项所筛选的最佳提取工艺A3B1C3，即20倍量水、提取0.5h、提取3次，合 并3次提取液，分成9份，每份350ml，以提取液浓度(A)，含醇量(B)， 醇沉时间(C)为考察因素，按表5的因素水平进行L9(34)正交试验，并以 总黄酮提取量、干浸膏得率为评价指标，用紫外分光光度计测定其吸光度， 考察最佳醇沉工艺条件。
2.1.1醇沉浸膏得率的测定
精密量取上述醇沉后药液5ml，参照“2.1.1”项下的方法测定浸膏得率， 结果见表6。
2.1.2醇沉后总黄酮的含量测定
对照品溶液的制备：参照“1.2”项下的对照品溶液的制备方法进行制备。
供试品溶液的制备：取上述9份醇沉后药液各1ml，置50ml容量瓶中， 并用水稀释至刻度。
芦丁对照品标准曲线制备：参照“2.1.2”项下的芦丁对照品标准曲线制备 方法进行制备。
样品测定：精密吸取供试溶液8ml(V2)，至25ml量瓶中，照“2.1.2”自 “加入5％亚硝酸钠溶液1ml”起，在波长510nm处分别测定吸收度值，从标 准曲线上读出供试品溶液中含总黄酮的浓度(C)，计算样品中总黄酮的含量 (X)。
计算方法：参照“1.2.1.2”项下的计算方法进行计算。结果见表6，表7.
表5醇沉正交试验因素水平表
注：以D因素为误差项
采用加权平均法对浸膏得率、总黄酮含量进行综合评分，由于含量对泡 腾片疗效的影响较大，因此，分别给予浸膏得率、总黄酮含量40％、60％的 权重进行分配。浸膏的率越高，患者最终单次的给药量越多，宜越低越好， 故以最低得率18.68％为最高得分，而总黄酮为主要有效成份，宜越高越好， 故以1.625为最高得分。以序号1为例计算综合评分： (18.680/28.002)*0.4+(1.190/1.625)*0.6＝0.706，同理，可求得其余各综合评分， 结果见表6.
表6醇沉正交试验结果(n＝9)
表7醇沉正交试验方差分析
由表7可知，以总黄酮含量与水提取液浸膏得率为评价指标，各因素对 结果的影响大小为：药液相对密度>醇沉时间>含醇量，即主要影响因素是药 液相对密度，其次是醇沉时间，含醇量影响最小。以实验结果为参考，结合 实际生产情况，最终确定醇沉工艺为：药液相对密度为0.9959-0.9965，含醇 量70％，醇沉时间20h。
2.2醇沉正交验证实验
根据以上所选最佳醇沉工艺条件，相对密度为0.9959-0.9965，含醇量 70％，醇沉时间20h，平行3份，对醇沉后药液的浸膏得率与总黄酮含量进 行测定，按2.1.2项下的方法计算综合评分后，求平均得分，结果见表8.
表8醇沉正交实验验证结果(n＝3)
由表8可知，最佳醇沉工艺的平均得分0.918，大于正交设计中的各项综 合评分，且评分最高，有较高的准确率，所筛选的醇沉工艺条件基本稳定， 可作为本发明药物泡腾片的醇沉方法。
3小结与讨论
通过正交实验，确定最佳醇沉工艺为：将药液浓缩至相对密度为 0.9959-0.9965，含醇量70％，醇沉时间20h。醇沉正交试验过程中，各实验 组尽可能采用同一批次的提取液，以排除提取因素对结果的影响，且提取液 放置过程会有少许沉淀，取样时应先混匀；测定相对密度时，要待浓缩的药 液冷却至室温后再测，因高温会是玻璃比重瓶体积变大，导致结果不准确； 加入乙醇的过程中，乙醇的滴加速度以及搅拌速度应当一致，到醇沉时间后， 及时分离出沉淀物并用旋转蒸发仪回收乙醇。
实施例4本发明药物泡腾片成型工艺研究
1仪器与试药
(1)实验仪器
常压恒温干燥箱XMTD-822 上海精宏实验设备有限公司
单冲压片机TDP-1.5 上海超亿制药机械设备有限公司
(2)实验试药
2成型工艺处方的筛选
2.1崩解剂的筛选与优化
(1)崩解剂的种类筛选
按表9中的组份进行制软材，压片，崩解实验，以筛选崩解剂种类。
表9不同种类崩解剂的制剂考察
结果表明，样品4的效果较好。
(2)崩解剂的用量优化
