技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体提供了一种抗A/B亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗及其 制备方法和应用。
背景技术
禽白血病是指由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽反转录病毒引起的以禽类造血组织 中某些细胞成分过度增生为主的各种可传染的肿瘤性疾病。以禽淋巴细胞白血病和髓细胞白 血病较为常见，通过垂直传播和水平传播两种方式在世界各国鸡群中广泛流行，引起鸡死亡、 消瘦、生长发育不良，同时引起机体抵抗力下降和免疫抑制，是危害养禽业的主要疾病之一。 依据病毒囊膜糖蛋白的抗原差异、病毒干扰实验、宿主范围和基因组的分子生物学特性，感 染鸡群的禽白血病病毒群主要分为A、B、C、D、E、J六个亚群，其中A、B亚群毒株基因序 列具有很高的同源性，具有相近的病毒特性。
我国A/B亚群禽白血病的发生已相当普遍，临床病例从最初的商品肉鸡群发展到商品蛋 鸡、地方种鸡群及其他家禽，并伴随着致瘤性增强及肿瘤多样性的发生。研究显示，我国的 A/B亚群禽白血病毒呈现高感染率、高发病率，早期感染普遍、发病日龄明显提前，混合感 染多发/频发，宿主范围扩展、肿瘤谱扩大，病理变化复杂化等特点，给我国的养禽业造成了 巨大的损失。基于病毒囊膜蛋白的超变特性，加之自身的免疫逃避能力及宿主的免疫选择压 力，使得禽白血病病毒的抗原变动性极大，成为其传统灭活疫苗、弱毒疫苗研制无法逾越的 瓶颈。目前，临床上尚无相关药物及疫苗用于A/B亚群禽白血病的防控。国外通过净化控制 本病的发生，由于净化周期长、成本高，在我国目前还未能有效实施，只能通过淘汰感染鸡 只进行大群净化，无法控制ALV-A/B的感染，不断出现ALV-A/B大范围密集感染的报道，我 国的A/B亚群禽白血病防控形势严峻。国内外均有过对于A/B亚群禽白血病的疫苗研发方法 的报道，主要为传统的甲醛灭活疫苗、弱毒疫苗，基于SU的亚单位疫苗、核酸疫苗，这些疫 苗在一定程度上可以对机体提供保护，但都会造成毒力恢复以及散毒的可能，免疫效果不稳 定无法临床应用。基于以上现状，研制安全高效的表位疫苗对于A/B亚群禽白血病病毒的防 控具有重大现实意义。
表位疫苗是近年发展起来成熟的新型疫苗，在人源病毒中研究深入。表位疫苗是利用基 因工程手段，体外表达或人工合成病原微生物的表位，继而开发出预防性或治疗性疫苗。表 位疫苗相对传统疫苗拥有较多优势，表位肽短小，免疫原性强，可以克服主要组织相容性复 合体(MHC)分子的遗传限制，本身安全、无毒、稳定，可以直接刺激机体产生特异性免疫反应， 其最大的优点就是可以克服传统疫苗造成的毒力恢复或散毒的可能，有着非常广阔的发展前 景。目前，已开发出有效的艾滋病病毒、乙肝病毒、人类疱疹病毒等表位疫苗。ALV-A/B属 于反转录病毒。病毒囊膜蛋白(env)可分为由gp85基因编码的表面蛋白(surface protein,SU) 和gp37基因编码的跨膜蛋白(transmembrane protein，TM)，二者在一起形成二聚体，病毒 囊膜蛋白决定亚群的特异性。gp85是病毒囊膜蛋白表面的主要成分，在ALV感染吸附宿主细 胞并诱导机体产生特异性抗体中具有重要作用，含有众多的抗原表位，负责识别靶细胞膜上 的特异性受体，TM主要负责介导病毒与细胞的融合过程。基于ALV-A/B的病毒特性，表位疫 苗的研究成果为对抗ALV-A/B的超变特性，成功研制ALV-A/B疫苗提供了科学基础和技术支 撑。
发明内容
针对现有技术中的相关情况，发明人考虑将表位疫苗应用于抗禽A/B亚群禽白血病病毒 感染疫苗，进而经研究实验后提供了一种抗A/B亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗，该疫苗 采用原核表达后筛选纯化的高活性的重组蛋白His-cENV联合弗氏佐剂制备而得，其中编码重 组蛋白His-cENV的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，利用该表位疫苗免疫7日龄种禽雏鸡 可以产生1:128000的中和抗体，体外病毒中和实验、动物实验显示该表位疫苗可中和不同 ALV-A/B分离毒株，有效保护鸡群抵抗ALV-A/B毒株感染，该表位疫苗基于env来源的多表 位抗原基因序列，克服了ALV-A/B的病毒变异，开辟了ALV-A/B疫苗新时代，提供了抗ALV-A/B 感染的新手段，为ALV-A/B的防控提供了技术支撑。
