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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310171059.2 (22)申请日 2013.05.10 A23L 33/105(2016.01) (73)专利权人 龙岩学院 地址 364012 福建省龙岩市新罗区凤凰北路 1 号 (72)发明人 邱龙新 黄毅萱 苏伟娇 王天喜 林发新 翁梦婷 (74)专利代理机构 厦门市新华专利商标代理有 限公司 35203 代理人 李宁 (54) 发明名称 一种红车轴草口服液的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种红车轴草口服液的制备方 法， 先配置 70% 的酒精作为有机溶剂， 将红车轴草 粉碎， 以 1:10 的质量体积比 g/L。
2、 将红车轴草浸 泡在有机溶剂中 48h， 过滤， 减压浓缩滤液得浓缩 液， 60干燥至恒重， 得到红车轴草提取物 ； 再将 干燥后的红车轴草提取物溶解于酒精溶液中至饱 和， 用NaOH或KOH溶液修饰， 并调节pH值为9-13， 置于温度为 30-70的水浴锅中加热 4h， 减压浓 缩， 60干燥至恒重 ； 然后取蒸馏水， 在不断搅拌 下加入修饰过的红车轴草提取物稀释至溶液中含 有 4mg/mL 的红车轴草异黄酮， 并加入草莓香精和 木糖醇， 调节 pH 值至 5-7， 混匀， 即得异黄酮含量 高同时口感好的红车轴草口服液。 (51)Int.Cl. 审查员 颜小平 (19)中华人民共和国国家知。
3、识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 103251050 B 2016.04.27 CN 103251050 B 1.一种红车轴草口服液的制备方法， 其特征在于步骤如下： 第一步， 红车轴草提取物的制备 配置质量百分比浓度70%的酒精作为有机溶剂， 将红车轴草用锤片式粉碎机粉碎， 以1: 10的质量体积比g/L将红车轴草浸泡在有机溶剂中48 h， 过滤， 减压浓缩滤液得浓缩液， 60 干燥至恒重， 得到红车轴草提取物； 第二步， 红车轴草提取物水溶性的修饰 将干燥后的红车轴草提取物溶解于质量百分比浓度70%的酒精溶液中至饱和， 用NaOH 或KOH溶液为修饰溶。
4、液， 对红车轴草提取物进行修饰， 调节饱和的红车轴草提取物溶液的pH 值为11-13， 置于温度为50-70的水浴锅中加热4h， 减压浓缩， 60干燥至恒重； 第三步， 口服液的制备 取蒸馏水， 在不断搅拌下加入修饰过的红车轴草提取物稀释至溶液中含有4 mg/mL的 红车轴草异黄酮， 并加入浓度分别为16 L/mL和 0.06 g/mL的草莓香精和木糖醇， 即， 口服 液中草莓香精的含量为16 L/mL， 口服液中木糖醇的含量为0.06 g/mL， 调节pH值至5-7， 混 匀， 即得红车轴草口服液。 2.如权利要求1所述的一种红车轴草口服液的制备方法， 其特征在于还包括如下步骤： 第四步， 。
5、灌封 将制备好的红车轴草口服液灌装于10 mL口服液瓶子中， 并用封口机封口； 第五步， 灭菌 对灌封好的红车轴草口服液在121温度下高压灭菌20min； 第六步， 包装、 成品。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 103251050 B 2 一种红车轴草口服液的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种红车轴草口服液的制备方法， 属于功能性食品的技术领域。 技术背景 0002 红车轴草 （Trifolium pratense L.） 为豆科多年生草本植物,又名红三叶草， 是我 国长江流域以南地区优良的豆科牧草,目前国内很多地区已引种栽培。 红车轴草含有黄酮 类物质、 蛋白质、 氨基。
