技术领域
本发明属于仿生生物学、生物医用材料、组织工程支架及第三类植入医疗器 械材料的制备技术领域，尤其涉及一种Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制备方法。
背景技术
Ι型胶原(TypeΙcollagen)是结缔组织(如骨、角膜、腱、韧带和皮肤等) 中细胞外基质的主要结构蛋白。这种结构蛋白在结缔组织中以高度有序的方式排 列，不同结缔组织中胶原纤维排列都具有液晶态的几何结构形式。结缔组织的液 晶态形式不但与细胞的黏附、伸展、生长、增殖、定向分化相互影响，也强烈地 控制着结缔组织的生物力学及其它生物物理性质。胶原纤维是构成眼角膜的主要 组分，在角膜组织中胶原纤维平行排列，形成厚度均匀的层状结构，每一层的斜 断面排列成弧形或抛物线的圆形，相邻层之间的扭转结构显示出胆甾相-向列相液 晶的性状。角膜内的这种胶原纤维排列，形成了衍射光栅单元，使角膜具有光散 射和透光性，因此角膜的液晶结构是动物保持视觉功能的必要条件；在组成骨的 骨单位中，胶原纤维排列为同轴的圆柱体结构，在每个圆柱体中胶原纤维平行排 列，相邻圆柱体中的胶原纤维以一个不变的角度周期性旋转。这种周期性旋转排 列方式，具有胆甾相液晶的几何结构，与无机物一起赋予动物骨骼生物力学特性； 类似的情况还有，腱和韧带中胶原原纤维为单轴取向排列，且胶原纤维束之间呈 二维弯曲模式，恰似于预胆甾相液晶的波状模式；真皮中对齐的胶原束，形成复 杂的各向同性三维网状结构等等。因此，在结缔组织中各种生物物理性能的体现， 并不直接是胶原分子，而是骨、角膜、腱、韧带和皮肤中Ⅰ型胶原分子组装成的 类似六边形晶体原纤维。组织的生物力学等性能，随胶原蛋白纤维的量和结构的 变化而不同。在特定的结构部位由于组织各自的功能要求不同，胶原蛋白纤维(胶 原纤维束)也以不同的方式排列。因此，在结缔组织三维空间中胶原纤维的大小、 长短和排列方向等决定结缔组织结构，这是胶原蛋白的重要物理性能，为活组织 提供稳定性和独一无二的生物物理特征。如真皮的弹性性能，肌腱的抗拉伸和剪 切，角膜的透明，骨抵抗负载的各向异性。多样性源于原纤维大小、排列的方向、 远程起伏的程度或邻近原纤维之间的平均角，也就是胶原纤维的排列性状(超分 子液晶态)决定了结缔组织组织的生物物理结构与性能。生物体内许多器官和组 织都具有液晶特征，生物体内分子的有序化是维持人体生命的重要因素，液晶结 构与生物体的生长发育、肌体的新陈代谢、细胞的能量转换、信息传递、物质传 输等密切相关。现代医学研究表明，动脉弼样硬化、胆结石、衰老、镰状血球贪 血症微循环障碍等疾病，均与人体某些器官、组织偏离正常的液晶态行为。因此， 在疾病模型、仿生学、再生医学及组织工程支架材料研究及产品研究中，组织织 态结构仿生的重要一环。体外酸性胶原液滴的脱水研究表明，在高浓度的条件下， 胶原分子具有液晶组装特性。
现在已有的制备液晶态胶原的方法为，连续注射酸性胶原溶液到玻璃微室中， 并慢慢蒸发溶剂，此方法制备的液晶态胶原具有不同的浓度梯度，耗时较长，并 且制备的胶原液晶结构不均匀，很难获得三维状态的凝胶状态液晶。由于制备方 法的限制，胶原液晶材料在仿生生物学、生物医学材料、组织工程支架及第三类 医疗器械等领域的应用研究较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制备方法，旨在 解决现在制备液晶态胶原的方法制备的液晶态胶原具有不同的浓度梯度，耗时较 长，并且制备的胶原液晶结构不均匀，很难获得三维状态的凝胶状态液晶，在仿 生生物学、生物医学材料、组织工程支架及第三类医疗器械等领域的应用较少的 问题。
本发明是这样实现的，一种Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制备方法所述Ι 型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制备方法包括：
低温下在切向流系统中，将酸性无端肽Ι型胶原稀溶液定向剪切与浓缩，直 到浓度为原稀溶液浓度的1～3倍，黏度不再变化，酸性Ι型胶原稀溶液的pH为 2～4；