发明人经研究发现ALV-J在整个env都存在不同的抗原表位，通过筛选env上的抗原表 位可以开发有效的多表位疫苗。通过发明人前期对ALV-A/B的致病性进行了系统深入的研究， 在系统解析其免疫抑制机制、跨种传播机制和免疫逃避机制的基础上，结合多表位可以传递 广谱表位信息这一理念，最终制备了抗禽A/B亚群禽白血病病毒感染疫苗，可以避免由于病 毒变异而造成的免疫失败，有利于提供更完全和更有针对性的免疫保护，表位疫苗的研究成 果为的研制开辟了新的方向和重要的技术支撑。
本发明的具体技术方案如下：
通过分析获得NCBI上发表的ALV-A/B囊膜上的抗原表位，筛选出代表流行毒株的抗原 表位基因序列，通过采用编码甘氨酸、丝氨酸的密码子进行串联，最终确定人工合成基因片 段1148bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，原核表达出重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，联合弗氏佐剂制备表位疫苗，所获得的表位疫苗可以实现保护机体抵抗A/B亚群 禽白血病感染。
其具体过程如下：
查找NCBI上发表的ALV-A/B囊膜基因序列，结合国内外对ALV-A/B抗原表位及免疫逃 避机制的研究进展，运用DNAman软件分析获得来源于囊膜基因的22段抗原表位，筛选出代 表流行毒株囊膜抗原表位基因序列，采用编码甘氨酸、丝氨酸的密码子进行串联，获得重组 囊膜基因序列1148bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述基因序列5’端含NcoⅠ酶 切位点，3’端含XhoⅠ酶切位点。
上述基因序列由上海生工生物工程有限公司合成，合成产物cENV连接至pUC57载体。
合成产物测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
将该基因片段连接至pET30a载体，得到了重组载体pET30a-cENV，使用1-1.5mmol/L IPTG 诱导表达得到带有HIS标签的重组蛋白His-cENV，进而利用该蛋白联合弗氏佐剂制备表位疫 苗。
本发明的这种表位疫苗安全高效，成本低易于大规模批量生产，可抵抗45％ALV-A/B毒 株的感染，二免后抗体维持时间达到11周，可以实现对种鸡开产前的保护，从而切断病毒的 垂直传播途径，对于我国A/B亚群禽白血病的防控净化具有重要意义，且特异性强可以实现 对禽A/B亚群禽白血病的保护；同时由于其含有广谱的表位信息，可以避免由于病毒变异而 造成的免疫失败，为A/B亚群禽白血病的防治提供更完全和更有针对性、更为高效安全的疫 苗保护。
附图说明
图1为重组质粒双酶切鉴定结果电泳图，
图中M为DL10000 Marker，1为使用限制性内切酶Nco I、Xho I双酶切pUC57-cENV后 获得的基因片段；
图2为重组表达菌表达结果及蛋白纯化前后SDS-PAGE分析结果，
图中M为170KD Protein Ladder；1为诱导表达菌液沉淀，2为上清，3为大量表达蛋白 沉淀，4为大量表达蛋白纯化后结果；
图3为Western Blot法检测重组蛋白，
图中A为使用His标签抗体，B为IDEXX检测试剂盒检测为阳性的鸡血清，验证结果。
具体实施方式
本实施例中所采用的具体试剂和仪器为：
(1)主要试剂
HRP酶标二抗为博奥森生物有限公司产品；
TMB单组份底物显色溶液，DAB显色试剂盒，PCR产物胶回收试剂盒为天根公司产品；
蛋白预染Marker，Taq聚合酶，限制性内切酶Nco I、Xho I为Thermo公司产品；
T4连接酶、pMD18-T载体、DNA Marker为大连宝生物有限公司产品；
质粒抽提试剂盒为OMEGA公司产品；
His标签抗体为北京全式金生物技术有限公司产品；
胰蛋白胨(Tryptone)及酵母抽提物(Yeast Extract)为Oxiod公司产品；
其余试剂为国产分析纯试剂。
(2)主要仪器
移液器、分光光度计为Eppendorf公司产品；