6、酸、 糖类和维生素等成分。 其中异黄酮因有植物雌激素样作用和黄酮 类物质的抗癌作用而格外受人关注。 0003 异黄酮是一种生物活性物质， 属于黄酮类化合物， 广泛存在于植物界中， 目前植物 中已知的异黄酮有700余种， 它们几乎全部分布在豆科植物蝶形花亚科 （Papilionoideae） 的一些属中， 比如大豆， 红车轴草， 葛根， 苜蓿。 其中红车轴草是豆科植物中异黄酮含量最高 (1.5wt%-2.5wt%)的植物。 异黄酮有重要的保健功效， 所以红车轴草可以用来做保健食品， 而不仅仅只用来做牧草。 0004 异黄酮的基本结构是3-苯基色原酮， 即两个苯环由中央三碳连在一起， 中央三碳 成。
7、环， B环连在3号中心原子上， 它们的结构因甲基化、 羟基化和糖基化的程度不同而不同。 异黄酮主要以O糖苷、 丙二酰基或甲基丙二酰半酯配糖体的形式存在 （如下式） 。 0005 0006 红车轴草异黄酮受分子间氢键作用， 使其紧密堆积故水溶性差， 在体内不易吸收， 导致生物利用度低， 影响了它的药效以及利用。 发明内容 0007 为了解决上述问题， 本发明的目的在于提供一种红车轴草口服液的制备方法， 以 获得红车轴草异黄酮含量高同时口感好的口服液。 0008 本发明为完成上述目的采用如下技术方案： 0009 一种红车轴草口服液的制备方法， 其步骤如下： 0010 第一步， 红车轴草提取物的制备。
8、 0011 配置质量百分比浓度70%的酒精作为有机溶剂， 将红车轴草用锤片式粉碎机粉碎， 以1:10的质量体积比g/L将红车轴草浸泡在有机溶剂中48 h （小时） ， 过滤， 减压浓缩滤液得 浓缩液， 60干燥至恒重， 得到红车轴草提取物； 0012 第二步， 红车轴草提取物水溶性的修饰 0013 将干燥后的红车轴草提取物溶解于质量百分比浓度70%的酒精溶液中至饱和， 用 NaOH或KOH溶液为修饰溶液， 对红车轴草提取物进行修饰， 调节饱和的红车轴草提取物溶液 的pH值为9-13， 置于温度为30-70的水浴锅中加热4 h， 减压浓缩， 60干燥至恒重； 说 明 书 1/6 页 3 CN 1。
9、03251050 B 3 0014 第三步， 口服液的制备 0015 取蒸馏水， 在不断搅拌下加入修饰过的红车轴草提取物稀释至溶液中含有4 mg/ mL的红车轴草异黄酮， 并加入浓度分别为16 L/mL和 0.06 g/mL的草莓香精和木糖醇， 调 节pH值至5-7， 混匀， 即得红车轴草口服液。 0016 本发明进一步包括如下步骤： 0017 第四步， 灌封 0018 将制备好的红车轴草口服液灌装于10 mL口服液瓶子中， 并用封口机封口； 0019 第五步， 灭菌 0020 对灌封好的红车轴草口服液在121温度下高压灭菌20min （分钟） ； 0021 第六步， 包装、 成品。 0022。
10、 采用上述方案后， 本发明采用金属离子螯合法， 即利用碱中和的方法使红车轴草 异黄酮结构中的5、 7位失氢， 同时引入金属离子进行螯合， 由于引入金属离子能增加分子间 排斥力， 使分子间氢键失去作用改变其分子间的排列， 使其在水溶液中成分子状态， 从而增 强异黄酮的水溶性， 再使用木糖醇和草莓香精等作为口服液的矫味剂， 通过实验， 获得红车 轴草异黄酮含量高同时口感好的口服液。 0023 采用本发明的金属螯合法可使红车轴草提取物水溶性提高206倍， 普通的未修饰 的红车轴草异黄酮要达到人日服用40 mg的异黄酮， 就必须得服用大剂量的口服液， 而修饰 过的异黄酮显著提高了异黄酮的水溶性， 患者。
11、只须每天服用一支10 mL的红车轴草口服液 就可以达到所需的效果。 本发明制成口服液剂型， 与目前市面上均是以粉末或胶囊形式销 售相比， 不仅增加了红车轴草提取物的剂型的选择， 填补了当前国内外市场上这一剂型的 空白， 并且显著提高红车轴草提取物的有效利用率。 0024 本发明制备的红车轴草提取物口服液集营养、 保健、 养颜、 方便、 安全于一体， 适用 于女性更年期， 有优异的调理作用， 使其平稳度过， 预防乳腺癌、 子宫肌瘤， 改善骨质疏松； 改善女性卵巢功能衰退症状。 在酸性环境下， 氢离子重新将碱金属离子置换， 使得在酸性消 化吸收系统中， 不会改变母核的结构式而改变其药理活性。 此方。