浓缩后的酸性胶原流体置于聚乙二醇溶液中，进行透析脱水，至浓度增加 10～40倍，得到高粘性液晶态胶原流体；聚乙二醇溶液的质量/体积浓度为20％～ 50％；
将高粘性胶原液晶态流体置于碱性气体发生器中，密封放置10分钟～24小 时，孵化调节环境温度为4℃-50℃，通过酸碱性环境调控微纤维进一步自组装和 纤维分支交联，获得Ι型胶原三维溶致液晶凝胶。
进一步，所述切向流系统中蠕动泵转速为60rpm～200rpm；
所述聚乙二醇分子量为2KDa～20KDa。
进一步，所述Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制备方法包括以下步骤：
酸性胶原溶液的定向剪切和浓缩，将pH为2的酸性无端肽Ι型胶原稀溶液 用切向流系统进行定向剪切，蠕动泵转速为60rpm，并浓缩至浓度为原稀溶液浓 度的1倍；
酸性高浓度液晶态胶原的制备，将定向剪切后的酸性胶原溶液置于质量/体积 浓度为20％的酸性聚乙二醇溶液中进行透析，聚乙二醇分子量为2KDa，浓缩至 浓度增加10倍，得到高粘性液晶态胶原流体；
采用得到高粘性液晶态胶原流体，将高粘性液晶态胶原置于氨水发生器中， 密封，在室温条件下放置1小时制备得到的液晶态胶原凝胶。
进一步，所述Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制备方法包括以下步骤：
酸性胶原溶液的定向剪切和浓缩，将pH为4的酸性Ι型胶原稀溶液用切向 流系统进行定向剪切，蠕动泵转速为200rpm，并浓缩至浓度为原稀溶液浓度的3 倍；
将定向剪切后的酸性胶原溶液置于质量/体积浓度为50％的酸性聚乙二醇溶 液中进行透析，聚乙二醇分子量为20KDa，浓缩至浓度增加30倍，得到高粘性 液晶态胶原流体；
采用得到高粘性液晶态胶原流体，将高粘性液晶态胶原流体置于氨水发生器 中，密封，在室温条件下放置6小时制备得到的液晶态胶原凝胶。
进一步，所述Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制备方法包括以下步骤：
酸性胶原溶液的定向剪切和浓缩，将pH为3的酸性Ι型胶原稀溶液用切向 流系统进行定向剪切，蠕动泵转速为150rpm，并浓缩至浓度为原稀溶液浓度的2 倍；
酸性高浓度液晶态胶原流体的制备，将定向剪切后的酸性胶原溶液置于质量 /体积浓度为40％的酸性聚乙二醇溶液中进行透析，聚乙二醇分子量为10KDa， 浓缩至浓度增加40倍，得到高粘性液晶态胶原流体；
采用制备得到高粘性液晶态胶原流体，将上述高粘性液晶态胶原置于氨水发 生器中，密封，在室温条件下放置24小时制备得到的液晶态胶原凝胶。
进一步，所述Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制备方法包括以下步骤：
酸性胶原溶液的定向剪切和浓缩，将pH为2.5的酸性Ι型胶原稀溶液用切向 流系统进行定向剪切，蠕动泵转速为90rpm，并浓缩至浓度为原稀溶液浓度的2.5 倍；
酸性高浓度液晶态胶原流体的制备，将定向剪切后的酸性胶原溶液置于质量 /体积浓度为30％的酸性聚乙二醇溶液中进行透析，聚乙二醇分子量为8KDa，浓 缩至浓度增加15倍，得到高粘性液晶态胶原流体；
采用制备得到高粘性液晶态胶原流体，将高粘性液晶态胶原流体置于氨水发 生器中，密封，在室温条件下放置30分钟制备得到的液晶态胶原凝胶。
进一步，所述Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制备方法包括以下步骤：
酸性胶原溶液的定向剪切和浓缩，将pH为4的酸性Ι型胶原稀溶液用切向 流系统进行定向剪切，蠕动泵转速为120rpm，并浓缩至浓度为原稀溶液浓度的2 倍；
酸性高浓度液晶态胶原流体的制备，将定向剪切后的酸性胶原溶液置于质量 /体积浓度为20％的酸性聚乙二醇溶液中进行透析，聚乙二醇分子量为15KDa， 浓缩至浓度增加35倍，得到高粘性液晶态胶原流体；
采用制备得到高粘性液晶态胶原流体，将高粘性液晶态胶原流体置于氨水发 生器中，密封，在室温条件下放置12小时制备得到的液晶态胶原凝胶。