为了获得崩解剂的最佳用量，以表9中样品4为基础，查阅相应文献崩 解剂的用量大多在20％-40％，酸碱比例在1:1-1.2:1之间，故设计表10，不 同崩解剂的用量及酸碱比例，根据片剂的崩解速度，得到最佳用量及酸碱比 例。
表10崩解剂的用量及酸碱比例优化
由上表可知，崩解剂中酸微过量时崩解完全，比例为1.2:1时较好；当 崩解剂在片重中的比例增加时，崩解时间减小，但变化幅度较小，且崩解剂 比例增加时，溶液的pH值减小，对胃伤害较大，故选用崩解剂占片重比例 20％，酸碱比例为1.2:1为最宜。
2.2稀释剂的选择
由于泡腾片溶解以后溶液应该澄清，因此稀释剂应能溶于水的，本实验 主要考虑可溶性淀粉、乳糖、糖粉，由于本发明药物泡腾片的提取液味较苦， 加入糖粉后，挤压制粒比较困难，乳糖易过筛制粒，可压性强，故选用乳糖 作为稀释剂。
2.3粘合剂的选择
常用的粘合剂有乙醇、淀粉浆、PVP。本实验分别用无水乙醇、10％淀粉 浆、5％聚乙烯吡咯烷酮K30乙醇溶液作为粘合剂，分别与酸材、碱材混匀， 过20目筛挤压制粒，60℃干燥30min，压片。乙醇作为粘合剂，干燥以后颗 粒较散，细分较多，流动性较差，片重差异较大，淀粉浆粘合性较差，压片 时容易出现松片，聚乙烯吡咯烷酮K30颗粒不易结块，崩解良好，故选聚乙 烯吡咯烷酮K30作粘合剂。
2.4润滑剂的选择
湿法制粒时，在压片前通常需要加入适当的润滑剂，以改善颗粒的流动 性，使片重均匀，片剂外表光滑。本实验对硬脂酸镁、聚乙二醇6000进行对 比试验，根据休止角与堆积密度的大小，比较两者对颗粒流动性的影响。
2.4.1休止角的测定
用固定圆锥底法进行测量，把漏斗固定于铁架台上，下方放置一张滤纸， 漏斗下端出口垂直于滤纸表面且对准圆心，调节高度约4cm，把加入润滑剂 的药物颗粒从上口倒入漏斗中，直到铺满整张滤纸为止，测量圆锥的高度， 计算休止角：atgθ＝h/r，平行测定3次，结果见表11.
2.4.2堆积密度的测定
取一只20ml量筒，洗净，干燥，称重，将颗粒从距瓶口正上方约5cm 处流下，直至量筒内颗粒堆积至20ml刻度处，称量出量筒总重量，求得颗 粒重量，平行测3次，取平均值，根据重量与体积计算堆积密度，结果见表 11.
表11润滑剂对颗粒流动性影响考察
由上表堆积密度可知，加入润滑剂以后，粉体的堆积度明显增大，即粉 体的流动性、填充性得到改善，压片过程中可减小片重差异，同时减小粉体 间的孔隙率，增强可压性；而休止角方面，在没有加任何润滑剂的时候，休 止角大，流动性不好，且压片后表面粗糙无光泽，不符合生产要求，加入硬 脂酸镁、PEG6000后，流动性得到提高，片重差异减小，片剂表面光滑，但 硬脂酸镁崩解后在溶液表面形成一层薄膜，有浑浊感，故以聚乙二醇6000 作为润滑剂。在实验过程中发现，在相同重量的颗粒中，随着加入润滑剂的 增加，片剂表面变光滑，但崩解时间也相应延长，实验表明，当用量为2％ 时，表面光滑，崩解性能良好。
2.5矫味剂的选择
2.5.1矫味剂种类选择
由于本发明药物泡腾片提取液的苦味较强，需采用合适的矫味剂进行矫 正。本实验中，主要考察了蔗糖、阿斯巴甜、甜菊糖苷以及甘草甜素对苦味 的改善情况，结果表明，蔗糖由于甜度小，制剂过程中加入量大，不符合生 产要求；阿斯巴甜甜度较大，但加入后药物变硬结块，难以挤压制粒；甜菊 糖苷，甜度大，服用后涩味明显，不宜作为矫味剂，甘草甜素甜度大，服用 后喉间有回甘，且本发明药物泡腾片原料药中含有甘草，故选用甘草甜素作 为矫味剂。
2.5.2矫味剂用量优化
甘草甜素甜度较大，且个人口感差异较大，因此在矫味剂限量范围内， 设计添加量为0.45％，0.90％，1.80％三个梯度甜度的本发明药物泡腾片，在 人群中进行口感调查，以0-10分进行评价，口感满意度越好，分值越高，最 后求平均得分，获得最受大众接受甜度。结果见表12.