12、法技术简便， 快速， 成本低， 又易于推广而且具有科学性。 附图说明 0025 图1为本发明制备口服液的工艺流程图； 0026 图2为本发明制备好的口服液在模拟消化系统环境中的溶解度的变化情况 （异黄 酮溶解能力对照图） ； 0027 图3为不同pH值对口服液澄明度的影响； 0028 图4为异黄酮修饰前后水溶性比较图； 0029 图5为草莓香精含量对口服液的影响； 0030 图6为木糖醇含量对口服液的影响。 具体实施方式 0031 下面结合具体实施方式及图1对本发明做进一步的描述。 0032 材料与试剂 说 明 书 2/6 页 4 CN 103251050 B 4 0033 标准品鹰嘴豆牙素A。
13、 （购自美国Sigma公司） 、 红车轴草 （购自安徽豪州） 、 木糖醇 （购 自山东福田药业有限公司） 、 草莓香精 （购自阳东县江联香化有限公司） ， 氢氧化钠、 氢氧化 钾、 无水乙醇、 盐酸均为分析纯。 0034 前期准备： 0035 鹰嘴豆牙素A标准曲线的制备 0036 用质量百分浓度70 %乙醇， 将鹰嘴豆芽素按2.0、 4.0、 6.0、 8.0、 10.0、 12.0、 14.0 g/mL 配置， 用质量百分浓度70% 乙醇作为对照。 在石英比色皿中， 利用分光光度计在263 nm下来测定其吸光值， 绘制标准曲线。 0037 实施例1 0038 一种红车轴草口服液的制备方法， 。
14、包括如下步骤。 0039 第一步， 红车轴草提取物的制备 0040 配置质量百分比浓度70%的酒精作为有机溶剂， 将红车轴草用锤片式粉碎机粉碎， 以1:10的质量体积比g/L将红车轴草在有机溶剂中浸泡48 h， 过滤， 减压浓缩滤液得浓缩 液， 60干燥至恒重， 得到红车轴草提取物。 0041 第二步， 红车轴草提取物水溶性的修饰 0042 金属离子螯合的pH值和温度： 0043 通过实验发现， 增加 pH、 提高温度可以使得异黄酮水溶性增加。 但是 pH、 温度过 高效果反而不显著。 因此通过单因素实验后， 以pH 9-13， 温度30-70设计两因素五水平正 交实验， 探索红车轴草提取异黄。
15、酮的最佳水溶性修饰方案。 0044 将干燥后的红车轴草提取物溶解于质量百分比浓度70%的酒精溶液中至饱和， 分 成五组， 用NaOH溶液为修饰溶液， 对红车轴草提取物进行修饰， 调节饱和的红车轴草提取物 溶液的pH值为9-13， 分成五组， pH为： 9、 10、 11、 12、 13， 每组再各分为5个小组， 在30、 40、 50、 60、 70 的水浴锅中水浴加热4 h， 减压浓缩， 60干燥至恒重。 0045 修饰前后红车轴草提取物中异黄酮水溶性的对比： 0046 以蒸馏水为空白对照， 将修饰前后的红车轴草提取物分别溶解于蒸馏水至饱和， 然后利用分光光度计在263 nm波长下进行测定其。
16、吸光值， 利用鹰嘴豆芽素A制作的标准曲 线计算出修饰前后的红车轴草提取物的异黄酮的含量， 比较水溶性。 0047 第三步， 口服液的制备 0048 1、 草莓香精和木糖醇添加量的确定 0049 根据Mazur等报道， 人每天服用40 mg的异黄酮即可有效预防骨质疏松。 因此本发 明用蒸馏水， 在不断搅拌下将修饰过的红车轴草提取物溶解成溶液中红车轴草异黄酮的终 浓度为4 mg/mL （每支口服液总体积10 mL） ， 随机选取40个人通过感官检验嗅其气味和品其 滋味来确定要加入的草莓香精和木糖醇的量， 本发明是加入浓度分别为16 L/mL和 0.06 g/mL的草莓香精和木糖醇。 调节pH值至5。
17、-7， 混匀， 即得红车轴草口服液。 0050 2、 口服液的最适pH值 0051 以口服液的澄明度为检测指标， 红车轴草异黄酮口服液的最适pH值。 按 中国药 典（90版） 规定口服液的pH值为5.57.0， 设置pH值为5、 6、 7的三个梯度的单因素实验， 检 测澄明度得出最适pH值。 0052 3、 澄明度的检测 说 明 书 3/6 页 5 CN 103251050 B 5 0053 根据 中国药典 规定：“中药口服液应澄清， 并允许有少量可摇之易散的沉淀” 。 澄 明度的检测方法是利用重量法进行检测。 即将贮存一段时间的口服液摇匀后， 吸取一定量 的口服液于离心管内， 离心， 去上清。