本发明的另一目的在于提供一种使用所述Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制 备方法制备的三维凝胶的生物医用材料。
本发明的另一目的在于提供一种使用所述Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制 备方法制备的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ胶原的溶致液晶流体和三维凝胶。
本发明提供的Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制备方法，其产物用作骨、软 骨、角膜、腱、韧带和皮肤等组织研究和应用的生物医学材料、组织工程支架、 医疗器械或某些结缔组织疾病模型。本发明的制备过程无毒、无污染，制备得到 的Ι型胶原溶致液晶流体及凝胶材料耗时短、结构均匀、有序度高。本发明建立 了一套操作简便、结构均匀、有序度高的三维胶原液晶的制备方法，有着十分重 要的意义。
附图说明
图1是本发明实施例提供的Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的酸性胶原溶液的粘度随切向流时间的变化曲线图。
图3是本发明实施例提供的人眼观察不同程度超分子自主装凝胶的数码照片 图。
图4是本发明实施例提供的Ι型胶原三维溶致液晶的偏振光显微镜图；
图中：A—G表示不同质量分数的胶原样品；
百分比：表示胶原的质量分数，即超净台风吹干的胶原质量(在50-70℃下 恒重称量)/总质量×100％；
×50、×100、×200、×500：偏振光显微镜的放大倍数分别为50倍、100倍、 200倍、500倍。
图5是本发明实施例提供的Ι型胶原三维液晶态凝胶的扫描电子显微镜图。
图中：干燥方法：临界点干燥；1K、5K、10K、20K：表示放大倍数分别为 1000倍，5000倍、10000倍、20000倍。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释 本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例的Ι型胶原蛋白溶致液晶三维凝胶制备方法包括 以下步骤：
S101：低温下在切向流系统中，将酸性无端肽Ι型胶原稀溶液定向剪切与浓 缩，直到浓度为原稀溶液浓度的1～3倍，黏度不再变化；
S102：浓缩后的酸性胶原流体置于酸性脱水剂(聚乙二醇溶液)中，进行透 析脱水，至浓度增加10～40倍，得到高粘性液晶态胶原流体；
S103：将高粘性胶原液晶态流体置于碱性气体发生器中，密封放置数分钟到 数小时，在一定温度条件下，通过酸碱性环境调控微纤维进一步自组装和纤维分 支交联，获得Ι型胶原三维溶致液晶凝胶。
酸性Ι型胶原稀溶液的pH为2～4。
切向流系统中蠕动泵转速为60～200rpm。
Ι所使用的脱水剂(聚乙二醇)分子量为2～20KDa。
所使用的(聚乙二醇)酸性脱水剂溶液的质量/体积浓度为20％～50％(W/V)。
所述方法制备得到的Ι型胶原溶致液晶流体用于仿生生物学、生物医用材料、 组织工程支架、病理及细胞培养等研究。
密封放置10分钟～24小时，调控微纤维进一步自组装和纤维分支交联，获 得Ι型胶原三维溶致液晶凝胶。
密封放置孵化调节环境温度为4-50℃，调控微纤维进一步自组装和纤维分支 交联，获得Ι型胶原三维溶致液晶凝胶。
密封放置控制酸碱性环境，调控微纤维进一步自组装和纤维分支交联，获得 Ι型胶原三维溶致液晶凝胶。
所述方法制备得到的液晶态胶原凝胶用于生物医用材料、组织工程支架、病 理研究。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理做进一步的说明。
实施例1
1、Ι型胶原三维溶致液晶流体的制备方法
(1)酸性胶原溶液的定向剪切和浓缩
将pH为2的酸性无端肽Ι型胶原稀溶液用切向流系统进行定向剪切，蠕动 泵转速为60rpm，并浓缩至浓度为原稀溶液浓度的1倍；
(2)酸性高浓度液晶态胶原的制备