表12不同甜度口感满意度调查结果(n＝16)
由上表可知，在甘草甜素加入量较少时，药物提取液的苦味较明显，随 添加量增加，苦味被覆盖，酒石酸的味道明显，当加入量为1.8％时，口感满 意。
以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。
试验例1本发明药物泡腾片对大鼠四氯化碳所致急性肝损伤的保护作 用实验报告
1实验目的
观察本发明药物泡腾片对大鼠四氯化碳所致急性肝损伤的保护作用。
2实验材料
2.1实验受试药物
本发明药物泡腾片(福建中医药大学药学院自制0.45g/片，处方：藤 茶30g，葛花15g，青果5g，甘草6g。功能：对化学性肝损伤有辅助保护作 用)，加蒸馏水配制成不同浓度的灌胃液。
2.2实验试剂
门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒， 超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，盐酸、冰乙酸 等均为国药集团试剂。
2.3实验器材 匀浆机，分光光度仪，离心机，电子称，鼠笼、灌胃针， 分析天平等
3动物分组与处理
清洁级ICR雌性小鼠，体重20-25g，福建中医药大学实验动物中心提供。 按照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》的基本要求，将实验动物按体 重随机分为五组，每组至少10只即正常对照组、肝损伤模型组、阳性对照组 (葡萄籽原花青素30mg/kgBW)、本发明药物泡腾片低剂量组(20mg/kgBW)、 本发明药物泡腾片高剂量组(40mg/kgBW)。实验期间各组小鼠经口灌胃给予 受试物，正常对照组和肝损伤模型组给予等容量蒸馏水，连续30天。每周称 量一次体重，根据体重调整灌胃量。
于试验第31天将各组动物隔夜禁食16h，肝损伤模型组和各受试物组小 鼠，按5ml/kgBW(折合CCl4的剂量为80mg/kgBW)，一次灌胃给予由植物油 稀释的1％CCl4，空白对照组给予等容量植物油。给予四氯化碳24h后，经 眼球取血，分离血清，测定血清ALT、AST。取肝脏，称重后，计算肝脏指数。 取肝右叶，用冰冷的150mmol/L KCl的溶液在匀浆器中研磨制成组织匀浆， 进行肝脏MDA、肝脏SOD的检测。取肝左叶，置10％福尔马林中固定，待进 行肝脏病理组织学检查及病变评分。
4观察指标及测定方法
4.1体重及脏器指数
实验开始时与实验结束时分别称量体重，解剖小鼠后立即用生理盐水冲 洗肝脏并称量肝脏重量，计算体重增长值及肝脏指数。
4.2血清ALT
采用丙氨酸氨基转移酶试剂盒(改良赖氏法)测定血清中的ALT。
4.3血清AST
采用门冬氨酸氨基转移酶试剂盒(改良赖氏法)测定血清中的AST。
4.4肝脏丙二醛(MDA)含量
动物处死后，立即取其肝脏，用冰冷的0.9％生理盐水制成10％(w/v)的 组织匀浆，按照《卫生毒理学》中硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定MDA含量。
配制TCA-TBA-HCl混合液：将15gTCA，0.375gTBA和2.25ml浓HCI溶于 200ml蒸馏水中(50℃水浴溶解)，临用前配制。
4.5肝脏超氧化物岐化酶(总SOD)活性
用冰冷的0.9％生理盐水制成1％(w/v)肝匀浆，采用超氧化物歧化酶试 剂盒(黄嘌呤氧化酶法)测定超氧化物歧化酶的活性。
4.6肝脏病理组织学检查
取肝脏左叶用10％福尔马林固定，从肝左叶中不做横切面取材，石蜡包 埋，HE染色。用40倍物镜连续观察整个组织切片，分别观察每个视野中各 种病变所占视野的面积并累计所观察视野的病变总分。主要观察的病变类型 有肝细胞气球样变(细胞肿大，胞浆残留少许)、脂肪变性(肝细胞胞浆内出 现界限清晰的脂滴空泡)、胞浆凝聚(胞浆嗜伊红增强)、肝细胞水样变性、 肝细胞坏死(胞浆嗜伊红改变，凝固性坏死)等。