低温高速离心机为湖北湘仪公司产品；
凝胶成像系统为北京君意公司产品；
酶标仪为Thermo公司产品；
恒温摇床为上海申能博彩公司产品；
恒温培养箱、超净工作台为上海博迅公司产品；
电泳仪、SDS-PAGE电泳槽、Western-blot膜转印装置为北京六一公司产品；
细胞超声波粉碎机为宁波新芝生物有限公司产品。
除上述列出内容外，本发明未提及的部分均采用现有技术。
实施例1ALV-A/B多表位基因的筛选合成
查找NCBI上发表的ALV-A/B囊膜基因序列，运用生物信息学方法分析获得囊膜抗原表 位22段，筛选出代表近几年中国流行毒株囊膜抗原表位基因序列，采用编码甘氨酸、丝氨酸 密码子进行串联，获得重组囊膜基因序列1148bp，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。所述基 因序列5’端含NcoⅠ酶切位点，3’端含XhoⅠ酶切位点。
上述基因序列由上海生工生物工程有限公司合成，并由其进一步将合成产物cENV利用 常规工艺连接至pUC57载体。
合成产物测序，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；
将pET30a和上述连接了目的基因的pUC-57克隆载体分别用限制性内切酶NcoⅠ和Xho Ⅰ在37℃水浴条件下进行双酶切60min，用1％琼脂糖凝胶电泳后按照胶回收试剂盒说明书 的要求分别回收大片段和目的基因片段；
双酶切结果如图1，
将上述获得的目标物22℃过夜连接，其中连接体系为:pET30a载体0.5μl，cENV基因 片段1μl，ddH2O 20μl，T4DNA连接酶1μl，10×Green Buffer 2.5μl，总体积共25μl， 获得连接产物pET30a-cENV重组质粒。
将连接产物pET30a-cENV重组质粒按照常规方法转入0.1％CaCl2制备的感受态细菌BL21 中，涂布于含有卡那霉素的LB平板中，37℃过夜培养，次日挑取单菌落，摇菌，提取质粒进 行双酶切鉴定后送去测序，确认其中具有如SEQ ID NO.1所示的序列，可见获得的重组囊膜 基因1148bp的片段已经成功克隆入pET30a-cENV重组质粒中。
实施例2重组囊膜蛋白的表达和纯化
将测序后含有重组质粒的阳性BL21菌接种于含卡那霉素(终浓度为10μg/ml)的LB液体 培养基中(市购常规培养基，其中含有1％(w/v)Tryptone，0.5％(w/v)Yeast Extract，1％(w/v) NaCl，0.1mg/ml Kanamycin)，37℃振荡(200rpm)，培养至OD600＝1.0，加入浓度为500mMol 的IPTG至整个培养基中IPTG的终浓度为1mmol/L，37℃继续培养4h，同时设未诱导的重组 质粒转化BL21菌作为对照。
经SDS-PAGE分析显示，检测步骤如下：收集培养的工程菌菌液，5000rpm，离心5min， 弃上清，沉淀利用标准的PBS重悬获得重悬液；按照100ml初始培养基加入标准PBS 3ml的 比例，向沉淀中加入标准的PBS获得重悬液。重悬后分装与5ml离心管中每管3ml。将离心 管置于冰水混合物的烧杯内，用超声破碎仪超声破菌，120W，工作1s，间歇2s，超声90个 循环，重复一次；将超声破菌液转入50ml离心管中，配平，放入高速冷却离心机中，8000rpm， 4℃，离心10min，然后用SDS-PAGE电泳检测；结果上清中无蛋白(未显示)，蛋白存在于沉 淀中，说明重组蛋白His-cENV以包涵体形式表达，如图2所示，目的蛋白大小约为33KD。
重组蛋白的纯化步骤如下：
将上述离心获得的沉淀用9倍体积的洗涤液I重悬沉淀，静置5min后，8000rpm，4℃， 15min，弃上清。用9倍体积的洗涤液II重悬沉淀，静置5min后，8000rpm，4℃，15min弃 上清，保留沉淀。用9倍体积的洗涤液III重悬沉淀，静置5min后，8000rpm，4℃，15min， 弃上清，保留沉淀。按100ml菌液加4-10ml溶解液，4℃过夜。8000rpm，4℃，15min。取上 清，即为纯化蛋白。
包涵体纯化所述试剂配制方法：
(1)细菌重悬液(250ml):PBS(NaCl 2g,KCl 0.05g,Na2HPO40.36g KH2PO40.06g),1 mmol/L EDTA.
