相关申请的交叉引用
本申请要求了提交于2005年1月27日的美国临时专利申请 60/647,495和60/647,648的优先权，所述申请通过引用全部并入此处。本 申请还和与本申请同时提交的国际专利申请相关，该国际申请的代理人 案号为682714-9WO，名称为“输送包括NDGA化合物的儿茶酚丁烷 (catecholic butanes)的口服配方”，该申请的公开内容通过引用全文并入 此处。
背景技术
本申请涉及向诸如人类的动物给药儿茶酚丁烷的包括注射配方的组 合物和方法，所述儿茶酚丁烷包括NDGA化合物诸如NDGA衍生物，例 如四-O-甲基NDGA，以用于疾病的治疗，所述疾病例如癌症、牛皮癣或 其他增生或炎性疾病，诸如糖尿病的代谢病或包括诸如阿兹海默氏症 (Alzheimer’s disease)、中风、肌萎缩性脊髓侧索硬化、帕金森氏症 (Parkinson’s disease)的神经变性疾病的神经元疾病。
已经在某些实验动物上测试了去甲二氢愈创木酸(“NDGA”)的治 疗应用。例如，Jordan等人在美国专利5,008,294中记载了NDGA对人乳 腺癌，MX-1的效果，该癌细胞在第0天皮下植入大鼠中(实施例2)。 在第一天，对患肿瘤的大鼠以单次肿瘤内注射的方式注射各种剂量的 NDGA。在这个实施例中没有公开NDGA的增溶剂。在另一个实施例中， 用10-2M NDGA在4mLDMSO(即，二甲亚砜)中的备用液和6mL蒸馏 水进行细胞体外测试(实施例5)。
Huang等人，如美国专利6,214,874中记载，测试了某些NDGA的衍 生物(即NDGA衍生物)的治疗应用。在一个实施例中，NDGA衍生物 被溶解在DMSO中(实施例5)。
使用DMSO向人体给药是有争议的。此外，使用DMSO可引起不希 望的副作用，诸如镇静、头痛、恶心、眩晕、发烧或眼痛及明显的呼吸 气味。(例如，见Brobyn，R.D.“The human toxicology of dimethyl sulfoxide (二甲亚砜的人体毒性)”Ann.N.Y. Acad.Sci.243：497-506，1975年1月 27日)。如果儿茶酚丁烷，包括NDGA或NDGA衍生物(共称为，“NDGA 化合物”)有用于作为人或其他动物的治疗剂，例如2004年12月29日 出版的国际公开号为WO 04/112696的PCT/US2004/016117所述，非常需 要开发不同于含DMSO的配方的新型配方，以溶解这些包括NDGA化合 物诸如NDGA衍生物，例如，M4N的儿茶酚丁烷。此外，人们希望这些 配方不仅安全而且稳定，向动物给药后具有最小的副作用。人们还希望 为这些化合物开发一种配方，可使有效量的这些化合物输送至所需的人 或其他动物体内的目标组织。本发明具有所需的优点。
发明内容
因此，本发明的目的之一是提供溶解此处包括NDGA化合物诸如 NGGA衍生物的儿茶酚丁烷的一种或多种新型配方，其中此种配方不含 DMSO并适于注射入动物。
本发明的另一目的是提供当向包括人的动物给药时，安全并几乎没 有副作用的如上配方。
本发明的另一目的是提供一种或多种的前述配方，所述配方具有商 业上合理期限的稳定性。
本发明的又一目的是提供一种或多种的前述配方，所述配方可向动 物肠胃外地给药。
本发明的另一目的是提供一种或多种的前述配方，所述配方在向动 物给药后的循环中，具有商业上合理的半衰期。
根据前述的本发明的一个或多个目的，提供本发明的具体实施方式 如下：
一种用于注射入动物的组合物，该组合物包括活性药物成分和制药 上可接受的载体，其中所述活性药物成分包括儿茶酚丁烷，所述载体包 括选自由下述物质组成的组的增溶剂和赋性剂中的至少一种：(a)除二 甲亚砜外的水溶性有机溶剂；假如当所述水溶性有机溶剂为丙二醇时， 所述丙二醇不含白凡士林、不含黄原胶(也被称为xantham gum和xanthum gum)且不含甘油或甘氨酸中的至少一种，当所述水溶性有机溶剂为聚乙 二醇时，所述聚乙二醇在不含抗坏血酸或丁化羟基甲苯(butylated hydroxytoluene)(“BHT”)下存在，以及当所述聚乙二醇为聚乙二醇400 时，所述聚乙二醇400在不含聚乙二醇8000下存在；(b)环糊精；(c) 离子、非离子或两性表面活性剂，假如当所述表面活性剂为非离子表面 活性剂时，所述非离子表面活性剂在不含黄原胶下存在；(d)改性纤维 素；(e)除蓖麻油外的水不溶性脂质；以及所述载体(a)-(e)的任意 组合。
本发明还包括治疗受试者疾病的方法，包括：(a)提供本发明的组 合物；以及(b)通过将所述组合物注射入受试者而将所述组合物进行给 药，其中所述组合物包括有效量的所述活性药物成分。
此外，本发明包括治疗疾病的试剂盒，包括本发明的组合物及其使 用说明。
附图说明
当结合附图阅读时，可更好地理解前述发明内容，以及随后本发明 的详细描述。为了起到说明本发明的目的，在附图中示出了目前优选的 实施方案。然而应当理解的是，本发明不限于所示的实施方案。
在附图中：
图1包括图1A和图1B，示出了在M4N治疗后，对C-33A细胞系和 HeLa细胞系进行的细胞增殖分析结果。图1A是M4N处理后存在的细胞 数量相对无M4N处理的细胞数量的比例的图示，其中提供的M4N量在 DMSO配方中从0μM至80μM变化。图1B是M4N处理后存在的细胞数 量相对无M4N处理的细胞数量的比例的图示，其中提供的M4N量在 HP-β-CD/PEG配方(“CPE”配方)中从0μM至80μM变化。
图2包括图2A和图2B，是基于DMSO配方中(图2A)或 HP-β-CD/PEG配方中(图2B)存在或不存在各种浓度的M4N时，C-33A 细胞和HeLa细胞的死亡细胞的百分比的细胞死亡测量结果的图示。M4N 的浓度在0μM至80μM之间。
图3包括图3A和图3B，是向狗一次IV给药M4N后，在第1天内 狗血清中浓度随时间的效果图示，所述M4N在包括30％(w/v)羟丙基β- 环糊精(“HP-β-CD”)和25％(v/v)PEG 300的配方中。图3A采用非对 数比例，图3B采用浓度的对数比例。
具体实施方式
本发明提供一种用于疾病治疗的新型组合物，试剂盒及方法，所述 疾病包括诸如癌症和牛皮癣的增生疾病，高血压，肥胖症，I型或II型糖 尿病，包括但不限于疼痛、阿兹海默氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化、帕 金森氏症、痴呆、中风的中枢神经系统疾病或神经变性疾病，以及炎症， 癌变前瘤形成(premalignant neoplasia)或发育异常，包括诸如人类免疫 缺陷病毒(“HIV”)、人类嗜T淋巴细胞病毒(“HILV”)、人类乳突病毒 (“HPV”)、单纯疱疹病毒(“HSV”)、乙型肝炎病毒(“HBV”)、Epstein-Barr 病毒(“EBV”)、水痘-带状疱疹病毒、腺病毒、细小病毒、Jakob Creutafeldt 病毒(“JC病毒”)或其他病毒的病毒性感染的传染性疾病。
本发明提供一种新型的组合物，所述组合物包括溶解在某些制药上 可接受的增溶剂中的含诸如NDGA衍生物，例如M4N的NDGA化合物 的儿茶酚丁烷，所述儿茶酚丁烷与其他稀释剂，赋性剂及类似成分(共 称为“载体”)组成适于向诸如人的受试者注射以治疗疾病的配方。这种 配方适于注射，例如静脉注射。适合的制药上可接受的载体包括选自下 列的至少一种：(a)除DMSO外的水溶性有机溶剂，如聚乙二醇(“PEG”)， 例如PEG300、PEG400、或PEG400单月桂酸酯，丙二醇(“PG”)，聚乙 烯吡咯烷酮(“PVP”)，乙醇，苄醇或二甲基乙酰胺；(b)环糊精或改性 的环糊精，如羟丙基-β-环糊精(“HP-β-CD”)或磺丁醚-β-环糊精 (“SBE-β-CD”)；(c)离子、非离子或两性表面活性剂，如为非离子表面 活性剂的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(也被称为聚山梨醇酯)，例如 作为Tween20或Tween80可商业获得的聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯 80，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(d-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate)(“TPGS”)，单油酸甘油酯(也被称为甘油单油酸 酯)，以CremophorEL可商业获得的、乙撑氧和蓖麻油以35∶1的摩尔 比率的酯化脂肪酸或反应产物；(d)改性的纤维素，如乙基纤维素(“EC”)， 羟丙基甲基纤维素(“HPMC”)，甲基纤维素(“MC”)或羧基甲基纤维素 (“CMC”)；以及(e)水不溶性脂质，如油或脂肪乳状液，例如Intralipid。 优选地，当使用PG时，其在不含白凡士林，不含黄原胶，以及不含甘油 或甘氨酸中的至少一种的情况中使用。优选地，当使用PEG时，其在不 含抗坏血酸或BHT的情况中使用；当使用非离子表面活性剂时，其在不 含黄原胶的情况中使用；以及所述油不是蓖麻油。
在本发明的一个实施方案中，所述化合物溶解在PEG300，PEG400 或PEG400单月桂酸酯(“PEG”化合物)中。优选地，当使用PEG400时， 其在不含PEG8000下存在。在另一个实施方案中，所述化合物溶解在改 性的环糊精中，如HP-β-CD中。在另一个实施方案中，本发明的化合物 溶解和稀释在含一种或多种PEG化合物和HP-β-CD的结合配方中。在又 一个实施方案中，在结合配方中所述PEG化合物可以改性的纤维素替代 或与之结合。为了达到发明目的，本发明化合物的溶解可在室温或经加 热进行。当在溶解过程中使用加热时，那些在冷却后使本发明的化合物 保持在溶液中的增溶剂尤其有用。
在本发明的又另一个实施方案中，所述儿茶酚丁烷或NDGA化合物 溶解在改性的纤维素如EC或HPMC中。在使用前，可将EC稀释在乙 醇(“EtOH”)中。
本发明还提供水不溶性脂质作为本发明化合物的增溶剂。所述水不 溶性脂质包括，例如油及混合的脂肪乳状液组合物，如Intralipid (Pharmacia & Upjohn，现在为Pfizer)，根据制造商的建议使用。例如， 推荐的成人剂量不超过2g脂肪/kg体重/天(分别为20mL，10mL及 6.7mL/kg的Intralipid10％，20％及30％)。Intralipid10％被认为在 1000mL中含有：纯化豆油100g，纯化卵磷脂12g，无水甘油22g，注射 用水补足1000mL。pH以氢氧化钠调节至约pH8。Intralipid20％在 1000mL中含有：纯化豆油200g，纯化卵磷脂12g，无水甘油22g，注射 用水补足1000mL。pH以氢氧化钠调节至约pH8。Intralipid30％被认为 在1000mL中含有：纯化豆油300g，纯化卵磷脂12g，无水甘油16.7g， 注射用水补足1000mL。pH以氢氧化钠调节至约pH7.5。这些Intralipid 产品被储存在低于25℃的受控室温下且不应当冰冻。
在另一个实施方案中，本发明或单独或与其他油结合或与任一种或 多种PEG化合物和Tween20或Tween80结合提供玉米油，芝麻油， 薄荷油，豆油，矿物油，甘油。
本发明还包括增溶剂材料，如丙二醇及前述物质的任意组合。
此外，本发明包括将所述组合物注射或输注入动物体内的适合材料， 例如静脉(“IV”)管，其适于本发明配方的输送。适合的管包括由诸如 聚四氟乙烯(“PTFE”)的聚合物单独或与诸如CHEM-Sure(Barnant公 司)的氟橡胶、聚乙烯、聚丙烯、氟化乙烯丙烯(“FEP”)，Teflon及铂 处理硅橡胶(小尺寸)(Cole-Parmer)等等的结合的聚合物制成的管。
本发明根据下列定义可被更清楚地理解，所述定义与本文其他地方 定义的术语一起使用：
本文使用涉及浓度或剂量的术语“约”是指具体数值的至多±10％至 20％。
本文使用的术语“活性药物成分”，“API”或涉及“化合物”是指存在于 本文所述药物组合物中的任何式I的儿茶酚丁烷或NDAG化合物，诸如 NDGA衍生物。
本文使用的“亚烃基二氧基(alkylene dioxy)”是指亚甲基二氧基 (methylene dioxy)或取代的亚甲基二氧基，或者次乙基二氧基(ethylene dioxy)或取代的次乙基二氧基。
本文使用的涉及式I或式II中-R基之一的“未取代或取代的氨基酸残 基或其盐”是指氨基酸残基或取代的氨基酸残基，包括但不限于：丙氨酸， 精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸， 组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝 氨酸，苏氨酸、色氨酸，酪氨酸，缬氨酸，5-羟赖氨酸，4-羟脯氨酸，甲 状腺氨酸，3-甲基组氨酸，ε-N-甲基赖氨酸，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，氨 基己二酸，γ-羧基谷氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸，磷酸酪氨酸，N- 甲基精氨酸，N-乙酰赖氨酸，以及N，N-二甲基取代的氨基酸残基，或前 述任一种的盐，如氯盐。
此处适于使用的“缓冲剂”包括在本领域中常规的任何缓冲剂，如， Tris，磷酸盐，咪唑，及重碳酸盐。
此处使用的“载体”是指无毒固体、半固体或液体填料、稀释剂、赋 形剂(vehicle)、赋形剂(excipient)、增溶剂、任何常规类型的胶囊材料或 配方辅料，以及包括除所述活性药物成分之外的所有组合物成分。所述 载体可含另外的试剂，诸如润湿或乳化剂，或pH缓冲剂。如果需要，可 加入其他的材料，如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂，及类似的试剂。
此处使用的“儿茶酚丁烷”是指式I的化合物：
其中R1和R2各自独立地表示-H，低级烷基，低级酰基，亚烃基；或-R1O 和-R2O各自独立地表示未取代或取代的氨基酸残基或其盐；R3，R4，R5， R6，R10，R11，R12和R13各自独立地表示-H或低级烷基；及R7，R8和R9各自独立地表示-H，-OH，低级烷氧基，低级酰氧基，未取代或取代的氨 基酸残基或其盐，或者合起来可为亚烃基二氧基的任何两个相邻的基团。
此处使用的“环糊精”是指未改性的环糊精或改性环糊精，包括且不 限于α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精以及其上含修饰的任何改性的环糊 精，诸如HP-β-CD或SEB-β-CD。环糊精通常具有6(α-环糊精)，7(β- 环糊精)，和8(γ-环糊精)糖，每糖最多达3个取代基，因此可有0-24 个初级取代基(初级取代基被定义为直接与环糊精环相连的取代基)。 本发明使用的改性或未改性的环糊精可具有任意适合数量和定位的初 级取代基或其他修饰。
此处使用的NDGA的“衍生物”是指“NDGA衍生物”(见下文)。
此处使用的“疾病”包括所有应用本发明的组合物能产生治疗效果的 疾病、不适、感染、综合病症或紊乱。这些“疾病”包括但不限于癌症、 牛皮癣及其他增生疾病、炎症性紊乱包括风湿性关节炎、骨关节炎、溃 疡性结肠炎、克罗恩氏病、动脉硬化症、慢性阻塞性肺疾病(“COPD”)、 高血压、肥胖、糖尿病、疼痛、中风和/或其他神经紊乱或神经变性疾病 或病症，包括阿兹海默氏症、帕金森氏症、多发性硬化、肌萎缩性脊髓 侧索硬化(“ALS”)及癌变前疾病诸如上皮内瘤变或发育异常，以及感染 性疾病。
此处使用的“G4N”或“四-N，N-二甲基甘胺酰NDGA”或“四-二甲基甘 胺酰NDGA”是式II(见下)的NDGA衍生物，其中R14，R15，R16和R17各自独立地表示-O(C＝O)CH2N(CH3)2或-O(C＝O)CH2N+(CH3)2·Cl-，以固 体形式或在溶液中；以及R18和R19各自表示-CH3。
此处使用的“低级酰基”是指C1-C6酰基，优选地，C1-C3酰基。
此处使用的“低级烷基”是指C1-C6烷基，优选地，C1-C3烷基。
