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1、(10)授权公告号 CN 101326897 B (45)授权公告日 2011.11.09 CN 101326897 B *CN101326897B* (21)申请号 200810150294.0 (22)申请日 2008.07.09 A01H 1/02(2006.01) A01H 1/04(2006.01) A01H 3/02(2006.01) (73)专利权人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省咸阳市杨凌示范区邰城 路 3 号西北农林科技大学园艺学院 (72)发明人 张鲁刚 董美云 惠麦侠 张明科 (74)专利代理机构 西安西达专利代理有限责任 公司 61202 代理人 李文义 。
2、CN 1647615 A,2005.08.03, 全文 . CN 1849881 A,2006.10.25, 全文 . 张少丽等 . 大白菜温敏雄性不育系育性转 化相关基因的 cDNA-AFLP 分析 . 西北植物学 报 .2008,28(4),667-674. 张鲁刚等 . 玻里马胞质大白菜雄性不育 系 CMS3411-7 温度敏感特性的研究 . 园艺学 报 .2001,28(5),415-420. 张鲁刚等 . 大白菜异源胞质雄性不育 遗传规律及其恢复性的研究 . 西北农业学 报 .1994,3(3),45-50. (54) 发明名称 大白菜温度敏感不育系和温度钝感不育系的 选育方法 (5。
3、7) 摘要 本发明公开了一种大白菜温度敏感不育系和 温度钝感不育系的选育方法， 该方法是先将大白 菜温敏雄性不育系与不同目标亲本杂交， 其杂交 一代在蕾期经过低温处理， 筛选育性转化明显的 杂交一代， 在育性转化期， 经过育性恢复株自交、 可育株与不育株测交等步骤育成大白菜纯合温度 敏感不育系和温度钝感不育系。本发明根据大白 菜温度敏感雄性不育的遗传特点， 采用人工低温 诱导处理， 选育的温度钝感不育系解决了大白菜 雄性不育由于温度敏感造成的微量花粉现象 ； 选 育的温度敏感不育系可建立大白菜温敏性雄性不 育两用系， 简化了雄性不育利用程序， 创制两系法 杂交制种的新途径， 并通过转育进一步开。
4、发利用 雄性不育遗传资源。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 吴涛 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 CN 101326897 B1/1 页 2 1. 大白菜温度敏感不育系和温度钝感不育系的选育方法， 其特征在于， 包括下列步 骤 ： 1) 将大白菜温度敏感雄性不育系 TsCMS7311 与目标大白菜材料杂交， 在蕾期经过 4-9低温处理 7-12d， 筛选育性转化明显的杂交一代， 在育性转化期， 选择育性恢复株自交 获得 F2； 2)将F2分离世代种子萌动后， 置于4-8条件下春化处理20-25d， 播于。
5、营养钵内， 在光 照强度为 3000Lx， 时间为 14 小时的条件下生长 7-10d 后， 将其放于温室内自然生长 ； 3) 待春化幼苗现蕾后， 将不育系材料按花蕾大小分组， 然后分别在 4-9春化室处理 7-12d ； 4) 低温处理结束后， 将幼苗放于 20常温下继续生长， 植株开花后， 隔日记载单株育 性级别， 发生育性转换时， 选育性回复优株自交F2S1， 选种子量大的F2S1重复步骤2)3)的 过程， 继续选育性回复优株， 经过 2 3 代自交， 选择群体育性转化稳定， 结籽多的自交系， 即得大白菜温度敏感不育系 ； 选没有发生育性转化的优株与目标大白菜材料单株成对测交 F2BC1。