(3)溶液I(500ml)：500mmol/L Tris-Cl(pH＝6.0)，50mmol/L NaCl，50mmol/L EDTA
(3)溶液II(250ml)：溶液I，1M尿素
(4)溶液III(250ml)：溶液I，2M尿素
(5)包涵体溶解液(250ml)：溶液I，8M尿素
SDS-PAGE法与Western Blot法检测纯化后的蛋白(图2和3所示)。得到的蛋白经过 Bradford法测定蛋白含量，2ml离心管分装-80℃保存备用。
上述使用的SDS-PAGE法为常规方法，未提及的试剂为常规方法规定使用的试剂，其具 体操作步骤如下：
1)将玻璃板洗干净，用夹子固定，垂直放置，配置12％分离胶，快速注入到两玻璃板之 间，胶上部加蒸馏水封口，以保持胶面平整。待分离胶凝固后，倒去分离胶表面的蒸馏水， 用滤纸吸去残留水。注入浓缩胶，快速插入梳子，并注意防止气泡的产生。
2)取纯化后的重组蛋白加入15-20μl 4×SDS上样buffer，煮沸10min。
3)往电泳槽加入1×Tris-甘氨酸缓冲液，待浓缩胶凝固，小心拔掉梳子，用缓冲液冲 洗加样孔，用微量进样器上样，20μl/孔，正确连接电泳槽正负极，打开电源。120V电压电 泳，电泳至溴酚蓝到达胶的底部时停止电泳。
4)染色：取下凝胶，用蒸馏水冲洗，放入考马斯亮蓝染色液中，染色4h以上。
5)脱色：将凝胶放入脱色液中，置于摇床上脱色，期间更换3次以上脱色液，待凝胶 蓝色背景全部脱去停止，将凝胶放入蒸馏水中终止脱色。拍照保存，如图2所示，出现了大 小约为42KD的目的重组蛋白条带。
6)剪一张与Western Blot凝胶大小相同的NC膜，用去离子水浸透，同时将与凝胶大 小相同的两张滤纸及纤维垫用转印缓冲液浸透。
7)按三明治法安装转印装置，即负极夹-纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫-正极 夹，使NC膜位于转印的正极面，凝胶位于负极面，其间无任何气泡间隙。将转印装置放入转 移电泳仪中，加入转移缓冲液，140mA电泳2h。
8)转印结束后，将转移后的NC膜用去离子水漂洗一遍，将NC膜浸泡于封闭液中，4℃ 封闭过夜。
9)用PBST洗涤NC膜三遍，每次10min。
10)使用His标签抗体为一抗，NC膜与一抗37℃反应1h，用PBST洗膜三次，10min/ 次。
11)NC膜置于HRP标记的羊抗鼠IgG中，37℃反应1h，用PBST洗膜三次，10min/次。
12)使用DAB显色试剂盒避光显色；此时应密切观察显色过程，并在较浅本底且达到适 当显色强度时流水终止显色。拍照保存，如图3所示，出现了大小约为42KD的目的重组蛋白 条带。
实施例3重组蛋白的活性检测
使用上述纯化得到的His-cENV蛋白包被ELISA板，使用酶联免疫吸附试验检测该蛋白 的生物学活性。以His标签抗体以及IDEXX检测试剂盒检测为阳性的鸡血清为阳性对照，健 康SPF鸡血清为阴性对照，HRP标记羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgG酶标二抗按说明书使用。结果显 示阳性对照与阴性对照的OD值比值大于2.1，说明该蛋白有良好的生物学活性和抗原性。
ELISA具体步骤如下：
1)包被：取纯化的重组蛋白，以生理盐水稀释至最佳浓度，包被反应板，100μl/孔， 4℃过夜。
2)洗涤：甩去酶标板中的包被液，用PBST(PBS，0.05％Tween-20)加满各孔，摇床震 荡3min，弃去PBST，洗涤3次，3min/次，拍干。
3)封闭：各孔加入封闭液(3％脱脂乳)，350μl/孔，置37℃培养箱孵育0.5h，洗涤3 次，3min/次，拍干。
4)加样：将待待检血清按梯度稀释后加入包被板，100μl/孔，同时设立阴阳性血清对 照。置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干。
5)用封闭液将HRP标记羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgG酶标二抗按1:5000稀释，100μl/孔， 置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干。