此处使用的“M4N”或“四-O-甲基NDGA”是式II(见下)的NDGA衍 生物，其中R14，R15，R16和R17各自独立地表示-OCH3，以及R18和R19各自表示-CH3。
此处使用的“改性纤维素”是指在纤维素分子上含一个或多个的修饰 基团的纤维素，包括，如，EC、HPMC、CMC和MC。
此处使用的“NDGA”是指去甲二氢愈创木酸并具有下式：
此处使用的“NDGA化合物”是指单独地或集合的NDGA和/或NDGA 衍生物的任意一种或多种。
此处使用的“NDGA衍生物”是指式II的NDGA衍生物
其中R14，R15，R16和R17各自独立地表示-OH，低级烷氧基，低级酰氧基， 或未取代或取代的氨基酸残基或其药物上可接受的盐；以及R18和R19各 自独立地表示-H或低级烷基，其中R14，R15，R16和R17不同时为-OH。 因此，该式包括NDGA的甲基化衍生物的化合物，如四-O-甲基NDGA (M4N)，三-O-甲基NDGA(M3N)，二-O-甲基NDGA(M2N)及单-O- 甲基NDGA(M1N)。可选地，NDGA衍生物可为NDGA的羟基或甲基 上的一个或多个氢原子被取代的化合物，诸如，例如其中R14，R15，R16和R17各自独立地表示低级烷氧基，低级酰氧基，或者氨基酸或取代的氨 基酸或其盐；以及R18和R19各自独立地表示-H或烷基，如低级烷基。该 术语包括，例如，一化合物，所述化合物的R14，R15，R16和R17各自独 立地表示-OCH3或-O(C＝O)CH3或双取代的氨基酸残基，如N，N-双甲基 取代的氨基酸残基，诸如-O(C＝O)CH2N(CH3)2或 -O(C＝O)CH2N+(CH3)2·Cl-；以及R18和R19各自独立地表示-H或低级烷基， 如-CH3或-CH2CH3。
此处使用的“百分比”，“百分数”或符号“％”是指组合物中所示的成分 基于组合物中载体含量关于重量/重量(w/w)，重量/体积(w/v)或体积/ 体积(v/v)的百分比，相对于任何特定的组分，都基于组合物中存在的 载体含量。因此，所示不同类型的载体存在的含量达100％，其并不排除 API的存在，API的量表示为％或存在于组合物中几毫克或存在于组合物 中的几mg/ml，其中％或mg/ml基于存在于组合物中的载体总量。某些类 型的载体可结合存在达到100％的载体。
此处使用的“药学上可接受的载体”在使用的剂量和浓度上对接受者 无毒，并能与配方的其他成分相容。例如，用于含本发明的儿茶酚丁烷， NDGA化合物或NDGA衍生物的配方的载体优选地不包括氧化剂和其他 已知的对其不利的化合物。药学上可接受的载体包括增溶剂。适合的药 学上可接受的载体包括但不限于水，右旋糖，甘油，盐水，乙醇，缓冲 剂，CremaphorEL，磷酸缓冲盐水，PEG 300，PEG 400，改性环糊精， 及其结合，所有物质见前所述。
术语“药学上可接受的赋性剂”，包括赋形剂，佐剂，或稀释剂或其 他辅料，如本领域中常规的，公众可获得，并且在使用的剂量和浓度上 对接受者无毒，并能与配方的其他成分相容的这些。例如，药学上可接 受的辅料包括pH调节和缓冲剂，浸透压调节剂，稳定剂，润湿剂等。
此处使用的术语“增溶剂”是指其中一种或多种儿茶酚丁烷或NDGA 化合物，如NDGA衍生物溶解的组合物。增溶剂也可为载体或药学上可 接受的载体。
术语“受试者”，“宿主”和“患者”在此处可互换使用，是指用本发明的 组合物进行治疗的动物，包括但不限于猿、人类、猫科动物、犬科动物、 马科动物、牛、猪、绵羊、山羊、哺乳耕畜、哺乳赛畜，及哺乳宠物。
此处用于给药的涉及儿茶酚丁烷或NDGA化合物或衍生物“基本纯 的”化合物为基本不含不是儿茶酚丁烷、NDGA化合物或NDGA衍生物 的物质(以下称为“非NDGA物质”)的化合物。基本不含是指至少约50％ 不含非NDGA物质，优选地至少约70％，更加优选地至少约80％，更加 优选地至少约90％及还更优选地至少约95％不含非NDGA物质。
此处使用的术语“治疗(treatment)”，“处理(treating)”等是指获得 所需的药理和/或生理效果。所述效果根据完全地或部分地预防病症或疾 病或其症状可为预防性的，和/或根据完全地或部分地治疗病症或疾病和/ 或病症或疾病导致的有害影响可为治疗性的。“治疗”，因此，例如，包 括哺乳动物尤其是人类的状况或疾病的任何治疗，其包括：(a)预防病 症或疾病在受试者体内发生，所述受试者易患所述病症或疾病但还未诊 断患病；(b)抑制所述病症或疾病，诸如，阻止其发展；以及(c)解除、 减轻或改善所述病症或疾病，诸如使所述病症或疾病消退。
在进一步阐述本发明之前，应当理解的是本发明并不限于所述的特 定实施例，因为这些实施例当然可以变化。还应当理解的是此处使用的 术语旨在描述特定的实施例而并不意在限制，因为本发明的范围仅受所 附的权利要求限制。
当提供值的范围时，应当理解的是各居间值，除文中清楚地另外指 出，至较低限值的单位的十分之一，在该范围较高和较低限值之间或在 所述范围中任何其他所述或居间值，被包括在本发明中。除了在所述范 围中明确排除的界限，这些更小范围的较高和较低限值可独立地包括在 所述更小的范围中，并也包含在本发明中。当所述范围包括一种或多种 所述界限，排除任一种或两种那些被包括的界限的范围也包括在本发明 中。
必须注意的是，在此使用的单数形式“一(a)”，“一(an)”，和“该 (the)”包括复数物，除非文中清楚表示不是。因此，例如，提到“一化 合物”包括许多这种化合物，提到“该NDGA化合物”包括提到一种或多种 NDGA化合物，诸如NDGA衍生物及本领域普通技术人员已知的其等同 物。
此处提及的所有出版物，包括专利、专利申请，及杂志文章通过引 用整体并入此处，所述整体包括其中引用的参考文献，所述参考文献也 通过整体引用并入此处。
此处讨论的出版物仅提供在本申请提交日之前的公开内容。这并不 应当理解为本发明由于在先申请无资格先于这些出版物。此外，提供的 出版物的日期可能不同于实际出版日期，其需要各自地确认。在本申请 中文中提及的参考文献的引文在权利要求之前详细列在文献目录中。
对本发明的下列描述仅以实施例的方式给出，并不意指对本发明的 任何限制。
儿茶酚丁烷的制备
本发明的儿茶酚丁烷可通过本领域中任何已知的方法进行制备。例 如，如美国专利5,008,294所述制得的这些化合物。
NDGA衍生物的制备
NDGA可从任何可获得的商业来源购买，诸如美国加利福尼亚州圣 地亚哥的Alexis Biochemicals公司(目录号LKT-N5669)，或美国加利福 尼亚州圣地亚哥的A.G.Scientific公司(目录号N1071)，或美国密歇根 州安阿伯的Cayman Chemical公司(目录号70300)。
NDGA衍生物及其配方可通过本领域中任何常规的方法进行制备。 例如，NDGA衍生物可如美国专利5,008,294；美国专利6,291,524；Hwu， J.R.等人(1998)；或McDonald，R.W.等人(2001)所述进行制备。
在本发明的一个实施例中，一NDGA衍生物，四-O-甲基NDGA， 还被称为meso-1，4-双(3，4-二甲氧基苯基)-2，3-二甲基丁烷，或M4N， 如下制得：在反应烧瓶中制备含NDGA和氢氧化钾的甲醇溶液。然后， 向该反应烧瓶中加入硫酸二甲酯并允许反应进行。最终用水骤冷反应， 使产物沉淀。通过过滤分离沉淀及在真空干燥箱中干燥。然后，该化合 物在二氯甲烷和甲苯的溶液中溶解，并随后通过氧化铝层析柱进行纯化。 通过旋转蒸发除去溶剂，所述固体被重新悬浮在异丙醇中并通过过滤进 行分离。滤饼在真空干燥箱中干燥。通过将所述滤饼在异丙醇中回流及 通过过滤重新分离结晶而使所得的四-O-甲基NDGA(M4N)结晶。
在本发明的一些实施例中，本发明的某些NDGA衍生物，诸如G4N， 也被称为meso-1，4-双[3，4-(二甲氨基乙酰氧基)苯基]-(2R，3S)-二甲基丁烷 或四-二甲基甘胺酰NDGA，或者其氢氯酸盐，及具有氨基酸取代基的类 似化合物，也可通过常规的方法进行制备，如例如美国专利6,417,234所 述。
治疗组合物的制备
本发明提供包括药物组合物的组合物，其包括含NDGA化合物诸如 NDGA衍生物的作为活性药物成分(“API”)的儿茶酚丁烷，以及药学上 可接受的载体或赋性剂。通常，本发明的组合物含小于约0.1％(w/v)至 约99％(w/v)的活性药物成分或API，即所述儿茶酚丁烷、包括此处的 NDGA化合物和NDGA衍生物；可选地，本发明可含约2％(w/v)至约 90％(w/v)的API。
本发明还提供组合物，在所述组合物中，所述儿茶酚丁烷，如NDGA 衍生物，例如M4N存在的浓度为约1mg/ml至约200mg/ml，或者约10 mg/ml至约175mg/ml，或者约20mg/ml至约150mg/ml，或者约30mg/ml 至约125mg/ml，或者约40mg/ml至约100mg/ml，或者约50mg/ml至 约75mg/ml。在一个实施方案中，此处NDGA化合物的浓度约1mg/ml， 约2mg/ml，约2.5mg/ml，约5mg/ml，约10mg/ml，约15mg/ml，约 20mg/ml，约25mg/ml，约30mg/ml，约35mg/ml，约40mg/ml，约45 mg/ml，约50mg/ml，约55mg/ml，约60mg/ml，约75mg/ml，约80mg/ml， 约90mg/ml，约100mg/ml，约120mg/ml，约125mg/ml，约150mg/ml， 约175mg/ml或约200mg/ml。
可选地，本发明的其他实施方案的组合物可含小于约0.1mg至约 200mg或更多的API，如约10mg，约20mg，约25mg，约30mg，约40mg， 约50mg，约60mg，约75mg，约100mg或约200mg的API。
药学上可接受的载体或赋性剂可含一种或多种增溶剂，所述API溶 剂在所述增溶剂中。所述药学上可接受的载体或赋性剂还可含稀释剂。
在一个实施方案中，本发明提供一种增溶剂，所述增溶剂含一种或 多种除DMSO之外的水溶性有机溶剂。优选地水溶性有机溶剂有乙醇， 苄醇，二甲基乙酰胺，PVP，PG和诸如：PEG 300，PEG 400，或PEG 400 单月桂酸酯的PEG化合物。在本发明组合物中的PEG化合物提供的量为 约5％至约100％，或约5％至约60％，或约10％至约90％，或约20％至 约80％，或约30％至约70％，或约40％至约60％，所有的浓度为体积/ 体积(v/v)百分比。PG存在的浓度约2.5％至约100％(v/v)。
在本发明组合物中的PEG化合物的浓度可依据存在的其他增溶剂或 稀释剂或赋性剂而变化。例如，本发明的PEG 300，PEG 400或PEG 400 单月桂酸酯浓度可在约5％，约10％，约12.5％，约15％，约20％，约 25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％， 约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％或约95％，给出的 所有浓度为体积/体积(v/v)百分比。
本发明还提供儿茶酚丁烷或NDGA化合物在环糊精中的组合物，所 述环糊精包括改性环糊精。例如，此处的环糊精可为α-环糊精、β-环糊 精、γ-环糊精，及改性环糊精包括HP-β-CD和SEB-β-CD。在一个实施例 中，本发明的组合物含有的改性环糊精的浓度为约5％至约80％，或约 10％至约70％，或约20％至约60％，或约30％至约50％，给出的所有浓 度为重量/体积(w/v)百分比。
在又另一个实施例中，改性的环糊精，诸如HP-β-CD，在组合物中 存在的浓度为约12.5％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％， 约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％或约75％， 给出的所有浓度为重量/体积(w/v)百分比。
其中，可单独或与本发明的组合物中其他物质一起使用的其他药学 上可接受的载体或赋性剂为离子、非离子或两性表面活性剂，如 CremophorEL，为非离子表面活性剂的聚山梨醇酯例如作为Tween20 或Tween80可商业获得的聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80，为两性表面 活性剂的TPGS。适合的表面活性剂的另外实例包括而不限于单油酸甘油 酯及酯化的脂肪酸，诸如通常由植物油的酯交换反应制成的这些，可以 多种种类和等级获得，如美国新泽西州，帕拉母斯，Gattefosse公司的 Labrafil，Labrasol，及Gelucire。表面活性剂可以任何所需的有效量 存在，如以浓度为约1％(v/v)至约100％(v/v)，优选地为约9％(v/v) 至约80％(v/v)，以及更加优选地，约10％(v/v)至约50％(v/v)。在 一个具体的实施例中，优选的非离子表面活性剂的浓度为浓度为约9％ (v/v)至约100％(v/v)的Tween20，及浓度为约33％(v/v)至约100％ (v/v)的Tween80。所有表面活性剂的百分比为体积百分比(v/v)。
在本发明的组合物中单独使用或配合使用的另一个制药上可接受的 载体或赋性剂是改性纤维素，诸如EC、HPMC、MC和CMC。改性纤维 素可以任何所需的有效量存在，如浓度为约0.1％至约25％，或约0.5％至 约7.5％，或约1.0％至约5％。在一个具体的实施例中，EC存在的浓度可 为约5％至约20％；HPMC存在的浓度可为约0.5％至约1％；MC存在的 浓度可为约1％至约3％；及CMC存在的浓度可为约1％至约4％。改性 纤维素的百分比以重量每体积(w/v)计。
在本发明的组合物中单独使用或配合使用的其他制药上可接受的载 体或赋性剂是水不溶性脂质，诸如油或混和的脂肪乳剂。油的例子包括 玉米油、芝麻油、薄荷油、大豆油、矿物油和甘油。混和的脂肪乳剂可 如前所述获得，如Intralipid乳剂。
所述水不溶性载体可与任何一种或多种水溶性载体结合使用，如 PEG化合物和表面活性剂，如Tween20或Tween80。
所述水不溶性脂质载体可以任何所需的有效量存在，如以浓度为约 10％(v/v)至约100％(v/v)，或约15％(v/v)至约85％(v/v)，或约 25％(v/v)至约75％(v/v)。油存在的浓度可为约9％(v/v)至约100％ (v/v)。混和脂肪乳剂存在的浓度可为约10％(w/v)至约30％(w/v)； 及优选约20％(w/v)。
如前所述，各种载体成分的结合可与API一起使用。目前优选的一 个非限制性实施例为10mg/ml M4N在25％(w/v)PEG 300，30％(w/v) HP-β-CD，余量的适于注射入动物的水(“WFI”，其在制药工业中代表水 的验证级别)的载体中的组合物。在这个优选的实施方案中，所述 HP-β-CD具有6至8度的取代，但如前所述，在其他实施例中的其他取 代也落入本发明的范围内。
应当理解的是，只要所述儿茶酚丁烷溶解和保存在溶液中，就可向 所述溶液加入一种或多种所述增溶剂或稀释剂或赋性剂，以最优化该溶 液向需要此种治疗的患者的输送。
在另一个实施例中，本发明提供一种稀释剂，所述稀释剂为适于注 射的盐水或水。在本发明的一方面，当所述药物组合物的同渗容摩较高 时，使用注射用水作为稀释剂。
适于此处使用的制药上可接受的载体或稀释剂已在多种出版物中描 述。有用的载体或赋性剂的例子被描述在，例如Gennaro，A.R.(2003)； Ansel，H.C.等人(2004)；Rowe，R.C.等人(2003)；以及Garg，S.等人(2001) 中。
液体形式的组合物可包括缓冲液，所述缓冲液根据儿茶酚丁烷或 NDGA化合物，如NDGA衍生物的所需应用进行选择，且还可包括适于 所需使用的其他物质。本领域普通技术人员可容易地选择一种适于所需 应用的适当的缓冲液，各种缓冲液被本领域所公知。
治疗方法
人们发现，含儿茶酚丁烷，包括NDGA化合物的组合物在患有许多 疾病、需要治疗的患者上用作治疗剂或用于治疗，在这些治疗中，可使 用这些儿茶酚丁烷或NDGA化合物。