6、， 以 F2BC1为材料， 重复步骤 2) 3) 的过程后， 选育性转化低、 或者没有发生育性转化 的F2BCn与对应的保持系继续回交， 经过2-3代回交， 选择稳定不育的F2BCn即得大白菜温度 钝感不育系， 对应的轮回父本就是保持系。 权 利 要 求 书 CN 101326897 B1/6 页 3 大白菜温度敏感不育系和温度钝感不育系的选育方法 技术领域 0001 本发明属于植物杂种优势利用技术领域， 涉及一种根据大白菜雄性不育温敏性状 的遗传规律选育大白菜温度敏感不育系和温度钝感不育系的方法。 背景技术 0002 大白菜雄性不育系的研究和利用是杂种优势利用的需求， 大白菜杂种优势利用最 。
7、早在日本， 20世纪60年代， 韩国、 中国相继开始大白菜杂种优势育种。 伴随着大白菜杂种优 势育种的发展， 各国科学家开始了大白菜雄性不育的寻找、 转育、 创新、 优势育种和遗传规 律等研究。 0003 日本、 韩国等早于20世纪60年代已开展大白菜雄性不育系的研究， 主要围绕萝卜 细胞质雄性不育 OguCMS 的转育、 性状改良等进行了许多研究， 但目前还没有成功应用的报 道。中国学者从 20 世纪 70 年代开始进行大白菜雄性不育系的研究和选育， 20 世纪 70 年 代相继在大白菜、 小白菜中发现了由单隐性基因 (ms) 控制的细胞核雄性不育， 并创造性地 提出了细胞核雄性不育两用系利。
8、用途径， 应用于实践。1979 年第一个两用系杂交种 “沈阳 快菜” (AB5417216-43-4-1) 通过审定， 雄性不育 “两用系” 作为白菜杂种一代利用的途径 之一被逐步应用， 由于雄性不育两用系繁殖和配制杂交一代种子中均需要拔出 50的可育 株， 大面积制种难度大， 目前两用系利用途径应用很少。 0004 二十世纪 80 年代， 许多学者致力于细胞质雄性不育选育， 对以国外引入的 Ogura 萝卜细胞质雄性不育材料， 在大白菜、 小白菜上进行了广泛的回交转育和性状改良 ； 利用中 国萝卜王兆红萝卜雄性不育株作母本与 78-22-3 大白 菜杂交、 回交， 获得胞质不育白 菜， 但同。
9、样产生叶片黄化， 而且配合力不高 ； 这一阶段， 针对萝卜不育源存在叶片黄化、 生长 迟缓、 蜜腺退化和配合力差等缺陷的工作， 没有取得实质性的进展， 所以至今未能在生产上 得到应用 ； 在油菜细胞质雄性不育方面， 陕西省蔬菜研究所利用甘蓝型油菜雄性不育源在 大白菜上进行了转育研究。育成了大白菜异缘胞质雄性不育系 CMS3411-7， 并成功地应用 于杂交一代生产， 配制了杂 13、 杂 14 等大白菜新品种。1989 年张书芳先生领导的课题组从 大白菜地方品种 “万泉青帮” 中发现了显性核不育基因， 研究并提出了由两对核基因控制的 基因互作雄性不育遗传模式， 1989 年育成了 100不育株。
10、率的细胞核基因互作雄性不育系 88-1A， 并配制了优良组合应用于生产。但由于核基因控制的基因互作雄性不育转育困难， 目前仅仅在少数几个单位应用， 难以广泛推广。 0005 油菜细胞质雄性不育对大白菜容易转育， 杂种优势明显， 但是随着在不同白菜品 种中的广泛转育， 温度敏感产生的微量花粉成为困扰着其应用的主要问题。同时， 近年来， 利用温度和光照等环境因子影响雄性不育性的表达， 已引起广大育种者的青睐。利用植物 雄性不育性对温度或光照敏感的特性， 控制不同生产目的需求下的适宜环境条件， 在作物 表现雄性不育时， 生产杂交种子 ； 表现雄性可育时繁殖亲本， 即不育系和保持系为同一材 料， 一系。
