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1、(10)授权公告号 CN 101305785 B (45)授权公告日 2011.03.16 CN 101305785 B *CN101305785B* (21)申请号 200810029150.X (22)申请日 2008.07.01 A23L 1/202(2006.01) A23L 1/29(2006.01) (73)专利权人 华南理工大学 地址 510640 广东省广州市天河区五山路 381 号 (72)发明人 郭勇 黎金兰 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 何淑珍 CN 1985651 A,2007.06.27,1-6. CN 1986775 A,。
2、2007.06.27,1-5. CN 1986776 A,2007.06.27,1-5. 范晓丹， 等 . 产纤溶酶菌种的鉴定及纤溶 酶的分离纯化 .华南理工大学学报 （自然科学 版） .2007, 第 35 卷 ( 第 4 期 ),91-94. 王希春 . 固态发酵高溶栓活性豆豉及其 抗氧化特性的研究 .江南大学硕士学位论 文 .2007,1-45. (54) 发明名称 一种溶血栓豆豉的生产方法 (57) 摘要 本发明公开了一种溶血栓豆豉的生产方法， 包括如下步骤 ： 优质大豆浸泡， 蒸煮， 冷却后接 入种曲 ( 曲霉 )， 发酵培养 60h 72h， 制得豆豉 半成品 ； 豆豉半成品室温浸。
3、泡 5h 8h， 添加葡 萄糖 8.0 10.0 (W/W)， 灭菌， 冷却后接入 12.0 15.0 (V/W) 枯草芽孢杆菌种子液， 在 温度 30 35下发酵培养 72h 84h。本发 明结合传统豆豉生产技术进行两步固态发酵， 即 曲霉的前发酵和枯草芽孢杆菌的后发酵， 经过两 步发酵获得富含可溶性氮、 可溶性糖、 水溶性矿物 质、 游离氨基酸等营养成分以及豆豉纤溶酶、 多 肽、 大豆异黄酮等功能成分的溶血栓豆豉， 该产品 具有抗氧化、 抗血栓、 预防心血管疾病功能。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 石军 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书。
4、 1 页 说明书 4 页 CN 101305785 B1/1 页 2 1. 一种溶血栓豆豉的生产方法， 其特征在于包括如下步骤 ： (1) 大豆的前发酵 a.将大豆清洗后， 室温浸泡12h15h， 大豆与浸泡水的质量体积比为135g/mL ； b. 对上述浸泡好的大豆进行蒸煮 ； c. 将蒸煮好的大豆冷却至室温， 接入曲霉发酵培养 60h 72h ； d. 取出发酵好的大豆， 洗去豆粒表面的分生孢子和菌丝， 干燥， 制得豆豉半成品 ； (2) 大豆的后发酵 e. 将步骤 (1) 制得的豆豉半成品室温浸泡 5h 8h， 豆豉半成品与浸泡水的质量体积 比为 1 1 2g/mL ； f. 在浸泡好的。
5、豆豉半成品中添加 8.0wt 10.0wt的葡萄糖， 并灭菌 ； g.将灭菌后的豆豉半成品冷却至室温， 按每100g豆豉半成品接入1215mL枯草芽孢 杆菌种子液进行发酵培养， 发酵培养温度为 30 35， 培养时间为 72h 84h， 制得溶血 栓豆豉成品 ； 所述种子液采用如下方法制备 ： (1) 获取枯草芽孢杆菌 ： 从豆豉中筛选高产豆豉纤溶酶菌株， 于 -80下保存 ； (2) 按照 100mL 水中含有葡萄糖 1.0g、 大豆蛋白胨 1.0g、 Na2HPO40.2g、 NaH2PO40.1g、 CaCl20.02g 和 MgSO40.05g 的比例配置种子培养基， 种子培养基的 p。