6)显色：使用TMB单组份显色试剂盒(TIANGEN公司产品)按100μl/孔加入包被板， 37℃条件下避光显色20min加终止液，2M H2SO4终止显色。
7)用酶联免疫检测仪测其在波长450nm检测各个孔的OD值，阴性对照OD450值为N， 阳性对照OD450值为P。若P/N>2.1判为阳性。
实施例4抗A/B亚群禽白血病病毒感染表位疫苗的制备
1)从东岳种禽有限公司购买1日龄海兰褐雏鸡50只，隔离罩条件下分组饲养，分别采 集血清及棉拭子，使用IDEXX试剂盒检测ALV-A/B抗体和ALV抗原均为阴性；
其中所述的分组为空白对照组—O组10只，免疫His-cENV组—1组20只，免疫His-cENV +弗氏佐剂组—2组20只。
2)将上述获得的纯化蛋白进行浓度测定，当测定浓度达到7.6mg/ml后，即可使用PBS 将其稀释至1mg/ml，将稀释后的蛋白溶液与弗氏佐剂按照体积比1:1的比例配制，在振荡器 上混匀后用1ml的注射器分装，每管0.2ml；
其中所述的1mg/ml的重组蛋白溶液用pH为7.4，1×PBS缓冲液稀释获得的；
7日龄通过肌肉注射的方式对腿肌进行多点免疫，免疫组每只鸡免疫蛋白0.1g，对照组 注射相同剂量灭菌PBS，两周后加强免疫一次。
3)抗体消长规律监测，首次免疫后10天、二免10天后每周采集血清测定抗体效价；
其中所述的抗体效价测定，主要将待检血清以2倍倍比稀释，其他操作步骤同ELISA检 测重组蛋白活性过程。
实施例5体外病毒中和效果检测
病毒中和试验例1
发明人采用加强免疫制备的高效价血清进行病毒中和实验；
ALV-A/B SDAU09C1毒株是2009年3月从我国引进的肉用型祖代鸡中分离到的一株纯的 A/B亚群禽白血病毒株，背景清晰；
实验前将血清样品56℃，30min灭活，除去非特异性物质，将ALV-A/B SDAU09C1病毒 液用无菌的DMEM培养液稀释至1TCID50/0.1ml、10TCID50/0.1ml、100TCID50/0.1ml，取250μl 稀释的病毒液与等量的灭活血清充分混匀后37℃孵育1小时，接种于长满单层DF-1细胞的 24孔板中，每孔200μl，并设立只加病毒液和只加血清的对照，接种1小时后换含1％肽牛血 清的DMEM培养液维持7天，取细胞上清用ALV抗原检测试剂盒检测上清中病毒含量，结果显 示100TCID50/0.1ml组、病毒液对照组为阳性，其余为阴性，并且100TCID50/0.1ml组阳性 值明显低于病毒液对照组，说明明重组蛋白His-cENV联合弗氏佐剂制备的表位疫苗诱导机体 产生的抗体能够在体外条件下与ALV-A/B SDAU09C1毒株发生中和反应，且效果显著，证明本 发明所提供的表位疫苗能够保护鸡群抵抗A/B亚群禽白血病的感染。
病毒中和试验例2
ALV-A/B SDAU09C2毒株是2009年从山东地方品系芦花鸡中分离到的一株纯的A/B亚群 禽白血病毒株，背景清晰；
发明人采用试验例1相同方法进行病毒中和实验，操作过程一致，结果显示 100TCID50/0.1ml组、病毒液对照组为阳性，其余为阴性，并且100TCID50/0.1ml组阳性值 明显低于病毒液对照组，说明明重组蛋白His-cENV联合弗氏佐剂制备的表位疫苗诱导机体产 生的抗体能够在体外条件下与ALV-A/B SDAU09C2毒株发生中和反应，且效果显著，证明本发 明所提供的表位疫苗能够保护鸡群抵抗A/B亚群禽白血病的感染。
实施例6体内试验检测
重组蛋白联合弗氏佐剂免疫7日龄种禽雏鸡，19日龄加强免疫一次，10天后进行攻毒 观察免疫保护效果，同时设ALV-A/B感染阳性对照组及阴性对照组。
饲养至14周龄，全部剖杀，期间每周进行血液学、组织病理学观察以及病原学检测抗 病毒效果；
结果显示免疫保护组鸡群生长良好，血液各项指标未见明显变化，ALV抗原检测阴性， 无排毒现象，病理组织学检测未见组织损伤及炎症反应。而ALV-A/B阳性对照组出现严重的 病毒血症，肝脏及肾脏等重要脏器出现明显的损伤和炎症。实验证明该表位疫苗可以保护鸡 群抵抗ALV-A/B的感染。