本发明提供用于疾病治疗的方法和组合物，所述疾病包括，例如， 增生疾病诸如良性和恶性肿瘤，牛皮癣及癌前疾病和瘤形成，诸如上皮 内瘤形成，或发育异常。本发明还提供糖尿病包括I型和II型糖尿病、 肥胖和包括心脏血管的疾病、中风和高血压的并发症的治疗。本发明进 一步提供炎症包括类风湿性关节炎、骨关节炎、多发性硬化、溃疡性结 肠炎、克罗恩氏病、慢性阻塞性肺疾病(“COPD”)和其他免疫系统相关 疾病的治疗。此外，本发明提供神经系统疾病，包括中枢神经系统疾病 和神经变性疾病如阿兹海默氏症、痴呆、肌萎缩性脊髓侧索硬化和帕金 森氏症的治疗。在另一个实施例中，本发明提供传染性疾病，诸如包括 需要Sp1结合的转录或复制的病毒感染的治疗。需要Sp1结合的病毒的 例子包括：HIV、HTLV、HPV、HSV、HBV、EBV、水痘-带状疱疹病毒、 腺病毒、细小病毒和JC病毒。
根据本发明的方法可治疗各种动物宿主，所述动物宿主包括人类或 非人类动物。一般地，这些宿主为“哺乳类”或“哺乳动物”，被广泛地用于 描述属于哺乳动物纲的生物体的这些术语包括食肉动物目(如狗和猫)、 啮齿类(例如豚鼠，和家鼠)，及其他哺乳动物，包括牛、山羊、马、绵 羊、兔、猪，及灵长类(例如，人类、黑猩猩及猴子)。在许多实施例中， 所述宿主为人类。动物模型用于实验研究，如提供治疗人类疾病的模型。 此外，本发明还可应用于兽医。
配方、剂量，及给药途径
在本发明的一个实施例中，将有效量的本发明组合物向宿主进行给 药，其中“有效量”是指足以产生所需结果的剂量。在一些实施例中，所 需的结果至少为对瘤形成或发育异常进程的抑制。
给药的合适剂量取决于被治疗的宿主，诸如该宿主的健康情况、宿 主的年龄、疾病或病症的状态、宿主的体重、肿瘤的大小。通常，对于 儿童可以约0.1mg至约500mg或更少进行给药，及对于成人可以约0.1mg 至约5g或更少进行给药。通常剂量在约10mg活性药物成分每kg受试者 体重至约600mg活性药物成分每kg受试者体重的宽范围中。所述活性剂 可单独或更通常以复合剂量进行给药。本领域普通技术人员通过各种方 法可容易地确定所给试剂的优选剂量。通过用常规试验建立的剂量响应 曲线，本领域普通技术人员可容易地确定其他有效剂量。当然，试剂的 量将随具体使用的试剂而变化。
所述活性试剂的给药频率及剂量将由护理人员基于年龄、体重、疾 病状态、健康状态和患者的应答进行确定。因此，所述试剂可以每天、 每周、每月一次或多次，或者如常规确定的适当次数进行给药。所述试 剂可以间歇地进行给药，诸如进行几天、几周或几月的给药期，然后直 到过一段时间如3或6个月再继续，接着再进行几天、几周或几月的给 药。
在药物剂型中，所述活性试剂可单独或与其他药物活性剂或治疗剂 适当联合，以及结合给药，所述其他药物活性剂或治疗剂包括小分子、 抗体或蛋白质治疗剂。下面的方法和实施例仅仅为示例而并非对本发明 的限制。
此外，如果需要，所述载体或赋性剂可含少量的辅助物质，如pH调 节和缓冲剂、浸透压调节剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂。制备所述药剂 形式的实际方法为公知，或者对本领域普通技术人员而言现而易见。可 参见，例如Remington’s Pharmaceutical Science，第20版，Mack Publishing Co.Rawlins EA，(1997)。用于给药的组合物或配方在任何情况中含足以 在治疗宿主中取得所需状态的API量。
用于注射或静脉给药的单位剂型可包括组合物中的API，如无菌水、 生理盐水或其他制药上可接受的载体的溶液。
此处使用的术语“单位剂型”是指适于作为人或动物宿主的单一剂量 的物理分散单位，各单位含预定量的本发明的API，所述预定量以足以结 合制药上可接受的稀释剂、载体或赋性剂产生所需效果的量计算。本发 明的新单位剂型的规格取决于所使用的特定化合物和要达到的效果，及 与宿主中各化合物相关的药效学。
本发明包括所述活性试剂的多或单剂量的试剂盒。在该试剂盒中， 除了存放多或单剂量含儿茶酚丁烷如NDGA化合物的组合物的容器，有 内插说明书的资料包，所述说明书描述了在治疗关心的疾病状态中该药 物的使用和伴随优点。可选地，本发明组合物的给药器包括在各试剂盒 中。
本发明的可注射的组合物可以以适于待治疗的疾病和本领域常规的 方式用非肠道给药，包括静脉地、动脉内地、腹膜内地、皮下地和泡囊 内地(intravesicularly)给药。尽管本发明的组合物规定为注射给药，其 也适于通过其他途径给药，例如通过局部的、鼻内的、吸入或植入给药。
下面列出的例子为示例性的，并不能解释为对本发明的限制。
实施例1.含M4N的HP-β-CD和/或PEG 300配方
在这个实施例中，M4N如PCT/US2004/016117中的描述进行制备， 并在增溶剂中溶解。所得溶液可选地与赋性剂和/或稀释剂进行混合。所 述增溶剂和赋性剂可互换地使用，或相互结合使用。使用的增溶剂或赋 性剂之一为内毒素控制的羟丙基-β-环糊精(“HP-β-CD”)，其获得自 Research Diagnostics公司(目录号RDI-82004HPB，批号H3N188P)(佛 兰德斯，美国新泽西)。其他使用的增溶剂或赋性剂为PEG300，获得自 Spectrum Chemicals公司(目录号P0108，批号TB1228)(加德纳，美国 加利福尼亚)。
在本发明的一个实施例中，HP-β-CD和PEG300以单配方存在。为 了制得这个配方，首先将M4N溶解在PEG300中以形成M4N的PEG300 溶液(“M4N/PEG 300”)。随后，将M4N/PEG 300溶液加入至预制备的 HP-β-CD溶液中，以形成PEG 300和HP-β-CD中的M4N溶液(此后称 为“CPE配方”)。
当制备所述HP-β-CD溶液时，必须考虑体积膨胀。例如，对于40％ (w/v)HP-β-CD溶液，必须考虑0.7mL/g的体积膨胀(即，0.7mL的水 置换了所加入的每克HP-β-CD)。
用作增溶剂和/或赋性剂的40％HP-β-CD的100mL溶液如下制备：将 65mLWFI置于含搅拌棒的玻璃烧杯中。将该烧杯置于磁力平台，设置搅 拌棒以中速搅拌。将约40g HP-β-CD缓慢地加入至搅拌中的WFI，使用 刮勺将HP-β-CD导向烧杯的中央，以防止HP-β-CD结晶而粘在烧杯壁上。 该HP-β-CD溶液被搅拌约24小时，或者直到目视观察下HP-β-CD完全 溶解。所得的溶液测得约93mL。将约7mL WFI加入至该所得溶液以获 得100mL，制得约40％HP-β-CD的最终溶液。将所述最终溶液搅拌约1 小时，在室温下储存，并避免阳光。这个制备改性环糊精溶液的方法可 被按比例放大或缩小以获得所需的体积或浓度。其他浓度或其他改性环 糊精溶液可类似地制得，例如，通过将HP-β-CD替代为其他改性环糊精， 在上述的方法中调节至适当的浓度。
40％HP-β-CD中约10mg/mL浓度的10mL M4N溶液如下制备：将约 10mL的40％HP-β-CD溶液加入至含搅拌棒玻璃烧杯中。将该烧杯置于磁 力平台，设置搅拌棒以中速搅拌。将约10mg M4N缓慢地加入至 40％HP-β-CD，在刮勺的帮助下加入至烧杯的中央。该M4N/40％HP-β-CD 混合物被搅拌约2小时，或者直到所有的M4N均匀悬浮而不存在任何结 块。可选地，该M4N/40％HP-β-CD混合物可在80℃加热30min。(或者 如果需要更大的溶液体积，更长时间，例如，100mL该M4N/HP-β-CD 混合物在80℃加热1hr)，或需要确保M4N充分溶解的更长时间。通过将 烧杯对着白色背景、之后对着黑色背景寻找是否存在颗粒，可观察所述 M4N/HP-β-CD混合物或溶液是否存在任何未溶解的M4N。最终的 M4N/40％HP-β-CD溶液在室温储存，并避光保存。这个方法可按比例放 大或缩小以获得M4N的所需体积或浓度。含M4N的其他环糊精溶液的配 方可类似地制备，例如，通过将上述方法中的HP-β-CD用其他环糊精取 代。在表1中示出的结果说明，冷却后在溶液中的M4N保持在 40％HP-β-CD配方中的1mg/mL和10mg/mL的浓度大于7天。
PEG 300中约25mg/mL浓度的100mL M4N溶液如下制备：将约 100mL PEG 300加入至含搅拌棒玻璃烧杯中。将该烧杯置于磁力平台， 设置搅拌棒以中速搅拌。将约2.5g M4N缓慢地加入至PEG 300，在刮勺 的帮助下加入至烧杯的中央。该M4N/PEG 300混合物被搅拌约24小时， 或者直到所有的M4N均匀悬浮而不存在任何结块。可选地，该M4N/PEG 300混合物可在60℃加热30min。(或者如果需要更大的溶液体积，更长 时间，例如，500mL该M4N/PEG 300混合物在60℃加热1hr)，或需要确 保M4N充分溶解的更长时间。通过将烧杯对着白色背景、之后对着黑色 背景，观察微粒的存在，可观察所述M4N/PEG 300混合物或溶液是否存 在任何未溶解的M4N。在观察到所有的M4N溶解之后，所得的M4N/PEG 300溶液立即使用或在48hr的有效期之前使用，否则可形成结晶或其他 沉淀。如果结晶形成，M4N/PEG 300溶液可伴随搅拌，在热磁性台上在 60℃重新加热1hr，直到所有的M4N溶解回溶液中。最终的M4N/PEG 300 溶液在室温储存，并避光保存。这个方法可按比例放大或缩小以获得M4N 的所需体积或浓度。含M4N的其他PEGs溶液的配方可类似地制备，例 如，通过将上述方法中的PEG 300用PEG 400或PEG 400单月桂酸酯取 代。
通过向位于磁力台上含搅拌棒的烧杯加入50mL40％预先制备的 HP-β-CD溶液(如上制备)，伴随搅拌棒以中速搅拌，及缓慢加入50ml 预先制备的M4N/PEG 300溶液(如上制备)，例如以约10mL每分钟的速 度，制备含50％PEG 300(v/v)，20％HP-β-CD(w/v)和12.5mg M4N的 100mL配方储备溶液。通过使用吸液管，将M4N/PEG 300加入至烧杯的 中央，从而避免其粘在烧杯的壁上并确保充分溶解。将M4N/PEG 300加 入至HP-β-CD溶液开始表现为白色溶液，但在不断搅拌下最终变为澄清。 这个制法可被按比例放大或缩小，以适于产生所需体积或浓度的 M4N/PEG 300和HP-β-CD。用0.22μm的PVDF膜对所述储备溶液进行过 滤除菌，诸如获得自Millipore(目录号SCGV T05 RE)(比尔里卡，美国 马萨诸塞州)的预除菌的真空驱动一次性瓶顶过滤膜。该过滤过程由真 空力驱动，且滤液收集在预灭菌的250mL玻璃瓶中。随后，该瓶被紧密 地密封，在室温并避光保存。HP-β-CD中的M4N/PEG 400或M4N/PEG 400 单月桂酸酯的储备溶液可通过在上述方法中用PEG 400或PEG 400单月 桂酸酯替代PEG 300进行类似的制备。
用前述方法制备的M4N/PEG 300/HP-β-CD、M4N/PEG 400/HP-β-CD 或M4N/PEG 400单月桂酸酯/HP-β-CD的储备溶液可在体外使用或用于向 动物给药之前进行稀释。如果稀释是必须的，所述储备溶液优选地以WFI 而非例如盐水进行稀释，以降低渗透压。为了制备储备溶液在WFI中1∶1 稀释的100mL溶液，将约50mL的储备溶液加至玻璃瓶中。将约50mL 的WFI加入至瓶中的50mL储备溶液中以形成稀释的溶液。将所述玻璃 瓶密封，且通过摇晃和倒转该玻璃瓶若干次使稀释后的溶液充分混合。 用0.22μm的PVDF膜对该稀释溶液进行过滤除菌，诸如获得自Millipore (目录号SCGV T05 RE)(比尔里卡，美国马萨诸塞州)的预除菌的真空 驱动一次性瓶顶过滤膜。该过滤过程由真空力驱动，且滤液收集在预灭 菌的250mL玻璃瓶中。随后，该瓶被紧密地密封，在室温并避光保存。 这个方法可被按比例放大或缩小以获得所需的体积或稀释度，诸如1∶2 或1∶4的稀释度。
含50％PEG 300和20％HP-β-CD的适于用作安慰剂对照的配方可如 下制备。为了制备100mL安慰剂或对照配方，将约50mL 40％HP-β-CD 加入至位于磁力台上含搅拌棒的烧杯中。设定该磁力台以中速搅拌 HP-β-CD溶液。通过移液至烧杯的中央，避免PEG 300粘在烧杯的壁上， 将50mL PEG 300缓慢加入至玻璃烧杯中的50mL HP-β-CD中。该混合物 被搅拌约1hr或直至混合完全。用真空力驱动的0.22μm的PVDF膜对安 慰剂配方进行过滤除菌。滤液收集在预灭菌的250mL玻璃瓶中。该瓶被 紧密地密封，在室温并避光保存。这个方法可根据需要被按比例放大或 缩小以产生所需的浓度和体积量。此外，根据需要，PEG 300可被替代 为PEG 400或PEG 400单月桂酸酯。
根据前述或类似方法制得的含HP-β-CD和/或PEG 300、PEG 400的 配方，及含HP-β-CD和丙二醇(“PG”)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、 羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或Tween80的配方中 M4N的溶解度结果，以及所得配方的性质在表1-5中示出，其中N表示 “否”及Y表示“是”。
表1改性环糊精作为增溶剂和/或赋性剂
赋性剂 赋性剂浓度 (除另有说 明以w/v计) 药物浓度 (除另有 说明以 mg/mL计) 旋转 后的 溶解 在X℃ 加热后 的溶解 冷却 后的 溶解 室温 下的 稳定 性 α-CD 15％ 1 N 90°时N 10 N 90°时N 50 N 90°时N 100 N 90°时N β-CD 1.50％ 1 N 90°时N 10 N 90°时N γ-CD 5％ 1 N 90°时N HP-β-CD 50％ 1 N 90°时Y Y ＞7天 10 N 90°时Y Y ＞7天 20 N 90°时N 50 N 90°时N 100 N 90°时N
40％ 1 N 80°时Y Y ＞7天 10 N 80°时Y Y ＞7天 12 N 80°时N 14 N 80°时N 16 N 80°时N 20 N 80°时N 50 N 80°时N 100 N 80°时N 30％ 1 N 90°时Y Y ＞7天 10 N 90°时Y Y ＜3天 20 N 90°时N 50 N 90°时N 100 N 90°时N 20％ 1 N 90°时Y Y ＞7天 10 N 90°时N 81.5％(w/w) ，冻干 185mg/g 粉末 HP-β-CD 在盐水中 50％ 10 N 90°时Y Y ＞7天 在盐水中 20％ 1 N 10 N 50 N HP-β-CD 和丙二醇 (PG) 40％HP-β-C D，2.5％PG (v/v) 1 N 80°时N 10 N 80°时N
HP-β-CD 和PVP 50％HP-β-C D， 1.25％PVP (w/v) 1 N 90°时Y Y ＜3天 10 N N 50 N N 40％HP-β-C D， 1％PVP (w/v) 1 N N 10 N N HP-β-CD 和PEG 300 27％ HP-β-CD，33 ％PEG 300 (v/v) 13.3 N 60°时Y Y ＞7天 23％ HP-β-CD，43 ％PEG 300 (v/v) 12.9 N 60°时Y Y ＞7天 20％ HP-β-CD，50 ％PEG 300 (v/v) 12.5 N 60°时Y Y ＞7天 15％ HP-β-CD，50 ％PEG 300 (v/v) 12.5 N 60°时Y Y ＜7天 12.5％ 12.5 N 60°时Y Y ＜1天
HP-β-CD， 50％PEG 300(v/v) 13％ HP-β-CD，67 ％PEG 300 (v/v) 16.7 N 60°时Y N 10％ HP-β-CD，77 ％PEG 300 (v/v) 19.3 N 60°时Y N 10％ HP-β-CD，25 ％PEG 300 (v/v) 6.25 N 60°时Y Y ＞7天 6.7％ HP-β-CD， 16.7％PEG3 00(v/v) 4.17 N 60°时Y Y ＞7天 5％ HP-β-CD， 12.5％PEG3 00(v/v) 3.13 N 60°时Y Y ＜7天 HP-β-CD 和PEG 400 32％ HP-β-CD， 20％PEG400 (v/v) 10 N 60°时Y Y ＞7天 30％ 12.5 N 60°时Y Y ＞7天