6、H 值为 7.0 ； (3) 种子液制备 ： 将枯草芽孢杆菌转接至营养琼脂斜面培养基， 37恒温培养过夜， 从 斜面培养基取一环活化菌种， 接入 50mL 种子培养基中， 37， 200rpm 振荡培养 14h 16h。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 b 中大豆在 121， 0.1MPa 下蒸煮 30min 40min。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 c 中接入曲霉后对大豆进行厚层通风 培养， 24h 后进行翻曲， 总的发酵培养时间为 60h 72h。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 d 中所述干燥为在 50干燥箱中干燥 8。
7、h 10h。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于步骤 d 中还将制得的豆豉半成品于 -20 下保存。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 f 中灭菌的温度为 115， 时间为 20min。 7. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 g 中还对制得的豆豉成品进行真空冷 冻干燥 16h 18h， 粉碎， 过 60 目筛， 制得豆豉冻干粉。 权 利 要 求 书 CN 101305785 B1/4 页 3 一种溶血栓豆豉的生产方法 技术领域 0001 本发明属于食品发酵工程领域， 具体涉及一种以大豆为原料制作溶血栓豆豉的生 产方法。 背景技术 0002 栓塞。
8、性疾病严重地危害人类的生命健康， 尤其是心脑血管栓塞性疾病是危害中老 年人健康最严重而又常见的疾病之一。 治疗栓塞性疾病的有效可靠的方法是采用纤维蛋白 溶解酶或其激活剂进行的溶栓疗法， 高效、 安全的溶栓剂需求迫切。此外， 现代人们的疾病 观念已由治病为主向防病为主转变， 药食同源、 功效独特的保健食品备受人们青睐。 0003 日本专利 (JP61162184)、 (JP1180834) 和 (JP5336917) 涉及一种新型的溶栓 剂纳豆激酶 (Nattokinase， NK)， 它是从日本传统发酵食品纳豆 (Natto) 中发现的， 除 了溶栓作用外， 研究发现纳豆还具有整肠、 抗癌、 。
9、抗氧化、 预防骨质疏松等功能， 使纳豆成为 集抗血栓等多种功能于一身的保健食品。日本在纳豆的生产技术方面也进行了系统的研 究， 开发出系列纳豆保健食品， 如大和制药有限公司 (Daiwa Pharmaceutical Co.Ltd.) 开 发的纳豆激酶制品、 文翠普 - 圣特公司 (Ventrep Sante Int.) 开发的纳豆精等。 0004 豆豉是我国的传统发酵食品， 具有开胃增食， 消积化滞， 驱风散寒以及预防心血管 疾病等功效， 但豆豉在我国的消费方式仅限于调味品 ( 少数部分入药 )， 没有充分发挥豆豉 药食兼用的保健功能作用。 目前豆豉纤溶酶的固态发酵是将枯草芽孢杆菌直接接种到。
10、大豆 进行固态发酵。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷， 提供一种溶血栓豆豉的生产方 法， 该方法结合传统的豆豉生产方式， 以大豆 ( 黑豆或者黄豆 ) 为原料， 经过前发酵 ( 曲霉 发酵 ) 制得豆豉半成品， 接着以该半成品为发酵基质， 接种本实验室从豆豉中筛选得到的 高产豆豉纤溶酶的枯草芽孢杆菌， 在一定条件下进行后发酵。本发明通过如下技术方案实 现 ： 一种溶血栓豆豉的生产方法， 包括如下步骤 ： 0006 (1) 大豆的前发酵 0007 a. 将大豆清洗后， 室温浸泡 12h 15h， 大豆与浸泡水的质量体积比为 1 3 5g/mL ； 0008 b. 。
