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1、(10)授权公告号 CN 101558742 B (45)授权公告日 2012.11.21 CN 101558742 B *CN101558742B* (21)申请号 200910098398.6 (22)申请日 2009.05.12 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 中国林业科学研究院亚热带林业 研究所 地址 311400 浙江省杭州市富阳大桥路 73 号 (72)发明人 李纪元 范正琪 李辛雷 田敏 (74)专利代理机构 杭州九洲专利事务所有限公 司 33101 代理人 陈继亮 Ponsamuel J,et al.Somatic embryogenesis and p。
2、lant regeneration from the immature cotyledonary tissues of cultivated tea (Camellia sinensis (L).O.Kuntze).Plant Cell Reports .1996, 第 16 卷第 210-214 页 . 蔡汉权 . 山茶芽培养诱导愈伤组织及植株再 生 .韩山师范学院学报 .1996,( 第 3 期 ), 第 105-108 页 . Akula A,et al.Direct somatic embryogenesis in a selected tea clone,TRI-2025 (Came。
3、llia sinensis(L.) O.Kuntze) from nodal explants.Plant Cell Reports .1998, 第 17 卷第 804-809 页 . Elangomathavan R,et al.High frequency in vitro propagation of Kidney Tea Plant. Plant Cell,Tissue and Organ Culture .2003, 第 72 卷第 83-86 页 . 张国彬 . 山茶组织培养的初步研究 .中国 优秀博硕士学位论文全文数据库 （硕士） 基础科学 辑 .2004,( 第 3 期 ),。
4、A006-133. 董慧慧等 . 耐冬山茶愈伤组织诱导研究 . 福 建林业科技 .2007, 第 35 卷 ( 第 3 期 ), 第 135-138， 154 页 . 秦斐斐等 . 山茶茎尖培养与快速繁殖的研 究 . 青岛农业大学学报 （自然科学版） .2007, 第 24 卷 ( 第 3 期 ), 第 196-198 页 . (54) 发明名称 一种茶花愈伤组织再生植株的方法 (57) 摘要 本发明主要涉及一种茶花愈伤组织再生植 株的方法， 按以下步骤进行 ： 剥去山茶花果实种 子的内外种皮， 接种在 1/2MS 培养基上 ； 无菌 苗长至 3 厘米以上时， 将小植株幼嫩叶片和茎 段接种在愈。
5、伤组织诱导培养基上， 愈伤组织诱 导 培 养 基 为 MS+0.5mgL-16-BA+1.0mgL-12， 4-D ； 愈伤组织长至直径为 1 厘米大小时， 转移 至愈伤组织分化培养基上， 愈伤组织分化培养 基 为 MS+mgL-16-BA20+0.1mgL-1IBA+mgL-1K T0.1 ； 不定芽长至 0.5cm 时进行分离， 壮芽培 养基为 MS+0.2mgL-16-BA+0.05mgL-1NAA ； 当 芽 条 长 至 4-5cm 时，切 掉 芽 条 基 部，以 1000gL-1的 IBA 浸泡芽条的基部， 然后接种在 MW+0.2mgL-1IBA+0.2mgL-1NAA 的培养基上。