HP-β-CD， 25％PEG400 (v/v) 27％ HP-β-CD， 33％PEG400 (v/v) 13.3 N 60°时Y Y ＞7天 23％ HP-β-CD， 43％PEG400 (v/v) 12.9 N 60°时Y Y ＞7天 20％ HP-β-CD， 50％PEG400 (v/v) 12.5 N 60°时Y Y ＜7天 15％ HP-β-CD， 50％PEG400 (v/v) 12.5 N 60°时Y Y ＜3天 12.5％ HP-β-CD， 50％PEG400 (v/v) 12.5 N 60°时Y Y ＜1天 40％ HP-β-CD， 5％PEG400( v/v) 10 N 60°时Y N HP-β-CD 27％HP-β-C 13.3 N 60°时Y N
和 Tween80 D， 33％Tween 80(v/v)
所有配方经受在4℃放置24hr及以5000rpm离心5min，未形成可见 沉淀。含50％PEG 300、20％HP-β-CD、12.5mg/mLM4N储备溶液的配方 在4℃能保持至少4个月。以1∶1或1∶2稀释度对相同的储备液制得的稀 释剂也可在4℃保持至少4个月。
表2M4N的PEG 300和HP-β-CD配方
未稀释的储备溶液 对于每10mg M4N 对于每50mg M4N 对于每 100mg M4N PEG 300(v/v) HP-β-CD (w/v) M4N (mg/mL) PEG 300 以 mL 计 (mg) HP-β -CD (mg) PEG 300以 mL计 (mg) HP-β -CD (mg) PEG 300以 mL计 (mg) HP-β -CD (mg) 50％ 15％ 12.5 0.4 (450) 120 2.0 (2250) 600 4.0 (4500) 1200 50％ 20％ 12.5 0.4 (450) 160 2.0 (2250) 800 4.0 (4500) 1600 43％ 23％ 12.9 0.33 (375) 178 1.67 (1875) 890 3.33 (3746) 1780 33％ 27％ 13.3 0.25 (281) 200 1.25 (1406) 1000 2.5 (2813) 2000
表3M4N的PEG 400和HP-β-CD配方
未稀释的储备溶液 对于每10mg 对于每50mg 对于每
M4N M4N 100mg M4N PEG 400(v/v) HP-β-CD (w/v) M4N (mg/mL) PEG 400以 mL计 (mg) HP-β -CD (mg) PEG 400以 mL (mg) HP-β -CD (mg) PEG 400以 mL计 (mg) HP-β -CD (mg) 50％ 20％ 12.5 0.4 (450) 160 2.0 (2250) 800 4.0 (4500) 1600 43％ 23％ 12.9 0.33mL (375) 178 1.67 (1875) 890 3.33 (3746) 1780 33％ 27％ 13.3 0.25 (281) 200 1.25 (1406) 1000 2.5 (2813) 2000 25％ 30％ 12.5 0.20 (225) 240 1.0 (1125) 1200 2.0 (2250) 2400 20％ 32％ 10.0 0.20 (225) 320 1.0 (1125) 1600 2.0 (2250) 3200
表4M4N配方在PEG300中的稳定性
配方 PEG 300 (v/v) HP-β-CD (w/v) M4N (mg/mL) 室温下的稳 定性 A 50％ 15％ 12.5 ＞3天 B 50％ 20％ 12.5 ＞5个月 C 43％ 23％ 12.9 ＞5个月 D 33％ 27％ 13.3 ＞5个月
表5M4N配方在PEG400中的稳定性
配方 PEG 400 (v/v) HP-β-CD (w/v) M4N (mg/mL) 室温下的稳 定性 E 50％ 20％ 12.5 ＞6天 F 43％ 23％ 12.9 ＞5个月
G 33％ 27％ 13.3 ＞5个月 H 25％ 30％ 12.5 ＞5个月 I 20％ 32％ 10.0 ＞5个月
类似地，M4N可溶解在其他增溶剂中，诸如水溶性的有机溶剂，包 括乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙二醇或甘油。
实施例2.M4N的DMSO或PEG 300/HP-β-CD结合配方对培养中肿瘤细 胞的增殖和死亡的影响
M4N在10％(w/v)HP-β-CD和25％(v/v)PEG 300中(以下称为“CPE” 配方)，M4N在30％(w/v)HP-β-CD和25％(v/v)PEG 300中(以下称为“CPE 25/30”配方)，以及M4N在27％(w/v)HP-β-CD和33％(v/v)PEG 300中 (以下称为“CPE 33/27”配方)，被用来测试对两种不同肿瘤细胞系的细胞 死亡和增殖的影响：Hela，其为HPV-18阳性人宫颈癌细胞系，及C-33A， 其为HPV-阴性人宫颈癌细胞系，M4N在DMSO中也被平行地测试。两 种肿瘤细胞系以递增的M4N量进行处理：0μM，20μM，40μM，60μM和 80μM，以DMSO或CPE配方处理72hr。加入各配方达生长培养基(含 L-谷氨酰胺的最低必需培养基，添加了10％胎牛血清，1mM丙酮酸钠， 1x非必须氨基酸溶液和1000IU/mL青霉素/1000μg/mL链霉素溶液)总 量的1％。对照细胞在相同条件下培养，但不进行处理。在72hr的处理 或非处理之后，通过使用台盼蓝排除法计数各样品中细胞总数和活细胞 数量。分析在各样品中的细胞增殖率和死亡细胞的百分率。该实验的结 果在图1、图2和表6至12中示出。
图1为经处理的细胞数量/未处理的细胞数量的比率相对于用于处理 C-33A细胞和Hela细胞的DMSO配方或CPE配方中不断增加的M4N浓 度作图的表示图。图2为死亡细胞的百分比相对于用于处理在培养基中 的两种癌细胞系，C-33A细胞和Hela细胞的DMSO配方或CPE配方中 不断增加的M4N浓度作图的表示图。
结果显示，相比于未处理的对照，在不含M4N时，以死亡细胞的％ 测量，单DMSO对于两种被测试的肿瘤细胞系具有显著的抗增殖效果及 一些毒性作用。相反，当相比于未处理的对照，单CPE配方对于两种肿 瘤细胞系具有抗增殖效果且几乎没有毒性。
当与相同配方中非-M4N处理的对照(即，0μg/mL或0μM M4N)进 行比较时，在以M4N的DMSO配方或CPE配方处理之后，在两种细胞 系中细胞增殖率下降。事实上，在CPE配方中，该抗增殖效果表现为 M4N剂量依赖型。在CPE配方中，例如，约20μM或7.2μg/mL的M4N 被发现足以对两种肿瘤细胞型的细胞增殖造成约50％抑制。在CPE配方 中，M4N浓度的进一步增加将对两种细胞型在抗增殖效果上产生进一步 的增加。
通常，在DMSO配方或CPE配方中的M4N剂量越高，诱导的两种 C-33A细胞和HeLa细胞的细胞死亡百分比越高。然而，M4N的DMSO 配方比相应浓度的M4N的CPE配方，对细胞的毒性更大。然而，DMSO 配方中测试的M4N最大浓度(80μM或28.7μg/mL)在约40％的细胞群 中引起细胞死亡，在这个实验中，相同浓度的M4N的CPE配方在仅约 20％的细胞群中引起细胞死亡。
这些结果在两种细胞系中都是可重复的。从这个研究中获得的数据 说明，与DMSO配方中的M4N类似，CPE配方中的M4N能阻止细胞增 殖，然而比DMSO配方引发更低的细胞毒性。
收集连续时间点的数据，以测试CPE配方随时间的效力。这些数据 显示，在贮存在2-8℃十二个月后，CPE配方仍像新的那样有效。细胞的 存活率在CPE配方贮存的十二个月中保持相似。细胞死亡和增殖率保持 在相同的范围内。
收集数据，比较原CPE配方和新CPE 25/30配方。研究在第0和3 月进行，以测试配方随时间的效力，以及测试新配方相比于旧配方的效 果。数据显示CPE 25/30配方在抑制肿瘤细胞的生长上与原CPE配方一 样有效。在使用CPE配方或CPE 25/30配方，以各种药物浓度处理HeLa 细胞中，细胞的存活率相似。细胞死亡和增殖甚至随时间保持在相同的 范围内。
收集信息，以比较原CPE配方和CPE 33/27配方在第0时间对HeLa 细胞的作用。数据显示，CPE 33/27在HeLa细胞的细胞存活率、死亡细 胞的百分比和增殖率上具有相同的效果。
表6 M4N的DMSO或CPE配方对C-33A细胞的影响
处理 ％存活率 ％死亡细胞 增殖率 无 95.4 4.6 1.00 0μM DMSO 82.0 18.0 0.47 20μM DMSO 82.6 17.4 0.20 40μM DMSO 67.0 33.0 0.15 60μM DMSO 60.4 36.6 0.14 80μM DMSO 56.7 43.3 0.11 0μM CPE 92.8 7.2 0.79 20μM CPE 93.0 7.0 0.43 40μM CPE 89.1 10.9 0.43 60μM CPE 89.4 10.6 0.22 80μM CPE 77.5 22.5 0.15
表7 M4N的DMSO或CPE配方在第0时间时对HeLa细胞的影响
处理 ％存活率 ％死亡细胞 增殖率 无 97.7 2.3 1.00 0μM DMSO 93.7 6.3 0.43 20μM DMSO 90.1 9.9 0.25 40μM DMSO 86.8 13.2 0.25 60μM DMSO 63.9 36.1 0.13 80μM DMSO 61.4 38.6 0.02 0μM CPE 96.3 3.7 1.03 20μM CPE 95.6 4.4 0.52 40μM CPE 90.6 9.4 0.28
60μM CPE 80.4 19.6 0.13 80μM CPE 78.5 21.5 0.13
表8 M4N的DMSO或CPE配方在第9月时对HeLa细胞的影响
处理 ％存活率 ％死亡细胞 增殖率 无 95.7 4.2 1.00 0μM DMSO 94.9 5.1 0.76 20μM DMSO 89.3 10.7 0.19 40μM DMSO 91.2 8.8 0.14 60μM DMSO 67.5 32.5 0.03 80μM DMSO 50.0 50.0 0.02 0μM CPE 95.6 4.4 0.72 20μM CPE 68.7 31.3 0.24 40μM CPE 72.8 27.2 0.10 60μM CPE 86.4 13.6 0.09 80μM CPE 88.1 11.9 0.08
表9 M4N的DMSO或CPE配方在第12月时对HeLa细胞的影响
处理 ％存活率 ％死亡细胞 增殖率 无 92.1 7.9 1.00 0μM DMSO 90.5 9.5 0.77 20μM DMSO 87.4 12.6 0.23 40μM DMSO 86.4 13.7 0.04 60μM DMSO 64.6 35.4 0.04 80μM DMSO 76.5 23.6 0.15 0μM CPE 95.6 4.4 1.50 20μM CPE 96.8 3.3 0.74 40μM CPE 95.0 5.0 0.21 60μM CPE 75.0 25.0 0.05
80μM CPE 52.8 47.2 0.03
表10 CPE配方和CPE 25/30配方在HeLa细胞中的比较
处理 ％存活率 ％死亡细胞 增殖率 无 93.5 6.6 1.00 0μM CPE 92.3 7.8 0.92 20μM CPE 93.5 6.6 0.33 40μM CPE 76.7 23.4 0.08 60μM CPE 44.5 55.6 0.03 80μM CPE 43.4 56.7 0.04 0μM CPE 25/30 90.7 9.3 0.81 20μM CPE 25/30 90.7 9.4 0.34 40μM CPE 25/30 89.1 11.0 0.31 60μM CPE 25/30 77.3 22.8 0.12 80μM CPE 25/30 54.8 45.2 0.07
表11 CPE配方和CPE 25/30配方第3月时在HeLa细胞中的比较
处理 ％存活率 ％死亡细胞 增殖率 无 95.8 4.2 1.00 0μM CPE 95.0 5.0 0.91 20μM CPE 91.0 9.0 0.39 40μM CPE 83.5 16.5 0.09 60μM CPE 56.9 43.1 0.03 80μM CPE 71.0 29.0 0.03 0μM CPE 25/30 93.4 6.6 0.87 20μM CPE 25/30 88.1 11.9 0.39 40μM CPE 25/30 86.6 13.4 0.32 60μM CPE 25/30 76.9 23.1 0.11 80μM CPE 25/30 64.4 35.6 0.04
表12 CPE配方和CPE 33/27配方第0时间时在HeLa细胞中的比较
处理 ％存活率 ％死亡细胞 增殖率 无 95.0 5.0 1.00 0μM CPE 96.4 3.6 1.11 20μM CPE 88.1 11.9 0.35 40μM CPE 74.2 25.9 0.14 60μM CPE 73.9 26.2 0.10 80μM CPE 78.4 21.6 0.11 0μM CPE 33/27 95.4 4.7 0.92 20μM CPE 33/27 89.2 10.9 0.43 40μM CPE 33/27 86.4 13.6 0.19 60μM CPE 33/27 70.7 29.3 0.10 80μM CPE 33/27 75.0 25.0 0.09
实施例3.可使用多种批次的M4N，并达到相同效果
对多种批次的M4N进行测试，以显示不同批次药物的效果。用 CPE配方，以递增的M4N量：0μM、20μM、40μM、60μM和80μM对 HeLa细胞进行处理72hr。加入各配方达培养基(含L-谷氨酰胺的最低必 需培养基，添加了10％胎牛血清，1mM丙酮酸钠，1x非必须氨基酸溶液 和1000IU/mL青霉素/1000μg/mL链霉素溶液)总量的1％。对照细胞在 相同条件下培养，但不进行处理。在72hr的处理或非处理之后，通过使 用台盼蓝排除法计数各样品中细胞总数和活细胞数量。分析在各样品中 的细胞增殖率和死亡细胞的百分率。该实验的结果在表13和14中示出。 这些结果显示，无论使用何种M4N批次，药物的效果保持一致。
表13 用各种批次的M4N处理HeLa细胞(EM1001批)
处理 ％存活率 ％死亡细胞 增殖率 无 96.2 3.7 1.00
0μM CPE 96.2 3.8 0.92 20μM CPE 94.9 5.1 0.25 40μM CPE 73.7 26.3 0.10 60μM CPE 44.4 55.6 0.01 80μM CPE 59.8 40.2 0.01
表14 用各种批次的M4N处理HeLa细胞(EM1002批)
处理 ％存活率 ％死亡细胞 增殖率 无 95.9 4.1 1.00 0μM CPE 96.1 3.8 0.65 20μM CPE 88.0 12.0 0.32 40μM CPE 74.2 25.8 0.11 60μM CPE 41.9 58.1 0.05 80μM CPE 40.3 59.7 0.03
实施例4.静脉内注射毒性试验
这个试验的目的是测定当通过静脉注射向雄性和雌性小猎兔犬给药 时，四-O-甲基NDGA(M4N)的最大耐受剂量，其中小猎兔犬由Convince Research Products(坎伯兰，美国弗吉尼亚州)提供。两条在第一次给药 时约6至9个月大的小猎兔犬，一雄一雌，在试验天(“SD”)1给药含 20％(w/v)HP-β-CD和50％PEG 300的环糊精赋性剂，随后以制备于环 糊精赋性剂中的逐渐增大量的M4N(即，试验药物)给药。预制成的环 糊精赋性剂和试验药物在室温保存。用作稀释剂的无菌水从Baxter Health Care公司(迪尔菲尔德，美国密歇根州)或Abbott Laboratories(北芝加 哥，美国伊利诺斯州)获得并在室温保存。