18、， 取沉淀烘干后称量得出沉淀物的重量， 通过测得沉淀 物的重量便可确定口服液的澄明度， 从而选取口服液的最适的pH值和最适保存温度。 0054 4、 成品在模拟消化系统环境中的溶解度的变化 0055 将制备好的口服液置于模拟消化系统环境中观察其有效成分异黄酮的溶解度情 况。 0056 5、 数据处理与统计学分析 0057 数据采用EXCEL软件进行方差分析或差异比较， 当P值 0.05时差异被认为具有统 计学意义。 并建立标准回归曲线。 0058 6、 结果与分析 0059 （1） 鹰嘴豆芽素A标准曲线 0060 根据将鹰嘴豆芽素A标准品溶液按2.1.1的方法制作标准曲线， 做回归方程： y 。
19、= 0.2095 x+0.0333其中x为鹰嘴豆芽素A的浓度( g/ mL)， y为吸光度， 相关系数r = 0.9804。 0061 （2） 红车轴草提取物水溶性修饰结果 0062 金属离子螯合的pH值和温度： 0063 根据表1， 能够看出pH为12， 温度60 时， 红车轴草提取物溶解能力最好， 为13518 g/ mL。 因此修饰红车轴草提取物的最优修饰条件是pH为12， 温度60 。 0064 表1修饰后的溶解能力 （ g/ mL） 0065 0066 红车轴草异黄酮修饰前后的水溶性强弱对比： 0067 将未修饰的红车轴草提取物用蒸馏水溶解至饱和， 测得其吸光值并带入标准曲线 方程可。
20、得红车轴草饱和水溶液中可溶的异黄酮的含量约为65.59 g/ mL； 将修饰后的红车 轴草提取物用蒸馏水溶解后至饱和后， 测得其吸光值并带入标准曲线方程可得红车轴草饱 和水溶液中可溶的异黄酮的含量约为13518.26 g/ mL。 0068 由此可得经过修饰的红车轴草异黄酮的水溶性相比未修饰的提高了大约206倍。 0069 其水溶性强弱对比如图4所示。 0070 （3） 口服液中香精含量 （L/mL） 与木糖醇含量(g/mL)对口服液影响的调查结果 0071 随机选取40位路人通过感官检验， 对加入不同量的草莓香精的口服液嗅其气味。 如图5所示， 当口服液中草莓香精的含量为16 L/mL时， 。
21、口服液的香味更受大众欢迎。 0072 随机选取40位路人通过感官检验， 对加入不同量的木糖醇的口服液进行品尝， 如 图6所示， 当口服液中木糖醇含量为0.06 g/mL时， 口服液的甜度适中， 口感最好。 说 明 书 4/6 页 6 CN 103251050 B 6 0073 （4） 红车轴草异黄酮口服液的最适pH值 0074 将不同pH值的口服液摇匀后各取4 mL于离心管内， 离心， 去上清， 取沉淀烘干后称 量沉淀物的重量，（每10天测一次） ， 结果如图3所示， 口服液中的沉淀物的量随着时间的增 加而增加， 而且口服液中的沉淀物的重量随着pH值的升高逐渐下降。 当pH值为7时口服液中 的。
22、沉淀物的量最少， 即口服液的澄明度最高， 口服液体系最稳定。 所以配制红车轴草口服液 的最适pH值为7。 0075 （5） 成品在模拟消化系统环境中的溶解度的变化情况 0076 由图2可以看出， 即使在模拟消化系统环境下， 水溶性异黄酮的结构式转换回原来 的结构而溶解性有所下降， 但是经过金属离子螯合修饰后， 在胃肠环境下的溶解性仍比未 修饰的异黄酮显著增强。 0077 第四步， 灌封 0078 将制备好的红车轴草口服液灌装于10 mL口服液瓶子中， 并用封口机封口； 0079 第五步， 灭菌 0080 对灌封好的红车轴草口服液在121 温度下高压灭菌20 min； 0081 第六步， 包装、。