按照以下评分标准对各组动物组织病理学评分：
表13肝细胞气球样变的病理组织学特征与评分值
大致正常 0分 气球样变的肝细胞占整个视野的1/4 1分 气球样变的肝细胞占整个视野的1/2 2分 气球样变的肝细胞占整个视野的3/4 3分 气球样变的肝细胞占整个视野 4分
表14肝细胞脂肪变性的病理组织学特征与评分值
大致正常 0分 脂肪变性的肝细胞占整个视野的1/4 1分 脂肪变性的肝细胞占整个视野的1/2 2分 脂肪变性的肝细胞占整个视野的3/4 3分 脂肪变性的肝细胞占整个视野 4分
表15肝细胞水样变性的病理组织学特征与评分值
未见水样变性的肝细胞 0分 水样变性的肝细胞占整个视野的1/4 1分 水样变性的肝细胞占整个视野的1/2 2分 水样变性的肝细胞占整个视野的3/4 3分 水样变性的肝细胞占整个视野 4分
表16肝细胞坏死的病理组织学特征与评分值
未见坏死细胞 0分 散在个别细胞占整个视野的1/4 1分 坏死细胞占整个视野的2/4 2分 坏死细胞占整个视野的3/4 3分 坏死细胞弥漫性存在占整个视野 4分
受试样品任何一个剂量组与肝损伤模型组之间，气球样变、脂肪变性、胞 浆凝聚、水样变性或肝细胞坏死等肝细胞病变中，肝细胞坏死程度减轻，差 异有显著性，而其它病变类型与肝损伤模型组比较明显减轻或无明显差异， 可判断动物实验病理结果阳性。
受试样品任何一个剂量组与肝损伤模型组之间，气球样变、脂肪变性、 胞浆凝聚、水样变性着四种肝细胞病变类型加重和减轻同时存在，差异有显 著性，且肝细胞坏死程度减轻，差异有显著性，则可将其各种病理变化的得 分相加，肝细胞坏死评分2倍计入，以总分进行统计分析，若差异有显著性， 可判断动物实验病理结果阳性。
5统计学分析
数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS13.0统计软件，应用单因 素方差分析比较组间差异，应用LSD法进行两两比较。按方差分析的程序先 进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F<F0.05，结论：各组均数间差异无显 著性；F>F0.05，P<0.05，进行多个样本均数间的两两比较。
6结果判定
按照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》满足以下条件，可判定受试 样品对化学性肝损伤有辅助干预作用：血液生化指标ALT、AST两项指标中任 一项指标阳性和病理组织学检查结果阳性。
7实验结果
7.1本发明药物泡腾片对小鼠体重的影响
对各组小鼠实验期间体重增重的差值进行方差分析，结果显示无统计学 差异(P>0.05)，见表17。说明在给定条件下，受试物对动物体重增长无明 显影响。各组小鼠精神状态良好，未见不良反应。
表17本发明药物泡腾片对小鼠体重的影响
7.2本发明药物泡腾片对小鼠血清ALT和AST的影响
由表18可见，与正常对照组比较，肝损伤模型组、阳性对照组、低剂量 和高剂量本发明药物泡腾片组动物血清ALT水平明显升高(P<0.01)；阳性对 照组、低剂量和高剂量本发明药物泡腾片组的血清ALT水平均低于肝损伤模 型组(P<0.01)；本发明药物泡腾片组之间血清ALT无显著性差异(P>0.05)； 本发明药物泡腾片低剂量和高剂量组动物的ALT水平与阳性对照组比较均无 统计学意义(P>0.05)。
肝损伤模型组、阳性对照组、低剂量和高剂量本发明药物泡腾片组动 物血清的AST水平均高于正常对照组(P<0.01)；阳性对照组、低剂量本发明 药物泡腾片组、高剂量本发明药物泡腾片组小鼠血清AST水平均低于肝损伤 模型组(P<0.01)；两个剂量本发明药物泡腾片组之间小鼠血清AST无显著差 异(P>0.05)；两个剂量本发明药物泡腾片组动物的血清AST与阳性对照组相 比无显著性差异(P>0.05)。
表18本发明药物泡腾片对小鼠血清ALT和AST的影响
a:与正常对照组比较，P<0.01；b：与肝损伤模型组比较，P<0.01。