6、。本 发明的有益效果是 ： 本发明培养基配方简单， 操 作工艺简便， 培养时间短， 再生频率高， 扩繁系数 大， 有利于大规模生产珍稀山茶花植株及实现外 源基因的遗传转化。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李子东 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 2 页 1/1 页 2 1. 一种茶花愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于 ： 该方法按以下步骤进行 ： (1) 将山茶花果实用自来水冲洗干净， 再用洗衣粉浸泡 10 分钟， 自来水冲洗 ； 然后转移 到无菌超净台上去除果皮后， 用体积比为75的乙。
7、醇表面消毒30秒， 无菌水冲洗2遍， 用重 量比为 0.1的 HgCl2中浸泡 15-20 分钟， 无菌水冲洗 5-6 遍 ； (2) 剥去种子的内外种皮， 接种在 1/2MS 培养基上 ； (3) 无菌苗长至 3 厘米以上时， 将小植株幼嫩叶片和茎段接种在愈伤组织诱导培养基 上， 愈伤组织诱导培养基为 MS+0.5mgL-16-BA+1.0mgL-12， 4-D ； (4) 愈伤组织长至直径为 1 厘米大小时， 转移至愈伤组织分化培养基上， 愈伤组织分化 培养基为 MS+20mgL-16-BA+0.1mgL-1IBA+0.1mgL-1KT ； (5) 不定芽长至 0.5cm 时进行分离， 壮。
8、芽培养基为 MS+0.2mgL-16-BA+0.05mgL-1NAA ； (6) 当芽条长至 4-5cm 时， 切掉芽条基部， 以 1000gL-1的 IBA 浸泡芽条的基部， 然后 接种在 MW+0.2mgL-1IBA+0.2mgL-1NAA 的培养基上。 2. 根据权利要求 1 所述的茶花愈伤组织再生植株的方法， 其特征在于 ： 所述的山茶花 果实为 9 月份采集的成熟果实。 权 利 要 求 书 CN 101558742 B 2 1/2 页 3 一种茶花愈伤组织再生植株的方法 技术领域 0001 本发明涉及山茶花组织培养方法， 属于生物技术领域， 是一种茶花愈伤组织再生 植株的方法。 背景。
9、技术 0002 山茶花是我国的特色名贵花卉， 也是世界闻名的观赏木本植物。茶花是园林绿化 的重要材料， 具有花色美， 花期长， 叶片亮绿， 树冠多姿， 以及在高大树冠下能良好生长的习 性， 被广泛利用于公园绿地、 自然风景区和名胜古迹。山茶花亦是盆栽的佳品， 某些矮生的 灌木型品种， 常被作为盆栽应用。 除了观赏价值外， 山茶花还具有很高的经济价值， 其花、 根 均可入药， 果实可榨油， 金花茶的叶可代茶饮， 辅助治疗高血压， 花可治便血， 花的红、 黄色 浸提液可作食用色素。 0003 为保持山茶花品种亲本的优良性状， 茶花的繁殖通常不采用实生籽播苗方式， 况 且玫瑰重瓣、 完全重瓣型等山茶。
10、花品种因雌、 雄蕊完全退化而不能结实。 采用扦插和嫁接方 式， 对于一些稀有的山茶花品种来说， 其繁殖系数较低， 难以进行规模化生产， 实现产业化 目的。 0004 利用愈伤组织途径再生不定芽可获得大量的无性分株， 是茶花快速繁殖及遗传转 化的必要手段。在山茶花中诱导愈伤组织常用的外植体是叶和茎段， 也有少数用花瓣和小 孢子的。 Pedroso等(1993)以50龄红山茶成年树的叶片为外植体， 发现在叶柄和主叶脉处 易形成愈伤组织。Shults 等 (1996) 以红山茶的花瓣为外植体， 在含 BA 和 NAA 的培养基上 愈伤组织有较好的生长， 但未获得其再生植株。隆振雄 (1981) 将油。
11、茶的花粉作为外植体， 可在合适的培养基上获得较高愈伤组织诱导频率， 并且获得了绿芽点和根， 但因污染而未 能获得完整的再生植株。 0005 目前还未见从茶花愈伤组织中获得不定芽的报道， 也未见专利申请。因此本发明 为满足稀有茶花品种的市场需要提供了一条有效的途径， 同时也为茶花分子育种奠定基 础。 发明内容 0006 本发明的目的是针对山茶花愈伤组织诱导和再生植株十分困难技术瓶颈， 提供一 种茶花愈伤组织再生植株的方法。 0007 本发明目的通过以下技术方案来实现 ： 这种茶花愈伤组织再生植株的方法， 该方 法按以下步骤进行 ： 0008 (1) 将山茶花果实用自来水冲洗干净， 再用洗衣粉浸泡。