11、对上述浸泡好的大豆进行蒸煮 ； 0009 c. 将蒸煮好的大豆冷却至室温， 接入种曲 ( 曲霉 ) 发酵培养 60h 72h ； 0010 d. 取出发酵好的大豆， 洗去豆粒表面的分生孢子和菌丝， 干燥， 制得豆豉半成品 ； (2) 大豆的后发酵 0011 e. 将步骤 (1) 制得的豆豉半成品室温浸泡 5h 8h， 豆豉半成品与浸泡水的质量 体积比为为 1 1 2g/mL ； 0012 f. 在浸泡好的豆豉半成品中添加 8.0 10.0 (W/W) 的葡萄糖， 并灭菌 ； 说 明 书 CN 101305785 B2/4 页 4 0013 g.将灭菌后的豆豉半成品冷却至室温， 按每100g豆豉。
12、半成品接入1215mL枯草 芽孢杆菌种子液进行发酵培养， 发酵培养温度为 30 35， 培养时间为 72h 84h， 制得 豆豉成品。 0014 上述方法中， 步骤 b 中大豆在 121、 0.1MPa 下蒸煮 30min-40min。 0015 上述方法中， 步骤 c 中接入曲霉后对大豆进行厚层通风培养， 24h 后进行翻曲， 总 的发酵培养时间为 60h 72h。 0016 上述方法中， 步骤 d 中所述干燥为在 50干燥箱中干燥 8h 10h。 0017 上述方法中， 步骤 d 中将制得的豆豉半成品于 -20下保存。 0018 上述方法中， 步骤 f 中灭菌的温度为 115， 时间为 2。
13、0min。 0019 上述方法中， 步骤 g 中还对制得的豆豉成品进行真空冷冻干燥 16h-18h， 粉碎， 过 60 目筛， 制得豆豉冻干粉。 0020 上述方法中， 步骤 g 中所述种子液采用如下方法制备 ： 0021 (1) 获取枯草芽孢杆菌 ： 从豆豉中筛选高产豆豉纤溶酶菌株， 保存于 -80下 ； 0022 (2) 配制种子培养基 ： 按照 100mL 水中含有葡萄糖 1.0g、 大豆蛋白胨 1.0g、 Na2HPO40.2g、 NaH2PO40.1g、 CaCl20.02g 和 MgSO40.05g 的比例配置种子培养基 ； 0023 (3) 种子液制备 ： 将枯草芽孢杆菌转接至营。
14、养琼脂斜面培养基， 37恒温培养过 夜， 从斜面培养基取一环活化菌种， 接入 50mL 种子培养基中， 37， 200rpm 振荡培养 14h 16h。 0024 上述方法中， 粉碎后得到土黄色的豆豉冻干粉， 豆豉纤溶酶酶活为 1800-2000 单位 /g 冻干粉， 大豆异黄酮、 游离氨基酸的含量分别达到 7.80-8.60mg/g 冻干粉和 18.50-20.00mg/g 冻干粉。 0025 与现有技术相比， 本发明的有益效果 ： 本发明采用两步固态发酵， 首先经过前发酵 ( 曲霉发酵 ) 制得豆豉半成品， 由于曲霉分泌的多种酶系的作用， 豆豉半成品中的可溶性 氮、 可溶性糖、 水溶性矿物。
15、质、 游离氨基酸、 大豆异黄酮等比原料显著提高。在此基础上， 接 种枯草芽孢杆菌进行豆豉纤溶酶的固态发酵， 有利于豆豉中的纤溶酶含量的提高， 并进一 步提高多肽、 大豆异黄酮等活性成分含量。用本发明的方法生产的溶血栓豆豉富含豆豉纤 溶酶、 大豆异黄酮、 游离氨基酸和矿物质等营养成分， 豆豉纤溶酶可以专一地水解血纤维蛋 白， 具有溶解血栓的功能 ； 大豆异黄酮具有抗氧化作用 ； 游离氨基酸和矿物质是人体必需 的营养成分， 是一种具有抗氧化、 抗血栓、 预防心血管疾病功能的新一代保健食品， 可在有 关保健食品生产企业， 豆豉生产厂家推广应用， 具有显著的社会效益和经济效益。 具体实施方式 0026。