该试验药物、环糊精赋性剂和稀释剂被认为是配方用100％纯品。通 过用无菌注射器将适量的试验药物或环糊精赋性剂加入至玻璃容器中， 在每一给药天制备剂量配方。对各剂量而言，将等量的无菌水加入至M4N 配方或环糊精赋性剂中，以形成50∶50(v/v)的稀释。200mg/kg剂量不 需稀释。通过轻柔的倒置混合所有配方，以确保形成适当的溶液。将配 方装入医药盒中，并在室温下贮存直至需要使用。
在SD3，M4N以25mg/kg进行给药，在SD5，M4N以50mg/kg进行 给药，以及在SD8，M4N以100mg/kg进行给药。仅雌性动物接受全 100mg/kg剂量；由于在输注管中沉淀引起的机械事故，雄性狗接受约 72mg/kg(即，72％)的原本剂量。另外两条小猎兔犬以200mg/kg的剂 量进行给药；然而，机械事故相继发生，且雄狗接受约180mg/kg(90％) 的原本剂量，而雌狗接受的量不能测定。
在SD13，由于泵的机械故障，不能完成剂量给药，该机械故障可能 与12.5mg/mL的配方的粘度有关。将未使用的配方转移入棕色试剂瓶中 并在室温保存，直到在SD15通过用无菌水50∶50(v/v)稀释重新配成配 方。然后，将6.25mg/mL稀释液转入医药盒中。
在第一剂量之前，使试验的动物适应实验室条件至少7天，并由兽 医工作人员解除检疫。在该期间，各动物由耳标进行识别，并在各笼标 上记录下临时编号。以常规的方式，并根据USDA(美国农业部)动物 福利法案(Animal Welfare Act)，关于人道照顾和实验室动物使用的PHS 政策(the PHS Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals)，及 美国部门间研究动物委员会关于使用和照顾研究动物的原则(U.S. Interagency Research Animal Committee Principles for the Utilization and Care of Research Animals)，对动物进行照料。
除特殊说明，食料和水无限制地供应。在饮食和水中不存在可影响 取得本试验目的的污染物水平。向动物提供良好的与人类的相互交流， 诸如在给药期间和当进行身体检查时，进行抚摸、擦拭，及说话。由于 静脉血管导管插入术，外科操作后试验狗不能出笼活动。在笼内提供了 Rubber Kong玩具或尼龙玩具。
使用无菌外科技术，将留置导管插入动物的颈静脉中，并在外科手 术当天对动物结合止痛剂和抗生素进行预防处理，及在外科手术之后用 抗生素和/或镇痛药处理动物8天。研究结果总结列在表15、16和17中。
表15在毒性研究的PEG 300/HP-β-CD配方中 向小猎兔犬给药的M4N剂量
剂 量 试 验 天 剂量水 平 (mg/kg) M4N浓度 (mg/mL) 输注速率 (mL/kg/hr) 输注 持续 时间 (hr) 雄狗 雌狗 1 1 0 0 4 4 全剂量 全剂量 2 3 25 6.25 4 1 全剂量 全剂量 3 5 50 6.25 4 2 全剂量 全剂量 4 8 100 6.25 4 4 71.9％剂 量 全剂量 5a 13 200 12.50 4 4 无 无 5b 15 200 6.25 4 8 90.3％剂 量 未知量
表16输注M4N的小猎兔犬的个体体重(以kg计)
组 性别 动物 号 SD1 SD3 SD6 SD8 SD9 SD13 SD15 SD17 雄性 10529 7.9 7.7 7.8 7.7 7.7 NA NA NA 雄性 10567 NA NA NA NA NA 10.2 10.0 10.0 雌性 10530 8.3 8.3 8.3 8.2 NA NA 8.1 8.2 雌性 10568 NA NA NA NA NA 6.8 6.8 6.8
SD＝试验天
表17输注不同剂量(以mg/kg计)后 个体小猎兔犬体内的M4N血清浓度(以mg/mL计)
动物 号 性 别 试 验 天 M4N 剂 量 预剂量 立即 0.5hr 后 1hr 后 2hr 后 4hr 后 8hr 后 16hr 后
10529 雄 性 3 25 ND 5.262 2.343 1.157 0.682 0.322 0.189 0.113 10529 雄 性 6 50 0.011 8.661 4.775 2.255 1.464 0.989 0.386 0.226 10529 雄 性 8 100 0.216 7.416 3.728 2.034 1.68 0.322 0.357 10567 雄 性 13 ＜LLOQ 10567 雄 性 15 200 0.020 52.96 27.79 22.33 16.90 14.82 3.246 2.501 10530 雌 性 3 25 ＜LLOQ 13.91 4.941 2.918 1.632 1.542 0.492 0.179 10530 雌 性 6 50 0.108 16.36 6.828 6.623 3.513 2.901 0.741 0.407 10530 雌 性 8 100 0.157 14.50 9.848 9.726 4.494 1.793 1.456 0.589
ND＝未检测到；＜LLOQ＝低于定量下限
剂量1、2和3顺利输送。在第SD8天，在100mg/kg剂量期间，注射 泵提前停止工作，仅原123.2mL剂量的88.6mL被输入雄狗(No.10529) 中。根据需要手动重新启动泵，但仅雌狗(No.10530)接受了全剂量。
在第SD15天，以稀释的测试物配方和8hr目标输注时间，试图将 200mg/kg剂量输入第10567号狗和第10568号狗体内。在剂量给药 7hr45min后，雄狗的泵停止。因此，雄狗(第10567号)仅接受预期320mL 剂量的289mL。在剂量给药2hr12min后，发现输注针从雌狗(第10568 号)的输注管线中脱离，剂量给药终止。静脉输入雌狗体内的M4N量不 能测定。
在完成各静脉输注之后，以缓慢推注施用1mL无菌盐水，从而将试 验材料从输注管线中冲入动物体内，随后输入肝素-盐水溶液以填充输注 管线以保持开放。对动物进行观察。笼侧观察包括死亡、病状 (morbundity)、综合健康，及中毒迹象。临床观察包括皮肤和皮毛特性、 外科操作位点、眼和粘膜、呼吸系统、循环系统、自主和中枢神经系统， 及体动力和行为方式的评价。采集血液，并将血液置于2.5mL血清分离 管中，以进行血清M4N浓度分析。将这些管倒置数次，在湿冰上贮存， 在4℃以约3000rpm离心约10min。将血清转移至微离心管中并在 -75±10℃下贮存。
在干冰中的样品被运送至Genelogic的分析化学实验室(Genelogic， 美国马里兰州)进行测试物分析。该方法涉及用乙腈处理至少0.5mL的 等份的狗血清，过滤，并将滤液注入带串联质谱检测的HPLC柱 (LC-MS/MS)中。分析物用三唑安定作为内标物的外标准曲线进行定量。
雄狗No.10529和雌狗No.10530分别在第SD9和17天从试验中排除。 在第SD17天对雄狗No.10567和雌狗No.10568进行安乐死和抽血。所有 动物通过静脉注射Nembutal进行安乐死。
在死亡后，尽可能快地对所有狗进行尸体解剖。进行了全面地尸体 解剖，包括检查身体的外表面、外科操作位点、所有开孔、头盖骨、胸 及腹腔及其内容物。由股骨髓制备骨髓涂片。将切片进行空气干燥，用 甲醇固定，并保存以用于进行进一步可能的评价。将组织保存在10％中 性缓冲的福尔马林(“NBF”)中。此外，收集与血管获取端(“VAP”)相 联的输送管道，在两端打结，贮存在NBF中。肾、肺、膀胱及任何肉眼 损害被包埋、切片、染色及由委员会认证的兽医病理学家检测。在被检 测的组织中，未发现与疾病相关的测试物质。
结果显示，以M4N进行治疗对死亡率没有影响。对体重没有明显地 治疗相关的临床观察或影响。无测试物质相关的肉眼可见的病理学发现 或显微镜可见的变化。M4N的血清浓度水平在紧接输注期后为最高，在 所有的测量时间间隔中，雌狗的M4N水平高于雄狗的。在输注期之后 16hr，M4N仍然可检测，检测量随着剂量的增加而增加。
总之，在达约200mg/kg的剂量下，未观察到治疗相关的副作用。
实施例5 补充的静脉输注毒性试验
A.在小猎兔犬中的M4N(CPE)7天静脉输注毒性研究
该研究是为了测定当作为单静脉输注剂量在小猎兔犬中连续给药7 天时，配制在30％HP-β-CD和25％PEG 300中的M4N的毒性动力学曲线。 这个试验构成了M4N的该特定的配方在狗中的第一个研究，以评估毒性 并比较稀释剂(10mg/mL对5mg/mL)的耐受性。
以54分钟(组2)或108分钟(组1、3和4)的静脉输注，向总共 12条小猎兔犬(8雄/4雌)给药M4N。所有的动物接受7个剂量，每天 一次，连续7天。
评价以下的参数：临床观察和体重。试验物分析在第试验天1和7 进行，在如下的时间点从各动物适当的血管采集血样(指标为2.0mL体 积)：
组 试验天 毒性动力学时间点 1、3和4 1 预剂量，剂量给药开始之后1，1.8(输注终点) 4，6，8和16小时 7 预剂量，剂量给药开始之后1，1.8(输注终点) 4，6，8，16，24和36小时 2 1 预剂量，剂量给药开始之后30分钟，0.9(输注 终点)，2，4，8和16小时 7 预剂量，剂量给药开始之后30分钟，0.9(输注 终点)，2，4，8，16，24和36小时
对组1和3的动物进行大致解剖，且所有注射位点为组织学而进行 处理。详细的临床观察揭示了如下发现：在组2、3和4中观察到短暂可 逆的后肢不适。大部分这些观察现象在组3和4中被观测。在组1和3 中观察到变色的尿液。由于这些发现在赋形剂组中发现，因此这可能与 赋形剂相关。在组1、2和3中观测到三例前肢区域的肿大，始于第3天、 终于第4天。该发现可能表示由于多个针头插入相同剂量给药区域(头 静脉)引起的发炎。在组3雌性动物中观察到为孤立事件的一例急促呼 吸，且此后再未观察到。最后，观测到零星的腹泻、呕吐、黏液粪便和 软粪。这些观测结果在小猎兔犬中较为普遍，被认为是由于压力产生而 非测试物相关的。
血清的分析显示，测试物浓度的最低峰(标称为18759ng/mL)在接 受45mg/kg(5mg/mL)的组4动物中发现。较高峰浓度(标称为 33420ng/mL)在接受45mg/kg(10mg/mL)的组2动物中发现。与预期 一样，最高浓度(标称为46704ng/mL)在接受90mg/mL(10mg/mL)的 组3动物中发现。所有组的最大浓度的时间在输注完成时(组2为0.9 小时，组3和4为1.8小时)。在接受赋性剂的任何组1动物样品中未观 测到测试物。一次给药的浓度曲线在图3A(非对数标度)和图3B中(对 数标度)中示出。
对组1和3的动物进行大致解剖。为进行组织学研究，收集注射位 点并处理。组织学研究显示，对照的注射位点比治疗动物的这些受到更 小的影响，当与对照进行比较时，治疗动物的注射位点更厚和变色。这 些暗示的是测试物比赋性剂具有更大的刺激性。在动物解剖中未观测到 其他目视发现。
B.在小猎兔犬中的M4N(CPE)带28天恢复期的14天重复静脉输 注毒性试验
通过带28天恢复期的14天静脉输注向雄性和雌性小猎兔犬给药 CPE(12.5mg/mL在20％HP-β-CD，50％PEG 300中)，以测定任何治疗 相关毒性的可逆性。最初，32条狗(16/性别)被随机分成4组(组1和 4中5/性别，组2和3中3/性别)，并以％22、45或90mg/kg剂量的50％PEG 300中的20％HP-β-CD(安慰剂)或测试物(CPE)进行给药。所有的动 物通过静脉输注接受总共14次每天一次的剂量。在剂量给药之后，3条 狗/性别/组在第SD16天进行安乐死，组1和4中余下的2条狗/性别保持 经历28天的恢复期。
本研究中评估的参数包括死亡率、临床观察结果、体重和体重变化、 食物消耗、眼科学、心脏病学、临床病理学、器官重量，及显微镜观察 的微观病理学。
CPE治疗对死亡率无影响；所有的动物都存活到按计划终止时。对 体重、体重变化或食物消耗无影响。未注意到治疗相关的视觉影响。在 90mg/kg的一条狗身上观测到两次可逆CNS活性(共济失调)的短暂证 据。所有其他的临床观测结果被认为是孤立发生，与治疗无关。
没有测试物相关的心脏病学影响。在预剂量和第SD13天时，用安慰 剂处理的一只雄性具有室性早搏，且在第SD1天，用45mg/kg CPE处理 的一雌体具有未传导至心室的心房搏动；这些发现都不认为是治疗相关 的。
在临床病理学参数中未出现明显的测试物相关的影响。第SD15天， 在以22.5mg/kg CPE处理的雄性动物中发现显著更低的绝对网状细胞计 数；然而该变化是最低限度的，与预剂量值类似，并不认为具有生物或 毒理学显著性。
在第SD16天，以22.5和45mg/kg CPE处理的雄性的绝对脾细胞重 量具有统计学显著性与对照组(安慰剂)中个体动物变化有关。在相关 器官重量上没有显著区别。
在第SD16天解剖时在所有动物的输注位点发现的损伤相比于静脉 输注过程被认为是次要的，并与治疗无关。在45mg/kg CPE组的一雌体 中发现输注位点变红，相关地用显微镜观察为多病灶的、轻微的、内膜 的、血管增厚，平滑肌细胞的多病灶、轻微的血管增生，及多病灶、轻 微的、亚急性的皮下血管周炎，显示了由剂量给药技术产生的炎症。在 安慰剂和90mg/kg CPE组中选择的雄性和雌性动物展示出由于安乐死的 方式导致的扩散、轻度至中度的脾脏充血。在第SD16、42和43天的解 剖中注意到了的所有其他肉眼可见的和显微镜可见的发现被认为是偶然 的和非治疗相关性的。
总之，在小猎兔犬中以达90mg/kg剂量的14天CPE静脉输注之后， 没有发现不利的治疗相关影响。
C.在小猎兔犬中IV剂量范围研究
单条雄狗通过IV输注(10mL/kg/hr)给药20％HP-β-CD/50％PEG 300 中的M4N(12.5mg/mL)。发生了输注管线内压力增加及试验配方从注射 器中泄漏。剂量给药造成唾液分泌、瞳孔散大、红尿、严重的共济失调、 战栗和痉挛。由于观察结果被认为很严重，动物被认为临近死亡，并计 划进行安乐死。在安乐死之前，狗似乎在恢复；所有先前发现的临床观 测结果在严重性上显著下降。
在单条雌狗以5mL/kg/hr的输注率进行相同剂量的尝试，造成剂量给 药之后不协调的/不平衡的运动和频繁的排尿。狗在1小时15分钟内恢复， 并表现出无连续或另外的不良临床迹象。
另外的雄和雌体以150mg/kg及随后以125mg/kg进行剂量给药。在 剂量给药期间，出现严重的共济失调、眼球震颤、红尿或粪、频繁的排 尿、发声，在这些剂量水平出现呼吸困难、呕吐，和/或分泌唾液。两动 物在剂量给药的1hr内恢复，且随后未发现另外的重要临床迹象。
在200、150和125mg/kg观察的附带的临床、笼侧、剂量给药后， 或不定期的观察结果包括鼻子和/或耳朵的轻微的红斑、排泄变化(软和/ 或带黏液的粪便)及各一例清鼻涕和红色阴道排出物。这些发现不频繁 发生，并被认为是普通的实验发现，与治疗无关。在第SD43天，接受 125mg/kg的雌体在剂量给药期间发生一例行动蹒跚，其可归因于剂量给 药吊带的使用，也被认为与治疗不相关。
另外两条狗(自然的)被加入到试验方案中，并以75mg/kg/天、输 注速率5mL/kg/hr进行剂量给药，在13天的间隔中进行总12个剂量。唯 一可注意到的剂量给药后观测结果是在第SD7天的雌性的红棕色尿液的 单次观测结果；这个现象的意义未知。临床的观测结果包括在雄体中的 软粪和在雌体中起泡白色呕吐物；这些发现为罕见或孤立事件，并不认 为与治疗相关。第SD2天，在雄体中发现了虚弱肢体的剂量给药后观测 结果，这可归因于使用了吊带束缚。两狗在剂量给药1hr内从任何所发现 的临床症状中恢复。以M4N进行治疗对体重无影响，并在解剖时未发现 肉眼能观察到的损伤。未发现其他治疗相关的观测结果。
D.在Sprague-Dawley大鼠中进行的8天IV输注毒性研究