12、 10 分钟， 自来水冲洗 ； 然后 转移到无菌超净台上去除果皮后， 用体积比为75的乙醇表面消毒30秒， 无菌水冲洗2遍， 用重量比为 0.1的 HgCl2中浸泡 15-20 分钟， 无菌水冲洗 5-6 遍 ； 0009 (2) 剥去种子的内外种皮， 接种在 1/2MS 培养基上 ； 0010 (3) 无菌苗长至 3 厘米以上时， 将小植株幼嫩叶片和茎段接种在愈伤组织诱导培 说 明 书 CN 101558742 B 3 2/2 页 4 养基上， 愈伤组织诱导培养基为 MS+0.5mgL-1-BA+1.0mgL-12， 4-D ； 0011 (4) 愈伤组织长至直径为 1 厘米大小时， 转移至。
13、愈伤组织分化培养基上， 愈伤组织 分化培养基为 MS+mgL-16-BA20+0.1mgL-1IBA+mgL-1KT0.1 ； 0012 (5) 不定芽长至 0.5cm 时进行分离， 壮芽培养基为 MS+0.2mg L-16-BA+0.05mg L-1NAA ； 0013 (6) 当芽条长至 4-5cm 时， 切掉芽条基部， 以 1000gL-1的 IBA 浸泡芽条的基部， 然后接种在 MW+0.2mgL-1IBA+0.2mgL-1NAA 的培养基上。 0014 作为优选， 所述的山茶花果实为 9 月份采集的成熟果实。 0015 作为优选， 所述的培养条件为培养温度为252， 光照光强为250。
14、03000Lx， 光 照时间为 12h/d。 0016 本发明的有益效果是 ： 目前还没有从山茶花愈伤组织诱导不定芽和植株再生的报 道。本发明培养基配方简单， 操作工艺简便， 培养时间短， 再生频率高， 扩繁系数大， 有利于 大规模生产珍稀山茶花植株及实现外源基因的遗传转化。 具体实施方式 0017 通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明， 但本发明的内容并不局限于此。 0018 本发明所述的这种茶花愈伤组织再生植株的方法， 材料为浙江红山茶 9 月成熟果 实。将采集的果实用自来水冲洗干净， 再用洗衣粉浸泡 10 分钟， 自来水冲洗。然后转移到 无菌超净台上去除果皮后， 用体积比为75乙醇表。
15、面消毒30秒， 无菌水冲洗2遍， 重量比为 0.1的 HgCl2中浸泡 15-20 分钟， 无菌水冲洗 5-6 遍。剥去内外种皮后接种在 1/2MS 培养 基上， 培养温度为252， 光照光强为25003000Lx， 光照时间为12h/d， 以下的培养条件 都相同。 0019 培养 2 周后实生苗长至 3 厘米高， 将小植株幼嫩叶片和茎段接种在愈伤组织诱导 培养基上， 愈伤组织诱导培养基为 MS+0.5mgL-16-BA+1.0mgL-12， 4-D。培养一周后， 叶切 块开始皱起， 半月后边缘有少量愈伤组织长出， 1 个月后愈伤组织直径达 1 厘米左右。 0020 愈伤组织在分化培养基培养约。
16、半月后形成颗粒状小突起， 即生长点， 再经培养后 分化成不定芽， 一块愈伤组织上可形成大量不定芽， 在切除较大的芽后， 还有不定芽不断的 分化出来， 最佳的培养基是 MS+20mgL-16-BA+0.1mgL-1IBA+0.1mgL-1KT。 0021 培养半月后， 不定芽长至0.5cm即可分离， 在壮芽培养基MS+0.2mg L-16-BA+0.05mg L-1NAA 上培养1个月后芽条可长至4-5cm， 切掉芽条基部， 以1000gL-1的IBA浸泡芽条的基部， 然后接种 在MW+0.2mgL-1IBA+0.2mgL-1NAA的培养基上， 培养1个月后根系较发达， 生根率达100。 0022 除上述实施例外， 本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形 成的技术方案， 均落在本发明要求的保护范围。 说 明 书 CN 101558742 B 4 。