16、 下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步说明。 0027 实施例 1 0028 1、 黑豆的前发酵 0029 精选优质黑豆清洗后， 室温浸泡 5h， 浸水比例 1 3 ； 121， 0.1MPa， 蒸煮 30min， 冷却后接入种曲 ( 曲霉 )， 厚层通风培养， 24h 后进行翻曲， 60h 后豆粒遍布黄绿色孢子即可 出曲 ； 将成曲投入水池， 洗去表面分生孢子和菌丝， 于 50干燥箱中干燥 8h， 制得豆豉半成 品， 保存于 -20备用。 说 明 书 CN 101305785 B3/4 页 5 0030 2、 黑豆的后发酵 0031 (1) 菌种 0032 枯草芽孢杆菌 (Bacil。
17、lus subtilis)DC-12 为本实验室从豆豉中筛选的高产豆豉 纤溶酶菌株， 保存于 -80。 0033 (2) 种子培养基 0034 按照 100mL 水中含有葡萄糖 1.0g、 大豆蛋白胨 1.0g、 Na2HPO40.2g、 NaH2PO40.1g、 CaCl20.02g 和 MgSO40.05g 的比例配置种子培养基， 种子培养基的 pH 值为 7.0。 0035 (3) 种子液制备 0036 将保存菌种转接至营养琼脂斜面培养基， 37恒温培养过夜。从斜面培养基取一 环活化菌种， 接入 50mL 种子培养基中， 37， 200rpm 振荡培养 14h。 0037 (4) 后发酵。
18、 0038 豆豉半成品室温浸泡 5h， 浸水比例为 1 1 ； 添加 8.0 (W/W) 的葡萄糖， 并灭菌 20min ； 将灭菌后的豆豉半成品冷却至室温， 按每 100g 豆豉半成品接入 12mL 新鲜培养的枯 草芽孢杆菌种子液， 30发酵培养 72h， 制得豆豉成品。 0039 (5) 豆豉纤溶酶、 大豆异黄酮、 游离氨基酸的测定 0040 以尿激酶作标准品， 采用纤维蛋白平板法测定豆豉纤溶酶酶活 ； 以染料木素作标 准品， 采用紫外分光光度计法测定大豆异黄酮含量 ； 采用电位滴定法测定游离氨基酸的含 量。 0041 3、 冷冻干燥 0042 两步固态发酵得到的豆豉成品黑亮圆润， 表面有。
19、大量粘液， 成品真空冷冻干燥 16h， 粉碎后得到土黄色的豆豉冻干粉， 豆豉纤溶酶酶活为 1800 单位 /g 冻干粉， 大豆异黄 酮、 游离氨基酸的含量分别达到 7.80mg/g 冻干粉和 18.50mg/g 冻干粉。 0043 实施例 2 0044 1、 黑豆的前发酵 0045 精选优质黑豆清洗后， 室温浸泡 8h， 浸水比例 1 5 ； 121， 0.1MPa， 蒸煮 40min， 冷却后接入种曲 ( 曲霉 )， 厚层通风培养， 24h 后进行翻曲， 72h 后豆粒遍布黄绿色孢子即可 出曲 ； 将成曲投入水池， 洗去表面分生孢子和菌丝， 于 50干燥箱中干燥 10h， 制得豆豉半 成品，。
20、 保存于 -20备用。 0046 2、 黑豆的后发酵 0047 (1) 菌种 0048 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)DC-12 为本实验室从豆豉中筛选的高产豆豉 纤溶酶菌株， 保存于 -80。 0049 (2) 种子培养基 0050 按照 100mL 水中含有葡萄糖 1.0g、 大豆蛋白胨 1.0g、 Na2HPO40.2g、 NaH2PO40.1g、 CaCl20.02g 和 MgSO40.05g 的比例配置种子培养基， 种子培养基的 pH 值为 7.0。 0051 (3) 种子液制备 0052 将保存菌种转接至营养琼脂斜面培养基， 37恒温培养过夜。从斜面培养基取一。