将上述定向剪切后的酸性胶原溶液置于质量/体积浓度为20％的酸性聚乙二 醇溶液中进行透析，聚乙二醇分子量为2KDa，浓缩至浓度增加10倍，得到高粘 性液晶态胶原流体。
2、液晶态胶原凝胶的制备方法：
(1)采用上述Ι型胶原溶致液晶流体的制备方法制备得到高粘性液晶态胶原 流体。
(2)液晶态胶原凝胶的制备方法
将上述高粘性液晶态胶原置于氨水发生器中，密封，在室温条件下放置1小 时制备得到的液晶态胶原凝胶。
实施例2
1、Ι型胶原彩色溶致液晶流体的制备方法
(1)酸性胶原溶液的定向剪切和浓缩
将pH为4的酸性Ι型胶原稀溶液用切向流系统进行定向剪切，蠕动泵转速 为200rpm，并浓缩至浓度为原稀溶液浓度的3倍；
(2)酸性高浓度液晶态胶原流体的制备
将上述定向剪切后的酸性胶原溶液置于质量/体积浓度为50％的酸性聚乙二 醇溶液中进行透析，聚乙二醇分子量为20KDa，浓缩至浓度增加30倍，得到高 粘性液晶态胶原流体。
2、液晶态胶原凝胶的制备方法：
(1)采用上述Ι型胶原溶致液晶流体的制备方法制备得到高粘性液晶态胶原 流体。
(2)液晶态胶原凝胶的制备方法
将上述高粘性液晶态胶原流体置于氨水发生器中，密封，在室温条件下放置 6小时制备得到的液晶态胶原凝胶。
实施例3
1、Ι型胶原溶致液晶流体的制备方法
(1)酸性胶原溶液的定向剪切和浓缩
将pH为3的酸性Ι型胶原稀溶液用切向流系统进行定向剪切，蠕动泵转速 为150rpm，并浓缩至浓度为原稀溶液浓度的2倍；
(2)酸性高浓度液晶态胶原流体的制备
将上述定向剪切后的酸性胶原溶液置于质量/体积浓度为40％的酸性聚乙二 醇溶液中进行透析，聚乙二醇分子量为10KDa，浓缩至浓度增加40倍，得到高 粘性液晶态胶原流体。
2、液晶态胶原凝胶的制备方法：
(1)采用上述Ι型胶原溶致液晶的制备方法制备得到高粘性液晶态胶原流体。
(2)液晶态胶原凝胶的制备方法
将上述高粘性液晶态胶原置于氨水发生器中，密封，在室温条件下放置24 小时制备得到的液晶态胶原凝胶。
实施例4
1、Ι型胶原溶致液晶流体的制备方法
(1)酸性胶原溶液的定向剪切和浓缩
将pH为2.5的酸性Ι型胶原稀溶液用切向流系统进行定向剪切，蠕动泵转速 为90rpm，并浓缩至浓度为原稀溶液浓度的2.5倍；
(2)酸性高浓度液晶态胶原流体的制备
将上述定向剪切后的酸性胶原溶液置于质量/体积浓度为30％的酸性聚乙二 醇溶液中进行透析，聚乙二醇分子量为8KDa，浓缩至浓度增加15倍，得到高粘 性液晶态胶原流体。
2、液晶态胶原凝胶的制备方法：
(1)采用上述Ι型胶原溶致液晶流体的制备方法制备得到高粘性液晶态胶原 流体。
(2)液晶态胶原凝胶的制备方法
将上述高粘性液晶态胶原流体置于氨水发生器中，密封，在室温条件下放置 30分钟制备得到的液晶态胶原凝胶。
实施例5
1、Ι型胶原溶致液晶流体的制备方法
(1)酸性胶原溶液的定向剪切和浓缩
将pH为4的酸性Ι型胶原稀溶液用切向流系统进行定向剪切，蠕动泵转速 为120rpm，并浓缩至浓度为原稀溶液浓度的2倍；
(2)酸性高浓度液晶态胶原流体的制备
将上述定向剪切后的酸性胶原溶液置于质量/体积浓度为20％的酸性聚乙二 醇溶液中进行透析，聚乙二醇分子量为15KDa，浓缩至浓度增加35倍，得到高 粘性液晶态胶原流体。
2、液晶态胶原凝胶的制备方法：
(1)采用上述Ι型胶原溶致液晶流体的制备方法制备得到高粘性液晶态胶原 流体。
(2)液晶态胶原凝胶的制备方法
将上述高粘性液晶态胶原流体置于氨水发生器中，密封，在室温条件下放置 12小时制备得到的液晶态胶原凝胶。
下面结合性能测试对本发明的应用效果做进一步的说明。
1、用数字显示粘度计测量酸性胶原溶液的粘度随切向流时间的变化。如图2 所示，切向流后，胶原溶液的粘度大大降低至不再变化。
2、肉眼观察不同程度自组装的凝胶
3、采用偏振光显微镜观察Ι型胶原三维溶致液晶。如图3所示，结果表明胶 原纤维有序排列，且出现彩色。
3、用扫描电子显微镜观察临界点干燥后的Ι型胶原三维溶致液晶凝胶。如图 4所示，结果表明液晶态胶原凝胶中胶原纤维平行排列。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范 围之内。