以溶于在PEG 300中的10％HP-β-CD的M4N(6.25mg/mL)0、100、 150，或200mg/kg的逐渐升高的剂量，每四天一次由IV输注以8mL/kg/hr 向雄和雌Sprague-Dawley大鼠(3/各性别)进行给药。在最初的四次输 注之后，试验扩展至包括持续4hr、达14天的每天输注。未发生与M4N 相关的明显死亡率。在赋性剂给药期间，发现一支雄鼠死于第一天剂量， 在输注100mg/kg的测试材料后，一支雌鼠被发现死于试验的第5天。这 些死亡并不认为与试验物有关，因为一只鼠未给药测试物(仅赋性剂)， 而对于另一只鼠而言，在其他大鼠以200mg/kg/天剂量给药多天下存活的 事实下，这是单独事件。
出现的临床和解剖的观测结果相对于端口和输注管线是次要的。这 些观测结果包括颈部或腋窝的肿胀，及后肢的限制运动。在本研究的连 续每天剂量给药期间，在一雄和一雌大鼠上出现了战栗。此外，在一雄 和一雌大鼠上出现了上睑下垂和多动症状。这些是仅有的与200mg/kg/ 天测试物剂量相关的临床观测结果。
雄性和雌性大鼠在整个试验期间体重都增加。最高的体重增量出现 在以赋性剂给药后。以赋性剂或测试物给药后，食物的消耗量是相似的。
基于在这个试验中进行评价的大鼠的有限数量，以高达200mg/kg/ 天剂量的赋性剂或测试物给药达连续8天，显示大鼠可耐受的，每天剂 量给药后仅造成一些不利的临床观测结果。出现的大部分不利的临床观 测结果和所有的解剖发现被认为与用于向大鼠剂量给药的端口和管线相 关。在处死时，所有的输注管线或从颈静脉中移出和/或在端口/管线定位 处未发现专利物和物质(假定为测试物)。
实施例6.M4N在改性纤维素中的溶解度
用作增溶剂和/或赋性剂的10m1 50％HP-β-CD(w/v)和0.5％羟丙基 甲基纤维素(“HPMC”)(w/v)溶液如下进行制备：将5.9mL适于向动物 注射用水(“WFI”)置于含搅拌棒的玻璃烧杯中。将该烧杯置于磁力平台， 设置搅拌棒以中速搅拌。将5g HP-β-CD缓慢地加入至不断搅拌的WFI 中，使用刮勺将HP-β-CD导向烧杯的中央。该HP-β-CD溶液被搅拌约 24小时，或者直到肉眼观察下HP-β-CD完全溶解。所得溶液测量为约 9.4mL。将约0.6mL的WFI加入至所得溶液中使之达10mL，以生成 50％HP-β-CD(w/v)溶液。将50mg HPMC加入至50％HP-β-CD溶液中， 搅拌1hr或直到肉眼观察下HPMC溶解。将最终的溶液搅拌约1hr，随后 在室温避光保存。制备改性环糊精和改性纤维素的方法可按比例放大或 缩小以获得所需的体积或浓度的HP-β-CD/HPMC溶液。其他改性环糊精 /改性纤维素溶液可类似制得，例如在上述方法中，将HP-β-CD替换为其 他改性的环糊精，或将HPMC替换为其他改性的纤维素。
以约10mg/mL浓度在50％HP-β-CD/0.5％HPMC中的10mL M4N溶液 如下制备：将约10mL的50％HP-β-CD/0.5％HPMC溶液加入至含搅拌棒 玻璃烧杯中。将该烧杯置于磁力平台，设置搅拌棒以中速搅拌。将约 100mg M4N缓慢地加入至50％HP-β-CD/0.5％HPMC中，在刮勺的帮助下 加入至烧杯的中央。该M4N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC混合物被搅拌约24 小时，或者直到所有的M4N均匀悬浮而不存在任何聚集。该 M4N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC混合物可在90℃加热30min。(或者如果 需要更大的溶液体积，更长时间，例如，500mL该M4N/ 50％HP-β-CD/0.5％HPMC混合物在90℃加热1hr)，或需要确保M4N充 分溶解的更长时间。通过将烧杯对着白色背景、之后对着黑色背景观察 颗粒的存在与否，可观察所述M4N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC混合物是否 存在任何未溶解的M4N。最终的M4N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC溶液在室 温储存，并避光保存。当在90℃加热时，M4N可以1mg/mL和10mg/mL 溶解在这50％HP-β-CD/0.5％HPMC配方中，并在冷却后仍保持在溶液中， 室温下的稳定性大于7天。即使在90℃下，M4N不以50mg/mL的浓度溶 于此相同配方中。
前述的方法可按比例放大或缩小以获得所需体积或浓度的M4N。在 其他环糊精/纤维素溶液中含M4N的配方可类似制得，例如，通过在上述 方法中将HP-β-CD替代为其他环糊精，或者将HPMC替代为其他改性纤 维素。
用作增溶剂和/或赋性剂的10ml 5％(w/v)乙基纤维素(“EC”)乙 醇溶液如下进行制备：将10mL 100％乙醇(“EtOH”)置于含搅拌棒的玻 璃烧杯中，盖上圆形Teflon盖子。将该烧杯置于磁力平台，设置搅拌棒 以中速搅拌。将五百(500)mg EC缓慢地加入至不断搅拌的乙醇中，使 用刮勺将EC导向烧杯的中央，以避免EC粉末粘附在烧杯壁上。该EC 溶液被搅拌约2小时，或者直到肉眼观察下EC完全溶解。将最终的溶液 在室温避光保存。
制备改性纤维素溶液的方法可按比例放大或缩小以获得所需的体积 或浓度。其他改性纤维素溶液可类似制得，例如在上述方法中，将EC替 换为其他改性的纤维素。
以约20mg/mL浓度在5％EC(w/v)(“EC”配方)中的10mL M4N 溶液如下制备：将如上制备的约10mL的5％EC配方加入至含搅拌棒玻 璃烧杯中。将该烧杯置于磁力平台，设置搅拌棒以中速搅拌，并盖上圆 形Teflon盖子。将约200mg M4N缓慢地加入至5％EC配方中，在刮勺 的帮助下加入至烧杯的中央，以避免M4N粘附在烧杯壁上。该M4N/EC 混合物被搅拌约2小时，或者直到所有的M4N溶解或均匀悬浮而不存在 任何聚集。该M4N/EC混合物可在60℃加热30min。(或者如果需要更大 的溶液体积，更长时间，例如，500mL该M4N/EC混合物在60℃加热1hr)， 或需要确保M4N充分溶解的更长时间。通过将烧杯对着白色背景、之后 对着黑色背景寻找颗粒，可观察所述M4N/EC混合物或溶液是否存在任 何未溶解的M4N。最终的M4N/EC溶液在室温避光保存。
前述的方法可按比例放大或缩小以获得所需体积或浓度的M4N，且 可增大或降低加热温度以使得M4N溶解。在其他改性纤维素中含M4N的 配方可类似制得，例如，HPMC，MC(甲基纤维素)，和CMC(羧甲基 纤维素)。M4N在改性纤维素中的溶解度结果在表18中列出。
结果显示，M4N可以以1mg/mL溶解于EC配方中而不用加热，该 溶液在室温下稳定性大于3天。M4N可以10mg/mL浓度在40℃下溶解， 并在冷却后仍保持在溶液中，该溶液在室温下的稳定性大于3天。M4N 可以20mg/mL浓度在60℃下溶解于EC配方中，并在冷却后仍保持在溶 液中，该溶液在室温下的稳定性大于3天。M4N可以30mg/mL浓度在 60℃下溶解于EC配方中，但冷却后不能保持在溶液中。更高浓度的M4N， 诸如50mg/mL或100mg/mL水平，在90℃可溶解在EC配方中，但在冷 却后不能保持在溶液中。
表18 M4N在含改性纤维的配方中的溶解性
赋性剂 赋性剂浓度 (w/v，除另有说 明) 药物浓度 (mg/mL， 除另有说 明) 搅拌 后的 溶解 加热后 的溶解 冷却 后的 溶解 室温下 的稳定 时间 HPMC 2.3％ 1 N 90℃下N 10 N 90℃下N 50 N 90℃下N 100 N 90℃下N HP-β-CD 和 HPMC 50％HP-β-CD， 0.5％HPMC 1 N 90℃下Y Y ＞7天 10 N 90℃下Y Y ＞7天 50 N 90℃下N 84％HP-β-CD， 1％HPMC，冻干 150mg/g 粉末 EC 乙醇中5％(w/v) 1 Y ＞3天 10 N 40℃下Y Y ＞3天 20 N 60℃下Y Y ＞3天 30 N 60℃下Y N 50 N 90℃下Y N
100 N 90℃下Y N MC 2％(w/v) 1 N 90℃下Y (低粘度) 10 N 90℃下N CMC 1％(w/v) 1 N 90℃下Y (高粘度) 10 N 90℃下N CMC 4％ 1 N 90℃下Y (低粘度) 10 N 90℃下N
实施例7 M4N在水溶性脂质或水溶性有机溶剂中的溶解性
以约50mg/mL浓度在芝麻油中的10mL M4N溶液如下制备：将约 10mL芝麻油加入至含搅拌棒的玻璃烧杯中。将该烧杯置于磁力平台，设 置搅拌棒以中速搅拌。将约500mg M4N缓慢地加入至芝麻油中，在刮勺 的帮助下加入至烧杯的中央，以避免M4N粘附在烧杯壁上。该M4N/芝 麻油混合物被搅拌约24小时，或者直到所有的M4N溶解或均匀悬浮而 不存在任何结块。该M4N/芝麻油混合物可在60℃加热30min。(或者如 果需要更大的溶液体积，更长时间，例如，500mL该M4N/芝麻油混合 物在60℃加热1hr)，或需要确保M4N充分溶解的更长时间。通过将烧杯 对着白色背景、之后对着黑色背景寻找颗粒，可观察所述M4N/芝麻油 混合物或溶液是否存在任何未溶解的M4N。如果形成结晶，该M4N/芝麻 油溶液可置于加热磁力平台上伴随搅拌重新在60℃加热约1hr，直到所有 M4N溶回溶液中。最终的M4N/芝麻油溶液在室温避光保存。
前述的方法可按比例放大或缩小以获得所需体积或浓度的M4N，且 可升高或降低加热温度以使M4N溶解。在其他水溶性脂质中含M4N的配 方可类似制得，例如，通过在上述方法中将芝麻油替代为玉米油，橄榄 油、大豆油、薄荷油，或其他增溶剂，及其结合。结果在表19中示出。
表19显示，例如，在60℃，M4N可以1mg/mL至达100mg/mL的浓 度范围，除去100mg/mL水平，溶解在玉米油中，冷却后仍保持在溶液 中，在1和10mg/mL浓度下该溶液稳定性大于3天，在20、40和50mg/mL 水平下该溶液稳定性小于3天，在60mg/mL水平下该溶液稳定性小于1 天。此外，在60℃，M4N以30mg/mL水平可溶解在橄榄油中，但冷却后 不能保持在溶液中。
在芝麻油中，M4N以10mg/mL水平在室温，以20mg/mL、30mg/mL 和50mg/mL的浓度在60℃可溶解，冷却后仍保持在溶液中。10mg/mL和 20mg/mL在室温下的稳定性大于3天、30mg/mL溶液在室温下的稳定性 小于3天，以及50mg/mL溶液在室温下的稳定性小于1天。
以约60mg/mL浓度在85％芝麻油和15％Tween20中的10mL M4N 溶液如下制备：将约8.5mL芝麻油入至含搅拌棒玻璃烧杯中。将该烧杯 置于磁力平台，设置搅拌棒以中速搅拌。将约1.5mL的Tween20缓慢 加入至烧杯的中央。将约600mg M4N缓慢地加入至芝麻油/Tween20的 混合物中，在刮勺的帮助下加入至烧杯的中央，以避免M4N粘附在烧杯 壁上。该M4N/芝麻油/Tween20混合物被搅拌约2小时，或者直到所 有的M4N溶解或均匀悬浮而不存在任何聚集。该M4N/芝麻油/Tween20 混合物可在60℃加热30min。(或者如果需要更大的溶液体积，更长时间， 例如，500mL该M4N/芝麻油/Tween20混合物在60℃加热1hr)，或需 要确保M4N充分溶解的更长时间。通过将烧杯对着白色背景、之后对着 黑色背景，可观察所述M4N/芝麻油/Tween20混合物是否存在任何未 溶解的M4N。最终的M4N/芝麻油/Tween20溶液在室温避光保存。如果 形成结晶，该M4N/芝麻油/Tween20溶液可置于加热磁力平台上伴随搅 拌在60℃重新加热，直到所有M4N溶回溶液中。
此方法可按比例放大或缩小以获得所需体积或浓度的M4N，且可升 高或降低加热温度以使M4N溶解。在其他水不溶性脂质结合非离子表面 活性剂、离子型表面活性剂或水溶性有机溶剂中含M4N的配方可类似制 得，例如，通过在上述方法中将芝麻油或Tween20替代为玉米油，橄 榄油、大豆油、薄荷油、Tween80、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯 (“TPGS”)、卵磷脂、PEG 300、PEG 400、PEG 400单月桂酸酯、甘油、 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙二醇(“PG”)或其他增溶剂，及其结合。 M4N在水不溶性脂质中的溶解性结果在表19中示出。
表19显示，例如，60mg/mL的M4N在55℃可溶解于含85％芝麻油 和15％Tween20的配方中，以及40mg/mL的M4N在45℃可溶解于相同 配方中，但冷却后在这些配方中M4N不能保持在溶液中。相反，29mg/mL 的M4N在60℃可溶解于含89％芝麻油和11％Tween20的稍微不同的配 方中，且冷却后仍能保持在溶液中，此溶液在室温下稳定性大于7天。
以约2.9mg/mL浓度在盐水中的1mL M4N乳状液如下制备：将约 0.9mL0.9％盐水溶液置于1.5mL大小的聚丙烯管中。将约0.1mL以 29mg/mL浓度存在于89％芝麻油、11％Tween20中的M4N溶液加入至 该聚丙烯管中。该M4N/芝麻油/Tween20溶液或混合物的盐水溶液被剧 烈振荡1min。乳状液通过将该M4N/芝麻油/Tween20溶液超声5分钟 制备，其中超声的微端探头的振幅调节至60％的最大探头振幅。通过将 烧杯对着白色背景、之后对着黑色背景寻找是否存在颗粒，可观察所述 M4N/芝麻油/Tween20混合物是否存在任何未溶解的M4N。最终的M4N/ 芝麻油/Tween20溶液在室温避光保存。
此方法可按比例放大或缩小以获得所需体积或浓度的M4N。在其他 脂质结合其它表面活性剂，或水溶性有机溶剂中含M4N的配方可类似制 得，例如，通过在上述方法中将芝麻油或Tween20替代为玉米油，橄 榄油、大豆油、薄荷油、Tween80、TPGS、卵磷脂、PG、PEG 300、PEG 400、PEG 400单月桂酸酯、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)或其他增 溶剂，及其结合。
表19 M4N在水不溶性脂质中的溶解性
赋性剂 赋性剂浓度 药物浓度 (mg/mL， 除另有说 明) 搅拌 后的 溶解 加热后的 溶解 冷却 后的 溶解 室温 下的 稳定 时间
玉米油 100％ 1 N 60℃下Y Y ＞3天 10 N 60℃下Y Y ＞3天 20 N 60℃下Y Y ＜3天 40 N 60℃下Y Y ＜3天 50 N 60℃下Y Y ＜3天 60 N 60℃下Y Y ＜1天 100 N 60℃下Y N 橄榄油 100％ 30 N 60℃下Y N 芝麻油 100％ 10 Y ＞3天 20 N 60℃下Y Y ＞3天 30 N 60℃下Y Y ＜3天 50 N 60℃下Y Y ＜1天 薄荷油 1 Y ＞3天 10 Y ＞3天 20 Y ＞3天 40 N 40℃下Y Y ＞3天 60 N 40℃下Y Y ＜3天 100 N 40℃下Y Y ＜1天 125 N 40℃下Y Y ＜1天 大豆油 100％ 10 N 60℃下Y Y ＞7天 30 N 60℃下Y N 50 N 60℃下Y N 矿物油 100％ 10 N 60℃下Y Y ＞7天
50 N 60℃下Y Y ＜1天 100 N 60℃下Y N 200 N 60℃下Y N 橄榄油， 大豆油 80％橄榄油， 20％大豆油 60 N 70℃下Y N 芝麻油， Tween20 和甘油 75％芝麻油， 9％Tween20 ，16％甘油 24.3 N 60℃下Y Y ＜7天 90％盐水中的 10％油乳状液 2.4 Y ＜1天 芝麻油和 Tween20 89％芝麻油， 11％Tween2 0 29 N 60℃下Y Y ＞7天 90％盐水中的 10％油乳状液 2.9 Y ＜3天 85％芝麻油， 15％Tween2 0 40 N 45℃下Y N 85％芝麻油， 15％Tween2 0 60 N 55℃下Y N 薄荷油， PEG 300 50％薄荷油， 50％PEG 300 40 N 35℃下Y Y ＞7天 60 N 35℃下Y Y ＞7天 125 N 35℃下Y N