21、 环活化菌种， 接入 50mL 种子培养基中， 37， 200rpm 振荡培养 16h。 0053 (4) 后发酵 说 明 书 CN 101305785 B4/4 页 6 0054 豆豉半成品室温浸泡 8h， 浸水比例为 1 2 ； 添加 10.0 (W/W) 的葡萄糖， 并灭菌 20min ； 将灭菌后的豆豉半成品冷却至室温， 按每 100g 豆豉半成品接入 15mL 新鲜培养的枯 草芽孢杆菌种子液， 35发酵培养 84h， 制得豆豉成品。 0055 (5) 豆豉纤溶酶、 大豆异黄酮、 游离氨基酸的测定 0056 以尿激酶作标准品， 采用纤维蛋白平板法测定豆豉纤溶酶酶活 ； 以染料木素作标 。
22、准品， 采用紫外分光光度计法测定大豆异黄酮含量 ； 采用电位滴定法测定游离氨基酸的含 量。 0057 3、 冷冻干燥 0058 两步固态发酵得到的豆豉成品黑亮圆润， 表面有大量粘液， 成品真空冷冻干燥 18h， 粉碎后得到土黄色的豆豉冻干粉， 豆豉纤溶酶酶活为 2000 单位 /g 冻干粉， 大豆异黄 酮、 游离氨基酸的含量分别达到 8.60mg/g 冻干粉和 20.00mg/g 冻干粉。 0059 实施例 3 0060 1、 黄豆的前发酵 0061 精选优质黄豆清洗后， 室温浸泡 7h， 浸水比例 1 4 ； 121， 0.1MPa， 蒸煮 35min， 冷却后接入种曲 ( 曲霉 )， 厚层。
23、通风培养， 24h 后进行翻曲， 72h 后豆粒遍布黄绿色孢子即可 出曲 ； 将成曲投入水池， 洗去表面分生孢子和菌丝， 于 50干燥箱中干燥 9h， 制得豆豉半成 品， 保存于 -20备用。 0062 2、 黄豆的后发酵 0063 (1) 菌种 0064 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)DC-12 为本实验室从豆豉中筛选的高产豆豉 纤溶酶菌株， 保存于 -80。 0065 (2) 种子培养基 0066 按照 100mL 水中含有葡萄糖 1.0g、 大豆蛋白胨 1.0g、 Na2HPO40.2g、 NaH2PO40.1g、 CaCl20.02g 和 MgSO40.05g 的。
24、比例配置种子培养基， 种子培养基的 pH 值为 7.0。 0067 (3) 种子液制备 0068 将保存菌种转接至营养琼脂斜面培养基， 37恒温培养过夜。从斜面培养基取一 环活化菌种， 接入 50mL 种子培养基中， 37， 200rpm 振荡培养 15h。 0069 (4) 后发酵 0070 豆豉半成品室温浸泡 6h， 浸水比例为 1 2 ； 添加 9.0 (W/W) 的葡萄糖， 并灭菌 20min ； 将灭菌后的豆豉半成品冷却至室温， 按每 100g 豆豉半成品接入 14mL 新鲜培养的枯 草芽孢杆菌种子液， 33发酵培养 84h， 制得豆豉成品。 0071 (5) 豆豉纤溶酶、 大豆异黄酮、 游离氨基酸的测定 0072 以尿激酶作标准品， 采用纤维蛋白平板法测定豆豉纤溶酶酶活 ； 以染料木素作标 准品， 采用紫外分光光度计法测定大豆异黄酮含量 ； 采用电位滴定法测定游离氨基酸的含 量。 0073 3、 冷冻干燥 0074 两步固态发酵得到的豆豉成品黑亮圆润， 表面有大量粘液， 成品真空冷冻干燥 17h， 粉碎后得到土黄色的豆豉冻干粉， 豆豉纤溶酶酶活为 1900 单位 /g 冻干粉， 大豆异黄 酮、 游离氨基酸的含量分别达到 8.20mg/g 冻干粉和 19.30mg/g 冻干粉。 说 明 书 。