11、两用， 可简化杂交制种程序、 降低杂交种子生产成本， 在作物育种上有很高的实用 价值。 说 明 书 CN 101326897 B2/6 页 4 0006 目前， 在大白菜领域还没有关于选育出能够克服温度敏感产生的微量花粉现象的 温度钝感不育系， 和可建立大白菜温敏性雄性不育两用系的的温度敏感不育系报道。 发明内容 0007 针对现有技术在中存在的问题与缺陷， 本发明的目的在于提供大白菜温度敏感不 育系和温度钝感不育系的选育方法。 该方法选育的温度敏感不育系可建立大白菜温敏性雄 性不育两用系， 简化了雄性不育利用程序 ； 选育的温度钝感不育系可克服以往不育系存在 的微量花粉问题。 0008 实现。
12、上述发明的目的技术方案是 ： 大白菜温度敏感不育系和温度钝感不育系的选 育方法， 包括下列步骤 ： 0009 1) 将大白菜温度敏感雄性不育系 TsCMS7311 与目标大白菜材料杂交， 在蕾期经过 4-9低温处理 7-12d， 筛选育性转化明显的杂交一代， 在育性转化期， 选择育性恢复株自交 获得 F2； 0010 2)将F2分离世代种子萌动后， 置于4-8条件下春化处理20-25d， 播于营养钵内， 置长光照下生长 7-10d 后， 将其放于温室内自然生长 ； 0011 3) 待春化幼苗现蕾后， 将不育系材料按花蕾大小分组， 然后分别在 4-9春化室 处理 7-12d ； 0012 4) 。
13、低温处理结束后， 将幼苗放于 20常温下继续生长， 植株开花后， 隔日记载单 株育性级别， 发生育性转换时， 选育性回复优株自交 F2S1， 选种子量大的 F2S1重复步骤 2) 3)的过程， 继续选育性回复优株， 经过23代自交， 选择群体育性转化稳定， 结籽多的自交 系， 即得大白菜温度敏感不育系 ； 选没有发生育性转化的优株与目标大白菜材料单株成对 测交 F2BC1， 以 F2BC1为材料， 重复步骤 2) 3) 的过程后， 选育性转化低、 或者没有发生育性 转化的F2BCn与对应的保持系继续回交， 经过2-3代回交， 选择稳定不育的F2BCn即得大白菜 温度钝感不育系， 对应的轮回父本。
14、就是保持系。 0013 步骤 2) 中所述的光照强度为 3000Lx， 时间为 14 小时。 0014 与现技术相比， 本发明大白菜温度敏感不育系和温度钝感不育系的选育方法的有 益之处在于 ： 0015 本发明的选育方法利用温敏雄性不育的遗传规律， 采用人工低温诱导处理， 选育 的温度钝感不育系解决了大白菜雄性不育由于温度敏感造成的微量花粉现象 ； 选育的温度 敏感不育系可建立大白菜温敏性雄性不育两用系， 简化了雄性不育利用程序， 创制两系法 杂交制种的新途径， 并通过转育进一步开发利用雄性不育遗传资源。 附图说明 0016 图 1 为本发明大白菜温度钝感不育系的选育方法的流程图。 0017 。
15、图 2 为本发明大白菜温度敏感不育系的选育方法的流程图。 具体实施方式 0018 以下通过发明人给出的具体实施例和试验例来进一步说明本发的方法及其理论 基础和有益效果。 说 明 书 CN 101326897 B3/6 页 5 0019 实施例 1 0020 1) 将西北农林科技大学园艺学院选育了大白菜温敏雄性不育系 TsCMS7311 与西 北农林科技大学园艺学院选育大白菜金冠 1 号杂交， 在蕾期经过 4低温处理 12d， 筛选育 性转化明显的杂交一代， 在育性转化期， 选择育性恢复株自交获得 F2； 0021 2) 将 F2分离世代种子萌动后， 置于 4条件下春化处理 25d， 播于营养钵。