60％薄荷油， 40％PEG 300 60 N 40℃下Y Y ＞3天 薄荷油， PEG 400 50％薄荷油， 50％PEG 400 40 N 40℃下Y Y ＞7天 60 N 40℃下Y Y ＞7天 100 N 40℃下Y N 125 N 40℃下Y N 60％薄荷油， 40％PEG 400 60 N 40℃下Y N 薄荷油和 Tween20 50％薄荷油， 50％Tween2 0 40 N 40℃下Y Y ＞3天 60 N 40℃下Y Y ＞3天 125 N 40℃下Y N 薄荷油 ， PEG 400， 甘油 40％薄荷油， 40％PEG 400，20％甘油 52 N 40℃下Y N 45％薄荷油， 45％PEG 400，10％甘油 59 N 40℃下Y N 薄荷油和 芝麻油 50％薄荷油， 50％芝麻油 20 Y ＞3天 40 N 40℃下Y Y ＞3天 60 N 40℃下Y Y ＞3天
薄荷油， Tween20 和PEG 400 33％薄荷油， 33％Tween2 0，33％PEG 400 60 N 40℃下Y Y ＞3天
表20示出了M4N在水溶性有机溶剂EtOH、PG、PEG 300、PEG 400、 PEG 400单月桂酸酯、甘油、PVP及其某些结合中的溶解性结果。
表20 M4N在水溶性有机溶剂中的溶解性
赋性剂 赋性剂 浓度 药物浓度 (mg/mL) 搅拌 后的 溶解 加热后的 溶解 冷却 后的 溶解 室温下 的稳定 时间 乙醇 100％ 1 Y ＞3天 10 N 37℃下N PVP 15％ 1 N 90℃下N 10 N 90℃下N 丙二醇 100％ 1 N 55℃下Y Y ＜1天 10 N 55℃下Y Y ＜1天 20 N 55℃下Y Y ＜1天 PEG 400 100％ 25 N 50℃下Y Y ＜7天 30 N 50℃下Y Y ＜3天 40 N 50℃下Y Y ＜1天 50 N 60℃下Y Y ＜1天 100 N 60℃下Y N
5％ 10 N 50℃下N PEG 400 单月桂酸 酯 100％ 20 N 50℃下Y Y ＞3天 50 N 50℃下Y Y ＜1天 PEG 300 100％ 25 N 50℃下Y Y ＜7天 30 N 50℃下Y Y ＜3天 40 N 50℃下Y Y ＜1天 50 N 60℃下Y Y ＜1天 100 N 60℃下Y N 33％ 10 N 50℃下N 甘油 100％ 1 N 70℃下Y N 10 N 70℃下Y N 20 N 70℃下Y N 丙二醇和 乙醇 40％丙二 醇，10％ 乙醇 10 N N
实施例8 M4N在非离子表面活性剂中的溶解性
以约60mg/mL浓度在Tween20中的10mL M4N溶液如下制备：将 约10mL Tween20加入至含搅拌棒的玻璃烧杯中。将该烧杯置于磁力平 台，设置搅拌棒以中速搅拌。将约600mg M4N缓慢地加入至Tween20 中，在刮勺的帮助下加入至烧杯的中央，以避免M4N粘附在烧杯壁上。 该M4N/Tween20混合物被搅拌约2小时，或者直到所有的M4N溶解或 均匀悬浮而不存在任何聚集。该M4N/Tween20混合物可在60℃加热 30min。(或者如果需要更大的溶液体积，更长时间，例如，500mL该 M4N/Tween20混合物在60℃加热1hr)，或需要确保M4N充分溶解的更 长时间。通过将烧杯对着白色背景、之后对着黑色背景寻找是否存在颗 粒，可观察所述M4N/Tween20混合物是否存在任何未溶解的M4N。最 终的M4N/Tween20溶液在室温避光保存。在贮存期间如果形成结晶， 该M4N/Tween20溶液可置于加热磁力平台上伴随搅拌在60℃重新加热 约1hr，或者直到所有M4N溶回溶液中。
此方法可按比例放大或缩小以获得所需体积或浓度的M4N，且可升 高或降低加热温度以使M4N溶解。在其他非离子表面活性剂、离子表面 活性剂或两性分子中含M4N的配方可类似制得，例如，通过在上述方法 中将Tween20替代为Tween80，其他增溶剂，及其结合。M4N在 Tween20、Tween80，以及Tween20和PEG 400的结合中的溶解性结 果结果在表21中示出。
表21显示，在室温下，1mg/mL浓度的M4N可溶解于Tween20或 Tween80中。Tween20溶液中的M4N(“M4N/Tween20”)在室温下 的稳定性大于7天，而Tween80溶液中的M4N(“M4N/Tween80”) 在室温下的稳定性观察大于3天。在50℃，更高浓度的M4N可溶解于 Tween20或Tween80中。此外，Tween20中达60mg/mL浓度或 Tween80中达50mg/mL浓度时，冷却后M4N仍然保持在溶液中，然而， Tween20中在80mg/mL和100mg/mL水平时，冷却后为不溶。观察到 10mg/mL和20mg/mL的M4N/Tween20溶液在室温下稳定性大于7天。 观察到40mg/mL和80mg/mL的M4N/Tween20溶液在室温下稳定性小 于3天。对于M4N/Tween80溶液，10mg/mL溶液观察到在室温下可稳 定大于3天，而50mg/mL溶液在室温下稳定性小于1天。
结果还显示，当在65℃加热时，M4N可溶解于50％Tween20和 50％PEG 400的结合，M4N浓度达60mg/mL。冷却后，M4N仍然保持在 这些配方的溶液中，该溶液在室温下稳定性大于3天。
表22示出了M4N以μg/mL的浓度及其以μM量计的相应浓度。
表21 M4N在非离子表面活性剂中的溶解性
赋性剂 赋性剂浓度 药物浓度 (mg/mL) 搅拌 后的 溶解 加热后的 溶解 冷却 后的 溶解 室温 下的 稳定 时间 Tween20 100％(v/v) 1 Y ＞7天 10 N 50℃下Y Y ＞7天 20 N 50℃下Y Y ＞7天 40 N 50℃下Y Y ＜3天 60 N 50℃下Y Y ＜3天 80 N 50℃下Y N 100 N 50℃下Y N Tween80 100(v/v) 1 Y ＞3天 10 N 50℃下Y Y ＞3天 50 N 50℃下Y Y ＜1天 Tween20， PEG 400 50％Tween20， 50％PEG 400 30 N 65℃下Y Y ＞3天 40 N 65℃下Y Y ＞3天 50 N 65℃下Y Y ＞3天 60 N 65℃下Y Y ＞3天
表22 M4N的浓度转换表
M4N以μg/mL计 M4N以μM计 0 0 7.2 20
14.2 40 21.5 60 28.7 80
实施例9含M4N的HP-β-CD的冻干配方
HP-β-CD中M4N浓度为约185mg/g(w/w)的120mg冻干粉如下进 行制备。使用等摩尔量的HP-β-CD和M4N来增加HP-β-CD和M4N之间 的络合比率。将约98mg的HP-β-CD和约22.2mg的M4N在1.5mL大小 的聚丙烯管中混合。将约0.2mLWFI加入至含HP-β-CD/M4N粉末混合物 的聚丙烯管中的混合物中，并震动1min以产生HP-β-CD/M4N的水悬浮 液。该HP-β-CD/M4N悬浮液在-20℃冰冻24hr。随后，将HP-β-CD/M4N 悬浮液以1400rpm、真空下、60℃离心约2hr，以将所有的水从悬浮液中 除去。HP-β-CD/M4N复合物的干粉重约120mg。随后，将HP-β-CD/M4N 粉末复合物在水或其他增溶剂中溶解或重新悬浮。最终的M4N/HP-β-CD 粉末复合物在室温避光保存。此方法可按比例放大或缩小以获得所需体 积或浓度的M4N。含M4N与其他环糊精的配方可类似制备，例如，在上 述方法中，将HP-β-CD替换为其他环糊精。显示在表1中的结果说明， 冷冻干燥HP-β-CD/M4N悬浮液后获得的HP-β-CD/M4N复合物粉末含约 81.5％HP-β-CD和18.5％M4N。
HP-β-CD/HPMC中M4N浓度为约150mg/g(w/w)的400mg冻干 粉如下进行制备。将如上制得的约1mL50％HP-β-CD/0.5％HPMC溶液加 入至1.5mL大小的聚丙烯管中。将约60mgM4N加入至含HP-β-CD/HPMC 悬浮液的聚丙烯管中的混合物中，并震荡1min以产生 HP-β-CD/HPMC/M4N悬浮液。该HP-β-CD/HPMC/M4N悬浮液在-20℃冰 冻24hr。随后，将HP-β-CD/HPMC/M4N悬浮液以1400rpm、真空下、60 ℃离心约5hr，以将所有的水从悬浮液中除去。HP-β-CD/HPMC/M4N复 合物的干粉重约400mg。随后，可将HP-β-CD/HPMC/M4N粉末复合物在 水或其他增溶剂中溶解或重新悬浮。最终的M4N/HP-β-CD/HPMC粉末复 合物在室温避光保存。此发明可按比例放大或缩小以获得所需体积或浓 度的M4N。含M4N与其他环糊精/纤维素溶液的配方可类似制备，例如， 在上述方法中，将HP-β-CD替换为其他环糊精，或者将HPMC替代为其 他改性纤维素。显示在表18中的结果说明，冷冻干燥 HP-β-CD/HPMC/M4N悬浮液后获得的HP-β-CD/HPMC/M4N复合物粉末 含约84％HP-β-CD，1％HPMC和15％M4N。
实施例10用于输送M4N的IV管的测试
在这个试验中，各种类型的输液管被加以测试其相容性并优化M4N 的静脉输送。对相容性的试验基于目测观察和HPLC(高压液相色谱)分 析。
目测观察如下进行：将进行测试的约5mL的配方(“配方材料”)通 过约20cm长的输液管。在室温下(25℃)，将该配方材料保持在管中约 24hr。随后，将该配方材料通过该输液管循环多次(例如，约5次)，并 收集在烧杯或收集管中。仔细检查该配方材料看是否出现沉淀或微粒， 包括将该烧杯或收集管对着白色背景，随后对着黑色背景。
使用HPLC分析的相容性测试随着被测试的输液管、时间长度及输 液管的目的而在方法上发生变化。这个测试测量通过不同输液管循环前 后溶液中M4N的量。
决定相容性的临界值为90％分析纯，是指在与输液管相互作用及试 验完成之后，如果约90％的M4N保持在溶液中，该材料可被认为是相容 性的。低于90％临界值的任何量被认为是不相容输液管。结果总结在表 23中。
这个试验显示，PTFE(聚四氟乙烯)和氟橡胶(Barnant公司，巴灵 顿，美国依利诺斯州)、聚丙烯(Cole-Parmer，Vernon Hills，美国伊利诺 斯州)、FEP(聚全氟乙丙烯)(Saint-Gobain，Mickleton，美国新泽西州)、 PTFE(Cole-Parmer)、聚乙烯(Intramedic，Becton Dickinson，斯帕克斯， 美国马里兰州)和铂处理硅橡胶(小尺寸)(Cole-Parmer)对于输送本文 所述配方中的M4N都具有相容性。
表23用于输送M4N的相容性管材
相容性管材 输液管类型 品牌名称 输液管制造商 目录号 PTFE和氟橡胶 CHEM-SURE Barnant公司 96210-16 聚丙烯 Cole-Parmer 06500-02 FEP Saint-Gobain P288605 PTFE Cole-Parmer 06417-31 聚乙烯 Intramedic BD 427420 铂处理硅橡胶(小尺寸)** Cole-Parmer 95802-01 非相容性管材 输液管类型 品牌名称 输液管制造商 目录号 铂处理硅橡胶(制造的) Cole-Parmer 热固橡胶(Thermal set rubber)Viton B(67％氟) Viton 带USP矿物油的聚丙烯基 材料 PharMed 聚亚安酯 Cole-Parmer 96140-42 带硅油的苯乙烯-乙烯-丁 烯改性的嵌段共聚物 C-Flex PVC(通路中含DEHP) 180 Nalgene 8000-0002 PVC(不含邻苯二甲酸酯) 580 Nalgene 8008-0004
**不是优选的，但具有某些相容性
实施例11 药物组合物的内胞膜中(intravesicular)给药
一种或多种前述药物组合物可用内胞膜中给药，诸如以800mg剂量 每周进行6周，原位治疗膀胱癌。该组合物含API，诸如NDGA化合物， 例如M4N。所述API，例如M4N，以每5mL瓶200mg存在于组合物之 中，并在2℃-8℃(36-46)下冰箱中储存。在将所述组合物向受试者 给药之前，将药瓶从冰箱中取出，并允许不加热回到室温。可通过加入 800mg(20mL)至55mL的0.9％生理盐水注射液，USP，将组合物进行 稀释。通过内胞膜给药API(当如上稀释时，共75mL体积)进行膀胱灌 洗，使得API保持2hr，随后排空。使用如上所述的相容性输液管。
如果膀胱被损伤、发炎或穿孔，建议医生或患者不给予含API的组 合物，因为丧失粘膜的完整性会发生系统性吸收。对于具有严重过敏膀 胱症状的患者，应小心使用该化合物，因为在灌入或保持期中API可造 成膀胱过敏症状。患者被告知，约24hr内尿液可为淡红或淡粉红色的。 实施例12人体阶段0，在8位健康男性受试者体内的14C标记的M4N三 交叉微剂量药物动力学研究
当以亚治疗剂量，或以餐后和空腹条件下的单口服剂量或单静脉剂 量(在表24中，分别为方式A-C)，向人体给药时，这个试验被设计用 来评价M4N的吸收。这个试验为在健康男性受试者目标人群中的三交叉 试验方案，并由持续约35小时的三个试验阶段构成，各阶段由剂量给药 之间的至少7天的最小期间间隔。在各试验阶段的过程中，在剂量给药 后，在特定时间点采集药物动力学血样，以及以预定的时间间隔收集尿 液。在剂量给药后24hr的试验特定过程完成之后，受试者可离开临床单 位。
在这个研究中，M4N以100μg的量向人给药。M4N被以14C少量标 记(3.3kBq每100μg)，并向健康的志愿者给药。各次口服给药的M4N 包括在尺寸0的凝胶胶囊中0.1mg的14C标记的M4N和376.8mg甘油单 油酸酯。单静脉输注的M4N包括0.1mg/mL14C标记的M4N、30％(w/v) HP-β-CD和25％(v/v)PEG，用水稀释至1mL以用于推注注射。随后从 各受试者收集血样和尿样，使用加速器质谱法(AMS)分析样品的14C 含量，以测定相比于M4N的IV剂量，M4N的口服剂量的在Tmax时出现 的最大M4N浓度(Cmax)，相应于在测试(AUC0-t)和总(AUC0-∞)时间 的M4N的总吸收的曲线(AUC)下的总面积，各样品的最终半衰期(T1/2) 及各相对和总生物利用度(Fre1和F)。14C的药物动力学参数的平均±SD 值在表24中列出。M4N的基线水平对剂量给药之间的期间后残留在受试 者中的任何残余M4N进行校正，从而不影响任何随后剂量给药的M4N水 平。
表24 14C的药物动力学参数的平均值±SD值(基线校准)
参数 方式A (口服，餐后) 方式B(口服， 空腹) 方式C(静脉 的) Cmax(pmol/L) 5.94±1.33 9.29±1.40 10.31±1.77 Tmax(小时) 2.50a 1.00a 0.08a AUC0-t(pmol.h/L) 88.0±19.4 117.2±9.2 96.6±9.23 AUC0-∞(pmol.h/L) 625.6±183.7 416.6±142.6 707.7±380.4 T1/2(小时) 96.5±20.7 50.9±22.4 116.2±64.0 Fre1(％) 75.1±16.2 - - F(％) 91.2±19.1 122.1±14.5 -
a中值
方式A：在高脂早餐后，以100μg14C标记的M4N(3.3kBq)作为单口服剂量给药。
方式B：在隔夜空腹后，以100μg14C标记的M4N(3.3kBq)作为单口服剂量给药。
方式C：在隔夜空腹后，以100μg14C标记的M4N(3.3kBq)作为1mL推注静脉溶液给药。
对于口服剂量给药而言，高脂早餐后的100μg14C标记的M4N口服给 药后的总14C的Cmax值(Cmax＝5.94±1.33pmol/L)低于隔夜空腹后的口 服给药后的总14C的Cmax值(Cmax＝9.29±1.40pmol/L)。Tmax在餐后受试 者体内趋向于较空腹受试者体内出现的更迟。在餐后受试者中，Tmax，即 Cmax的出现时间，高度可变且在剂量给药后1.5至24hr范围内，在空腹 受试者中，Tmax通常发生在剂量给药后1hr(0.50至2.00hr范围)。餐后 受试者的AUC0-t值通常低于空腹受试者的值。
在静脉剂量给药后，正如所预期的，在10位受试者中的8位中，最 大浓度(Cmax＝10.31±1.77pmol/L)出现在第一采样时间(剂量给药后 0.08hr)。在2位受试者中，Tmax为剂量给药后0.17hr。餐后受试者中单口 服剂量给药后的总14C血浆浓度的AUC0-t值稍低于静脉剂量给药的值。 相反，空腹受试者中单口服剂量给药后的相应AUC0-t值稍高于静脉剂量 给药的值。