23、 成品。 0082 实施例2 0083 一种红车轴草口服液的制备方法， 包括如下步骤： 0084 第一步， 红车轴草提取物的制备 0085 配置质量百分比浓度70%的酒精作为有机溶剂， 将红车轴草用锤片式粉碎机粉碎， 以1:10的质量体积比g/L将红车轴草在有机溶剂中浸泡48 h， 过滤， 减压浓缩滤液得浓缩 液， 60干燥至恒重， 得到红车轴草提取物； 0086 第二步， 红车轴草提取物水溶性的修饰 0087 将干燥后的红车轴草提取物溶解于质量百分比浓度70%的酒精溶液中至饱和， 用 KOH溶液为修饰溶液， 对红车轴草提取物进行修饰， 调节饱和的红车轴草提取物溶液的pH值 为9-13， 置于。
24、温度为30-70的水浴锅中加热4 h， 减压浓缩， 60干燥至恒重； 0088 第三步， 口服液的制备 0089 取蒸馏水， 在不断搅拌下加入修饰过的红车轴草提取物稀释至溶液中含有4 mg/ mL的红车轴草异黄酮， 并加入浓度分别为16 L/mL和 0.06 g/mL的草莓香精和木糖醇， 调 节pH值至5-7， 混匀， 即得红车轴草口服液； 0090 第四步， 灌封 0091 将制备好的红车轴草口服液灌装于10 mL口服液瓶子中， 并用封口机封口； 0092 第五步， 灭菌 0093 对灌封好的红车轴草口服液在121 温度下高压灭菌20 min； 0094 第六步， 包装、 成品。 0095 。
25、综上所述， 红车轴草口服液最佳工艺为： 取经干燥粉碎后的红车轴草， 加入10倍量 的70%的酒精浸提48 h后， 过滤， 减压浓缩滤液后干燥至恒重， 得红车轴草提取物。 用70 %乙 醇溶解红车轴草提取物至饱和后， 用NaOH或KOH调节pH 至12， 再在60条件下修饰4 h， 减 压浓缩， 干燥， 再用蒸馏水将修饰过的红车轴草异黄酮溶解至每1 mL含4 mg的红车轴草异 黄酮， 并加入草莓香精和木糖醇直至浓度为16 L/mL和0.06 g/mL， 调节pH值至7， 混匀， 灌 说 明 书 5/6 页 7 CN 103251050 B 7 装至10 mL的口服液瓶子中， 于121温度下高压灭。
26、菌20 min， 最后将其保存在0冰箱中或 室温保存。 0096 红车轴草口服液以异黄酮含量为质量指标， 是因为异黄酮具有弱的雌激素样作 用， 且能促进动物生长， 抑制癌细胞生长， 改善动脉血管柔软性， 对于预防乳腺癌、 结肠癌、 改善骨质疏松和改善妇女更年期症状有重要作用， 所以其黄酮类化合物系其药效和营养有 效成分之一， 因此本发明采用以鹰嘴豆牙素A标准物来测定产品的有效成分含量， 既简便、 快速， 又易于推广应用。 0097 目前， 中国申请专利均有公开各种红车轴草提取物的制备工艺， 但这些制备工艺 最终产物均为粉末或胶囊， 很多时候服用不方便且容易受潮， 也不方便携带， 对于吞咽有困 。
27、难的人来说也是相当不便利的。 本发明将红车轴草提取物制成口服液剂型， 主要是因为口 服液剂型便于口服， 特别适用于吞咽固体制剂困难的病人 （如老年人和儿童） ， 减少服药次 数， 可改善患者服药的顺从性、 流动性好； 加入矫味剂后可增加制剂的可口性， 掩盖一些不 良气味， 而且口服液具有增溶作用、 靶向性及生物利用度高等优点， 且当患者需要一次性服 用剂量很大且体积较大的片剂或者胶囊时会难以吞服， 而口服液制剂可克服这一问题。 本 研究证明， 采用本发明的金属螯合法可使红车轴草提取物水溶性提高206倍， 普通的未修饰 的红车轴草异黄酮要达到人日服用40 mg的异黄酮， 就必须得服用大剂量的口服液， 而修饰 过的异黄酮显著提高了异黄酮的水溶性， 患者只须每天服用一支10 mL的红车轴草口服液 就可以达到所需的效果。 说 明 书 6/6 页 8 CN 103251050 B 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 9 CN 103251050 B 9 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 10 CN 103251050 B 10 图5 图6 说 明 书 附 图 3/3 页 11 CN 103251050 B 11 。