16、内， 置长 光照 ( 强度为 3000Lx， 时间为 14 小时 ) 下生长 10d 后， 将其放于温室内自然生长 ； 0022 3) 待春化幼苗现蕾后， 将不育系材料按花蕾大小分组， 然后分别在 4春 化室处 理 12d ； 0023 4) 低温处理结束后， 将幼苗放于 20常温下继续生长， 植株开花后， 隔日记载单 株育性级别， 发生育性转换时， 选育性回复优株自交 F2S1后种子量大的 F2S1重复步骤 2) 4)的过程， 经过23代自交， 选择群体育性转化稳定， 结籽多的自交系， 即得大白菜温度敏 感不育系 ； 选没有发生育性转化的优株与目标大白菜材料单株成对测交F2BC1， 以F2B。
17、C1为材 料， 重复步骤2)3)的过程后， 选育性转化低、 或者没有发生育性转化的F2BCn与对应的保 持系继续回交， 经过2-3代回交， 选择稳定不育的F2BCn即得大白菜温度钝感不育系， 对应的 轮回父本就是保持系。 0024 实施例 2 0025 1) 将西北农林科技大学园艺学院选育了大白菜温敏雄性不育系 TsCMS7311 与西 北农林科技大学园艺学院选育大白菜金冠2号杂交， 在蕾期经过9低温处理7d， 筛选育性 转化明显的杂交一代， 在育性转化期， 选择育性恢复株自交获得 F2； 0026 2) 将 F2分离世代种子萌动后， 置于 4条件下春化处理 25d， 播于营养钵内， 置长 光。
18、照 ( 强度为 3000Lx， 时间为 14 小时 ) 下生长 8d 后， 将其放于温室内自然生长 ； 0027 3) 待春化幼苗现蕾后， 将不育系材料按花蕾大小分组， 然后分别在 9春化室处 理 7d ； 0028 4) 低温处理结束后， 将幼苗放于 20常温下继续生长， 植株开花后， 隔日记载单 株育性级别， 发生育性转换时， 选育性回复优株自交 F2S1， 选种子量大的 F2S1重复步骤 2) 4) 的过程， 经过 2 3 代自交， 选择群体育性转化稳定， 结籽多的自交系， 即得大白菜温度 敏感不育系 ； 选没有发生育性转化的优株与目标大白菜材料单株成对测交F2BC1， 以F2BC1为 。
19、材料， 重复步骤2)3)的过程后， 选育性转化低、 或者没有发生育性转化的F2BCn与对应的 保持系继续回交， 经过2-3代回交， 选择稳定不育的F2BCn即得大白菜温度钝感不育系， 对应 的轮回父本就是保持系。 0029 实施例 3 0030 1) 将将西北农林科技大学园艺学院选育了大白菜温敏雄性不育系 TsCMS7311 与 西北农林科技大学园艺学院选育大白菜金冠2号杂交， ， 在蕾期经过7低温处理10d， 筛选 育性转化明显的杂交一代， 在育性转化期， 选择育性恢复株自交获得 F2； 0031 2) 将 F2分离世代种子萌动后， 置于 8条件下春化处理 20d， 播于营养钵内， 置长 光。
20、照 ( 强度为 3000Lx， 时间为 14 小时 ) 下生长 7d 后， 将其放于温室内自然生长 ； 0032 3) 待春化幼苗现蕾后， 将不育系材料按花蕾大小分组， 然后分别在 7春化室处 理 10d ； 0033 4) 低温处理结束后， 将幼苗放于 20常温下继续生长， 植株开花后， 隔日记载单 说 明 书 CN 101326897 B4/6 页 6 株育性级别， 发生育性转换时， 选育性回复优株自交 F2S1， 选种子量大的 F2S1重复步骤 2) 4)的过程， 经过23代自交， 选择群体育性转化稳定， 结籽多的自交系， 即得大白菜温度敏 感不育系 ； 选没有发生育性转化的优株与目标大。