7.3本发明药物泡腾片对小鼠肝脏MDA含量和SOD活性的影响
由表19可见，与正常对照组比较，肝损伤模型组动物肝脏MDA含量明显 增高(P<0.01)，阳性对照和本发明药物泡腾片各剂量组动物肝脏MDA含量无 显著改变(P>0.05)；阳性对照组和本发明药物泡腾片各剂量组的动物肝脏 MDA含量均低于肝损伤模型组(P<0.01)；本发明药物泡腾片各剂量组动物肝 脏MDA含量之间无显著性差异(P>0.05)，本发明药物泡腾片低剂量和高剂量 组动物肝脏MDA含量与阳性对照组相比均无统计学意义(P>0.05)。
肝损伤模型组、本发明药物泡腾片低剂量和高剂量组动物肝脏的SOD活 性均低于正常对照组(P<0.01)；阳性对照组动物肝脏的SOD活性与正常对照 组的差异无统计学意义(P>0.05)；阳性对照组、本发明药物泡腾片低剂量和 高剂量组动物肝脏的SOD活性均高于肝损伤模型组(P<0.01)；本发明药物低 剂量组动物肝脏SOD活性低于阳性对照组(P<0.05)；本发明药物泡腾片高剂 量组动物肝脏的SOD活性与阳性对照组差异不显著(P>0.05)；低剂量、高剂 量本发明药物泡腾片组动物肝脏的SOD活性的差异不显著(P>0.05)。
表19本发明药物泡腾片对小鼠肝脏MDA含量和SOD活性的影响
a:与正常对照组比较，P<0.01；b：与肝损伤模型组比较，P<0.01；
c:与阳性对照组比较，P<0.05
7.4本发明药物泡腾片对小鼠肝体比及肝组织病变评分的影响
肝损伤模型组小鼠的肝脏指数大于正常对照组(P<0.05)；阳性对照组和 本发明药物泡腾片低剂量和高剂量组动物的肝脏指数与肝损伤模型组相比无 显著性差异(P>0.05)。各受试物组动物肝脏指数之间差异不明显(P>0.05)。 肝细胞的病变积分(以肝细胞气球样变性、脂肪变性、胞浆凝聚、肝细胞水 样变性、肝细胞坏死等五种病变的总积分为判定指标)显示，肝损伤模型组、 阳性对照组、低剂量和高剂量本发明药物泡腾片组小鼠肝细胞病变积分明显 高于正常对照组(P<0.01)，阳性对照组和本发明药物泡腾片高剂量组小鼠肝 细胞病变积分均低于肝损伤模型组(P<0.05)，本发明药物泡腾片低剂量组小 鼠肝细胞病变积分与肝损伤模型组差异不显著(P>0.05)；各受试物组小鼠肝 细胞病变积分之间无显著性差异
(P>0.05)。见表20。
表20本发明药物泡腾片对小鼠肝体比及肝组织病变评分的影响
a:与正常对照组比较，P<0.05；c：与正常对照组比较，P<0.01；
b:与肝损伤模型组比较，P<0.05
7.5本发明药物泡腾片对小鼠肝脏病理组织学特征的影响
按照2003年版中华人民共和国卫生部《保健食品检验与评价技术规范》， 肝脏切片进行HE染色，结果表明，正常组肝脏结构完整，肝细胞以中央静脉 为中心向四周呈放射状整齐排列，肝小叶轮廓清晰，肝细胞分界清，胞质丰 富，未见病理性改变。肝损伤模型组，肝正常组织结构消失，小叶界限不清， 大部分肝窦消失。肝细胞广泛性的水样变性，表现为细胞体积增大，胞浆疏 松、浅染，乃至清亮、透明，部分肝细胞呈少量灶性或点状坏死。阳性对照 组及本发明药物泡腾片组病理检查结果显示肝小叶边界清晰，肝细胞结构无 明显变性，核结构较清晰，部分细胞体积略大，核质略少，或分布不均，部 分核内出现空晕，有不同程度的肝细胞气球样变、肝细胞脂肪变性、肝细胞 浆凝聚、水样变性及肝细胞坏死。表明阳性对照组及本发明药物泡腾片低、 高剂量组对小鼠急性肝损伤有部分改善作用，阳性对照、高剂量本发明药物 泡腾片、低剂量本发明药物泡腾片对肝损伤小鼠肝脏的影响基本一致。见图 1-5。
8实验结论
本发明药物泡腾片可减轻由四氯化碳肝损伤造成的小鼠血清中ALT、AST 水平的增高，降低肝脏脂质过氧化物的生成和/或加速过氧化物的清除，提高 肝组织中超氧化物歧化酶活性，提高机体的抗氧化能力，减轻化学性毒物所 致的肝组织病理损伤。因而，本发明药物泡腾片可减轻急性化学性肝损伤， 其作用可能与抗氧化，清除自由基，稳定细胞膜的结构等作用有关。