研究配方在口服和静脉给药中都具有良好的耐受性。无严重或剧烈 的不良症状，且受试者没有因为试验治疗相关的不良症状而中断试验。 在目测或ECG(心电图)中未发现明显的临床变化。
关于这个研究总结如下，在餐后和空腹状态口服给药后的M4N表观 吸收非常高。在存在食物时，相比于空腹状态，吸收的速率和程度较低， Cmax出现时间较空腹状态延长。这些结论基于的假设是口服给药剂量中 14C标记的M4N在吸收前不被分解。
实施例13 M4N在水溶性有机溶剂中溶解度的补充研究
在表25中列出的M4N在水溶性有机溶剂的结合中的溶解度被评估 达48hr。在室温孵育2、24和48hr后，样品通过反相-HPLC(“RP-HPLC”) 进行分析，以定量M4N的溶解度。为制备M4N样品，将溶解于丙酮中的 200μL 100mg/mL的M4N置于1.5mL的聚丙烯微管中。将溶剂在室温中 蒸发48hr，直到样品完全干燥。
在15mL聚丙烯离心管中制备水可混溶的有机溶剂配方。制备各 10mL配方。各溶剂基于采用在25℃下各自的密度的重量被加入。在短 暂混合后，各配方通过0.45μm不含表面活性剂的醋酸纤维素(“SFCA”) 过滤器进行过滤，滤液收集在干净的15mL管中。配方在室温保存直至 使用。
将400μL各配方的结合(表25，其中Benz＝苯甲醇；Crem＝ CremophorEL；DMA＝二甲基乙酰胺；T80＝Tween80)加入至微管 中，使得M4N的最大溶解度为50mg/mL。M4N的溶解度通过室温孵育2、 24和48hr时的RP-HPLC进行计算。在各时间点上，将样品以13000rpm 离心2min以沉淀任何固体M4N。如表25所示，一半以上的测试的配方 条件能溶解M4N的浓度大于10mg/mL。在2和48hr时，M4N在甘油中 的溶解度不能检测到。
表25在可与水混溶的有机溶剂中达48hr的M4N的溶解度
M4N(mg/mL) 时间(hr) 组合物 2 24 48 100％EtOH 7.20 7.22 7.91 100％PG 1.10 1.33 1.76 100％PEG 300 5.81 10.37 11.52 100％甘油 XXX 0.08 XXX 100％Crem 1.19 7.51 12.48 50％EtOH，50％PG 3.64 4.15 4.43 50％EtOH，50％PEG 300 10.94 15.07 16.61 50％EtOH，50％甘油 1.14 1.53 1.60 50％EtOH，50％Crem 13.95 17.58 18.49 50％EtOH，50％T80 15.91 19.28 19.68 50％PG，50％PEG 300 2.65 4.88 5.30 50％PG，50％甘油 0.13 0.48 0.51 50％PG，50％Crem 2.94 6.33 7.20 50％PG，50％T80 5.07 8.16 8.41 48％EtOH，50％PG，2％Benz 4.42 4.79 4.92 48％EtOH，50％PEG300，2％Benz 14.51 15.76 16.49 48％EtOH，50％甘油，2％Benz 1.25 1.66 1.73 48％EtOH，50％Crem，2％Benz 14.02 18.17 18.51 48％EtOH，50％T80，2％Benz 16.17 19.55 19.96 44％EtOH，50％PG，6％DMA 4.80 5.48 2.93 44％EtOH，50％PEG300，6％DMA 15.12 18.61 18.27 44％EtOH，50％甘油，6％DMA 1.43 1.90 2.01
44％EtOH，50％Crem，6％DMA 14.85 20.42 21.08 44％EtOH，50％T80，6％DMA 17.72 22.41 23.00 18％EtOH，30％PG，40％PEG300，10％T80，2％Benz 7.84 9.79 10.16 18％EtOH，30％PG，40％甘油，10％T80，2％Benz 0.58 1.01 1.15 18％EtOH，30％PG，40％Crem，10％T80，2％Benz 8.64 11.78 11.86 14％EtOH，30％PG，40％PEG300，10％T80，6％DMA 9.40 10.55 11.30 14％EtOH，30％PG，40％甘油，10％T80，6％DMA 0.85 1.24 1.48 14％EtOH，30％PG，40％Crem，10％T80，6％DMA 9.03 12.08 12.28 28％EtOH，30％PG，30％PEG300，10％T80，2％Benz 8.87 10.19 10.27 28％EtOH，30％PG，30％甘油，10％T80，2％Benz 1.86 2.22 2.53 28％EtOH，30％PG，30％Crem，10％T80，2％Benz 8.96 11.35 11.28 24％EtOH，30％PG，30％PEG300，10％T80，6％DMA 9.91 10.80 10.67 24％EtOH，30％PG，30％甘油，10％T80，6％DMA 1.63 2.26 2.52 24％EtOH，30％PG，30％Crem，10％T80，6％DMA 10.42 11.25 12.48
实施例14 M4N在含水溶液中的溶解度
M4N在含羟丙基HP-β-CD或磺丁醚β-环糊精(SE-β-CD)(Captisol， CyDex公司，Lenexa，美国堪萨斯州)的含水溶液中的溶解度在上述实施 例13中描述的室温下评估达48小时。根据重量/体积比准备十份50％的 HP-β-CD和SE-β-CD溶液。如实施例13所述制备用于样品的M4N。在 OHAUS分析Plus天平上在容量瓶中称入1.0g和5.0g之间的每一种化 合物。每一样品用注射用水(WFI)定容至10mL。在40℃下孵育1小时 后，将制备液通过0.45μm SFCA过滤器滤入干净的15mL管。将制备液 保存在室温备用。
如表26所示，M4N在WFI，0.9％盐水，5％葡萄糖(D5W)中的溶解 度在此研究的整个过程中位于RP-HPLC方法的定量极限以下。注意增加 的M4N溶解度是HP-β-CD和Captisol浓度和时间的函数。
表26.M4N在含水溶液中达48小时的溶解度
M4N(mg/mL)
时间(hrs) 组合物 2 24 48 WFI XXX XXX XXX 0.9％盐水 XXX XXX XXX D5W XXX XXX XXX 10％HP-β-CD 0.35 0.45 0.46 20％HP-β-CD 0.66 0.91 0.88 30％HP-β-CD 1.38 1.97 2.02 40％HP-β-CD 1.89 3.01 3.23 50％HP-β-CD 2.52 4.95 4.98 10％Captisol 0.48 0.74 0.94 20％Captisol 0.76 1.45 1.39 30％Captisol 1.57 2.87 2.69 40％Captisol 1.42 3.90 4.15 50％Captisol 1.17 4.49 6.41
大于20种的使用水混溶的有机溶剂的配方条件能溶解M4N至大于 10mg/mL的浓度。M4N在WFI，0.9％盐水，5％D5W中的溶解度低于 RP-HPLC方法的检测极限。M4N溶解度的增加是HP-β-CD和Captisol 浓度和时间的函数。
实施例15 M4N在羟丙基β-环糊精中的溶解度
M4N在不同浓度HP-β-CD中的水溶解度通过Higuchi和Connors (1965)所报道的方法进行计算。简而言之，精确称量M4N并以超过其 水溶解度的量添加的M4N与浓度递增(0-350mmol/L)的HP-β-CD水溶 液，在室温轻轻地一起旋转(～12rpm)48hr。随后，将M4N/HP-β-CD 溶液通过0.45μm的SFCA过滤器进行过滤，并以RP-HPLC进行分析。
尽管大部分M4N/HP-β-CD复合物被认为是包合配合物，环糊精也已 知能形成通过胶束状结构而能溶解药物的非包合配合物和复合物集合 体。该相-溶解度曲线并非验证包合配合物的形成，而仅说明不断升高的 环糊精浓度如何影响药物的溶解度。M4N/HP-β-CD复合物的形成是非线 性的，但在这个实施例的试验中并不研究精确的化学计量(以及稳定性 常数)，但其可通过他其他方法如NMR或电势测定法进行测定。
实施例16在HP-β-CD/PEG 300缓冲溶液中M4N的稳定性
在60℃孵育后，计算10mg/mL M4N(以75∶25 40％HP-β-CD：40mg/mL M4N PEG 300的比率制备)在15mM缓冲溶液中的稳定性。
缓冲的40％HP-β-CD溶液基于重量比体积进行制备。在样品中使用 的M4N如实施例13中的描述进行制备。在OHAUS分析Plus天平上的 5mL容量瓶中称量2.0g HP-β-CD。将1mL 100mM的缓冲溶液加至各瓶 中。以WFI将各样品定容至5mL。在40℃孵育1hr之后，将制备液通过 0.45μm的SFCA过滤器过滤至干净的15mL管中。制备液在室温保存直 至使用。
750μL的40％HP-β-CD缓冲溶液被置于1.5mL聚丙烯微管中。将 250μL的40mg/mLM4N PEG 300加入至各微管中，使得溶解度为 10mg/mL M4N。在将试样管轻轻翻转之后，用Orion，420A型pH计测量 各溶液的pH。取出一初始等份进行RP-HPLC分析。随后，将测试样品 置于Precision 60℃培养箱中。通过RP-HPLC测定M4N的稳定性。在各 时间点，以13,000rpm将样品离心2min，以沉淀任何固体M4N。
如表27所示，在60℃孵育14天后，观测到各M4N溶液的浓度有轻 微的下降。RP-HPLC数据未显示样品杂质的升高，其可说明M4N浓度下 降的程度。然而，在M4N的杂质中观测到依赖pH的变化，然而，这些 杂质占不到0.1％的总峰面积。在孵育期间，几乎没有观测到表观样品pH 的变化(表27)。
表27 60℃下在HP-β-CD/PEG溶液中达14天的M4N稳定性
组合物 M4N(mg/mL) 时间(天)
0 2 6 10 14 WFI，30％HP-β-CD，25％PEG300 10.4 10.1 9.9 9.7 9.6 15mM磷酸盐，pH3 30％HP-β-CD，25％PEG300 10.3 10.1 9.6 9.7 9.6 15mM磷酸盐，pH4 30％HP-β-CD，25％PEG300 10.5 10.1 9.6 9.7 9.6 15mM醋酸盐，pH5 30％HP-β-CD，25％PEG300 10.6 10.2 9.6 9.7 9.6 15mM醋酸盐，pH6 30％HP-β-CD，25％PEG300 10.5 10.1 9.7 9.7 9.6 15mM磷酸盐，pH7 30％HP-β-CD，25％PEG300 10.5 10.3 9.7 9.7 9.7 15mM磷酸盐，pH8 30％HP-β-CD，25％PEG300 10.6 10.4 9.7 9.8 9.6 15mM磷酸盐，pH9 30％HP-β-CD，25％PEG300 10.4 10.2 9.7 9.8 9.7 15mM硼酸盐，pH10 30％HP-β-CD，25％PEG300 10.5 10.1 9.7 9.6 9.6 15mM硼酸盐，pH11 30％HP-β-CD，25％PEG300 10.5 10.3 9.8 9.5 9.4
在60℃孵育14天后观测到，无论何种表观样品pH或缓冲液，稳定 性都统一下降，如M4N回收的损失所示。
实施例17在11-14mg/mL PEG 300/HP-β-CD溶液中M4N的稳定性
为支持制造的技术要求，这个试验检测了不同M4N目标浓度下PEG 300/HP-β-CD的结合的24hr室温稳定性。M4N的备用样品是在100％PEG 300中，以33-56mg/mL药物浓度，在60℃下如下制备。
采用在实施例13和16中描述的方法，将M4N散装药物在PEG 300 中溶解至浓度为33、44、48、52、55和56mg/mL(w/w)，随后在60℃ 中孵育至少2hr。在44mg/mL以上M4N的充分溶解需要剧烈振荡和混合。 将M4N备用溶液通过0.45μm的SFCA过滤器进行过滤，并在制备后的 30min中内使用。另外，在无菌WFI中制备40％HP-β-CD(w/v)溶液并 过滤。40％HP-β-CD备用液和M4N/PEG 300备用液在1.5mL的聚丙烯微 管中混合。在室温孵育2和24hr时，用RP-HPLC测量M4N的稳定性。
将所需量的M4N加至40％HP-β-CD中，以产生表28所列出的最终 浓度的药物和赋性剂。样品在室温下轻轻摇晃(～12rpm)。在孵育2和 24hr时，样品以13,000rpm离心2min，取出50μL等份样进行RP-HPLC 分析。无论何种目标M4N或配方，孵育24hr后，溶解度几乎没有观测到 任何变化(表28)。
表28在11-14mg/mL PEG 300/HP-β-CD溶液中M4N的稳定性
所测的M4N mg/mL 组合物 t＝2hr t＝24hr 11mg/mL M4N，25％PEG300，30％HP-β-CD 11.3 11.3 12mg/mL M4N，25％PEG300，30％HP-β-CD 11.8 11.6 13mg/mL M4N，25％PEG300，30％HP-β-CD 12.7 12.7 14mg/mL M4N，25％PEG300，30％HP-β-CD 13.5 13.5 11mg/mL M4N，33％PEG300，27％HP-β-CD 11.4 11.3 11mg/mL M4N，20％PEG300，32％HP-β-CD 11.5 11.4
含11-14mg/mL M4N的测试样品在室温孵育24hr后仍然稳定，其中 M4N配成25％PEG 300和30％HP-β-CD的最终浓度。
实施例18 40mg/mL M4N/PEG 300的稳定性
测量溶解于100％PEG 300中的40mg/mL M4N在30℃、45℃和60℃ 下孵育达24hr的稳定性。40mg/mL的M4N PEG 300备用液在60℃，依 照实施例17中描述的方法进行制备。随后，取出等份试样，并在适当的 温度孵育。在整个孵育过程中，样品以450rpm旋转。试验全程收集目测 观测结果和RP-HPLC数据。如表29所示，在30℃孵育6hr之后，在 40mg/mL M4N/PEG 300配方中观测到微小结晶，24hr后出现更多。结晶 的形成与溶解的M4N的损失一致(表30)。由目测观测结果和RP-HPLC 分析验证(表29和30)，在45℃和60℃下孵育的40mg/mL M4N/PEG 300 样品在24hr的孵育后保持稳定。在任何孵育温度下，未观测到杂质峰的 量或类型的变化。
表29.40mg/mLM4N/PEG 300稳定性样品的目视外观
孵育条件 外观 时间(hr) 2 4 6 24 30℃ 清澈 清澈 少量微小结 晶 大量微小结 晶 45℃ 清澈 清澈 清澈 清澈 60℃ 清澈 清澈 清澈 清澈
表30.40mg/mL M4N/PEG 300稳定性样品：RP-HPLC分析
孵育条件 M4N(mg/mL) 时间(hr) 2 4 6 24 30℃ 39.5 40.8 40.6 37.4 45℃ 40.4 39.8 40.6 60℃ 39.1 39.2 39.2
在30℃孵育6hr后，在40mg/mL M4N/PEG 300配方中观测到微小结 晶。24小时后，观测到更多结晶，以及观测到RP-HPLC分析测定的溶解 性M4N的损失＞5％。
如目测观测结果和RP-HPLC分析验证，在45℃和60℃孵育的 40mg/mL M4N/PEG 300样品在孵育24hr后保持稳定。
本领域普通技术人员应当理解的是，可对上述具体实施例作出变化 而不背离本发明的理念。因此，应当理解的是，本发明并不限于所公开 的具体实施例，而旨在覆盖由所附权利要求限定的本发明的主旨和范围 之内的修改。
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