21、白菜材料单株成对测交F2BC1， 以F2BC1为材 料， 重复步骤2)3)的过程后， 选育性转化低、 或者没有发生育性转化的F2BCn与对应的保 持系继续回交， 经过2-3代回交， 选择稳定不育的F2BCn即得大白菜温度钝感不育系， 对应的 轮 回父本就是保持系。 0034 试验例 1 0035 1. 大白菜温敏雄性不育温敏性状遗传规律的研究 0036 以西北农林科技大学园艺学院选育了大白菜温敏雄性不育系 TsCMS7311 为试材， 选择其 3 株育性转化明显的单株自交， 获得 3 个 F2 群体， C1、 C2、 C3。 0037 将大白菜温敏雄性不育系 TsCMS7311 的 3 个 F。
22、2 群体种子萌发后， 4低温春化 25 天， 然后常温下自然生长。幼苗现蕾后， 于 6低温处理 9 天。待幼苗开花发生育性转化 后， 观察单株育性表现见 ( 表 1)， 结果表明 ： 可育株与不育株的比例都符合理论值 15 1， 说明大白菜雄性不育系 TsCMS7311 的温敏性状受两对核基因控制， 温度敏感基因为显性， 温度钝感基因为隐性。用 Tm1、 Tm2 表示温敏基因， 则 TsCMS7311 的基因型可以表示为 S(rfrfTm1tm1Tm2tm2)， 在低温诱导条件下出现育性转化， 在非低温诱导条件下， 表现不育。 0038 表 1TsCMS7311 转化株自交后代在低温诱导后雄性。
23、育性的分离比例 0039 0040 2. 温度敏感雄性不育和温度钝感雄性不育的选育策略 0041 根据温度敏感雄性不育 TsCMS7311 的基因型 S(rfrfTm1tm1Tm2tm2)， 其单株自交 后代， 出现三种分离情况， 一种单株没有育性转化， 即稳定不育株 ； 一种单株表现不同程度 的育性转化， 包括完全转化可育株和部分转化可育株， 根据这一特点， 可以采用下面两种选 育策略 ： 0042 1) 针对育性转化株的策略 ： 在经过低温诱导， 后代出现育性分离时， 选 择育性程 度高 ( 带有较多的敏感基因 ) 的单株自交， 选择结籽多的单株， 经过 2-3 代的经济性状和温 度敏感性。
24、选择， 就可育成纯合显性温敏基因 (Tm1Tm1Tm2Tm2) 的温度敏感雄性不育株， 育成 温度敏感雄性不育系 S(rfrfTm1Tm1Tm2Tm2)， 具体选育流程如图 2 所示。 0043 2) 针对稳定不育株的策略 ： 对于低温诱导后， 表现稳定不育的单株， 用保持系 的不同单株同时测交， 并且保持系单株自交， 其结果见 ( 表 2)。进一步通过低温诱导测 交一代的温度敏感性判断保持系的基因型， 选择表现温度钝感的测交一代对应的保持 说 明 书 CN 101326897 B5/6 页 7 系 N(rfrftm1tm1tm2tm2)， 继续回交， 直到性状稳定， 可育成温度钝感细胞质雄性。
25、不育系 S(rfrftm1tm1tm2tm2)， 具体选育流程如图 2 所示。 0044 稳定不育株与保持系的不同单株同时测交的表现 0045 0046 试验例 2 0047 1、 将西北农林科技大学园艺学院选育了大白菜温敏雄性不育系 TsCMS7311 温敏 雄性不育系种子经 25萌动后， 置 4低温下春化 20d， 播种于室温长光照条件下， 待幼苗 生长至蕾期用于温度处理。 在光照培养箱中分两步进行， 第一步设定5个温度水平(3， 6， 9， 12， 15 ) 和 2 个时间水平 (5， 11d)， 共 10 个处理。第二步设定 2 个温度水平 (6， 9 ) 和 3 个时间水平 (3， 。
26、6， 9d)， 共 6 个处理。光照强度为 3000Lx， 日光照时数为 15h。每个处理放 置 24 株整齐一致的幼苗， 处理时间结束后立即转入室温长光照条件下正常生长， 开花后每 隔 1d 观测记载 1 次单株的育性级别。结果发现在 6恒低温处理 9 天时育性转换程度 最 理想。 0048 2、 分别在人工控温诱导条件和田间自然低温诱导条件下， 调查大白菜温敏雄性不 育 F2 的遗传规律。在人工控温诱导试验中， 将种子经 25萌动后， 置 4低温下春化 20d， 播种于室温长光照条件下， 待幼苗生长至蕾期， 用 6恒低温处理 9 天， 然后转入室温长光 照条件下正常生长， 开花后每隔 1d。
27、 观测记载 1 次单株的育性级别。在田间自然低温诱导试 验中， 幼苗经过了自然春化作用和蕾期自然低温诱导作用。开花后每隔 1d 观测记载 1 次单 株的育性级别。结果表明 ： 可育株与不育株的比例都符合理论值 15 1， 说明大白菜雄性 不育系 TsCMS7311 的温敏性状受两对核基因控制， 温度敏感基因为显性， 温度钝感基因为 隐性。 0049 3、 根据大白菜雄性不育温度敏感遗传规律的研究结果， 温敏雄性不育的 基因型有 S(rfrfTm1Tm1Tm2Tm2)、 S(rfrfTm1Tm1Tm2tm2)、 S(rfrfTm1Tm1tm2tm2)、 S(rfrfTm1tm1Tm2Tm2)、S。
28、(rfrfTm1tm1Tm2tm2)、S(rfrfTm1tm1tm2tm2)、 S(rfrftm1tm1Tm2Tm2) 和 S(rfrftm1tm1Tm2tm2)8 种， 由于各基因型携带的显性敏感基 因数目不同， 而且两个显性敏感基因效应的大小也可能不一致， 因此植株的恢复度必 然出现差异， 这也是出现不同育性级别的主要原因， 因此选育温敏钝感型雄性不育必 须不带显性敏感基因， 其基因型为 S(rfrftm1tm1tm2tm2)， 要求对应的保持系基因型为 N(rfrftm1tm1tm2tm2)。 考虑到保持系单株之间基因型的差异， 必须用保持系单株与未发生 育性转换的不育株成对测交， 同时。
29、自交， 通过测交后代的不育性表现判断保持系单株的基 因型， 选择测交后代完全不育对应的保持系单株， 其基因型为 N(rfrftm1tm1tm2tm2)， 即为 保持系。并用该保持系 N(rfrftm1tm1tm2tm2) 与稳定不育系 S(rfrftm1tm1tm2tm2) 杂交获 得 基因型为 S(rfrftm1tm1tm2tm2) 的不育系种子。 说 明 书 CN 101326897 B6/6 页 8 0050 4、 以温敏雄性不育系 TsCMS7311 为材料， 选育性恢复性状优良的不育株， 单株多 代自交， 直至获得纯合的、 温敏性状稳定的不育系 S(rfrfTm1Tm1Tm2Tm2)。
30、。温敏不育性鉴定 选择标准如下 ： 在前期低温条件下， 选择群体不育度指数小的株系 ( 以利于选育出的不育 系自交繁殖 )， 从该株系中选择单株不育度低或全可育、 花粉饱满、 生活力强的植株， 可以以 单株自交结种子多少作为选择标准 ； 后期高温条件下， 在前期入选植株中， 选择不育度指数 较高的单株， 入选株系和单株均要求温敏不育性的温度转换期短、 温度范围窄， 温敏性状稳 定。经济性状选择包括产量、 品质、 抗病性和抗逆性强等等。在定向转育过程中， 经济性状 选择以与轮回转育品系相象为标准。 供选择的群体越大， 选择到理想植株的概率就越高， 因 此在条件允许时， 应尽量扩大群体。 说 明 书 CN 101326897 B1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 。