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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510232433.4 (22)申请日 2015.05.08 A61K 47/18(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 9/127(2006.01) C07C 217/28(2006.01) C07C 213/08(2006.01) (73)专利权人 厦门成坤生物技术有限公司 地址 361027 福建省厦门市海沧区新阳工业 区翁角路 289 号科创大厦 202-1 单元 (72)发明人 崔坤元 陈波 梁东 郑志凌 (54) 发明名称 一类阳离子类脂化合物的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种阳离子类。
2、脂化合物在制备 脂质体中的应用， 所述化合物的分子结构通式为 ： 其中， R为C624的烷基、 C6 24 的烯烃基、 C6 24 的酰基， X 为 Cl 或 Br。本发 明化合物可以改变脂质体制剂的特性、 减少毒性， 增加其核酸分子的细胞及组织的传递作用。 (51)Int.Cl. 审查员 张志聪 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 104873976 B 2016.04.20 CN 104873976 B 1.一种阳离子类脂化合物在制备脂质体中的应用， 所述化合物结构式如式I所示： 其中， R为C624的烷基、 C624的烯烃基。
3、、 C624的酰基， X为Cl或Br。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 取代基R为亚油烯基、 油烯基、 亚油酰基、 油 酰基、 正十二烷基、 正十四烷基、 正十六烷基。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述式I化合物为如下式所示： 4.一种包含权利要求1所述式I化合物的脂质体， 所述脂质体包括所述阳离子类脂化合 物、 中性的磷脂分子、 胆固醇分子和带有聚乙二醇脂质分子。 5.根据权利要求4所述的脂质体， 其特征在于， 所述中性的磷脂分子为磷脂酰乙醇胺。 6.根据权利要求4所述的脂质体， 其特征在于， 所述带有聚乙二醇脂质分子为DSPE-PEG 或DSPC-PEG。 。
4、权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104873976 B 2 一类阳离子类脂化合物的应用 技术领域 0001 本发明涉及一类阳离子类脂化合物的应用， 属于医药生物领域。 背景技术 0002 随着人们在细胞水平上对疾病发病机制认识的不断深入,基因治疗已日渐成为科 学家们研究的热点。 寻找安全有效的基因转移载体也越来越为人们所关注。 目前主要使用 的载体为病毒载体,如重组腺病毒载体。 这类载体由于转染效率较高且对大多数细胞都具 有靶向作用,因此在基因转移方面具有一定的优点。 然而,因它会引起体内的一些免疫反 应,而且含有可转录的病毒基因,可能在体内发生基因的重组或互补,进一步对人体造成伤 。
5、害。 近年来,人们对非病毒载体用于基因治疗的研究取得了一些成果,其中最为重要的就是 阳离子脂质体的使用。 1987年,Felgner等首次将N-1-(2,3)-二油烯氧基丙基-N,N,N-三 甲基氯化胺(DOTMA)与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)各10mg制成小单室脂质体(转染试剂, 商品名为Lipofectin,转化脂)。 而在siRNA药物开发过程中， 也应用DOTMA作为脂质体、 颗粒 的一个组分。 0003 脂质体或脂质颗粒是由脂质分子， 如磷脂、 胆固醇等为膜材包合而成。 按电荷性， 脂质体可分为中性脂质体、 负电性脂质体、 正电性脂质体。 脂质体已经广泛用于科学研究及 药物的开。
6、发。 利用阳性脂质分子与中性脂质分子等混合， 可用于包裹核酸分子， 如DNA、 RNA、 小干扰核酸、 MiRNA等， 用于基因治疗， 基因抑制， 这种技术广泛用于研究和新药的开发。 脂 质体或脂质分子也已用于有些药物的包裹， 促进药物的靶向性、 稳定性、 提高药物的有效 性、 减少副作用等。 0004 现脂质体不能广泛用于研究， 其临床的最大缺点是： 脂质体的毒性和有效性制约 了它的应用， 尤其是药物开发的应用。 0005 改进脂质体或脂质颗粒的方法， 主要从几个方面进行： 例如成分。 脂质体、 脂质颗 粒通常有几种成分混合而成， 主要有磷脂、 胆固醇、 为了增强脂质体、 颗粒的稳定性及在体。
7、 内的半衰期， 脂质体、 颗粒的表面中会通过脂质PEG分子， 保护脂质纳米颗粒， 不宜聚集及 被白细胞吞噬。 在所有影响脂质体的功能及应用的因素中， 脂质体的组分占有显著的作用。 目前， 阳离子脂质体在核酸的应用(研究及药物的开发)均占有主导的市场。 但是， 其毒性与 有效性仍是阻碍阳离子脂质体应用的关键。 发明内容 0006 本发明的一个目的在于提供了一种阳离子类脂化合物在制备脂质体中的应用， 所 述化合物如式I所示： 说 明 书 1/6 页 3 CN 104873976 B 3 0007 0008 其中， R为C624的烷基、 C624的烯烃基、 C624的酰基， X为Cl或Br。 000。
8、9 在本发明的一个实施方案中， 取代基R优选为亚油烯基、 油烯基、 亚油酰基、 油酰 基、 正十二烷基、 正十四烷基、 正十六烷基。 0010 出人意料的是， 本发明发现当所述式I化合物的取代基R为亚油烯基， 并且X为Cl或 Br时， 所述化合物在核酸分子的细胞及组织的传递作用时的效果最好， 并且稳定性极佳。 所 述化合物结构式如下： 0011 0012 本发明中所述应用包括利用所述阳离子类脂化合物制备脂质体。 0013 具体地， 所述脂质体包括所述阳离子类脂化合物、 中性的磷脂分子、 胆固醇分子和 带有聚乙二醇脂质分子。 0014 其中， 所述中性的磷脂分子优选为磷脂酰乙醇胺。 0015 其。
9、中， 所述带有聚乙二醇脂质分子优选为DSPE-PEG(磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)或 DSPC-PEG(二硬脂酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇)。 0016 本发明的另一个目的是提供一种所述的用于脂质体的化合物的制备方法， 包括以 下各步骤： 0017 1)醇与对甲苯磺酰氯反应生成对甲苯磺酸酯， 其中所述醇通式为ROH， R为C624 的烷基、 C624的烯烃基； 说 明 书 2/6 页 4 CN 104873976 B 4 00182)对甲苯磺酸酯与3-(二甲胺基)-1,2-丙二醇反应生成通式为的化 合物； 00193)与碘甲烷反应生成通式为的化合物； 00204)与二氯甲烷或二溴甲烷反应生成所述用于脂质。
10、体的化合物。 0021 步骤1)中R优选为亚油烯基、 油烯基、 正十二烷、 正十四烷、 正十六烷。 0022 在具体合成时， 上述制备方法的步骤1)为将醇、 三乙胺、 4-二甲氨基吡啶加入二氯 甲烷中， 保持在-5以下， 搅拌16h， 然后将对甲苯磺酰氯滴加于二氯甲烷中溶解， 并缓慢升 温至室温后， 反应15h， 检测无醇后， 分离有机相， 水相二氯甲烷萃取2次， 取有机相干燥， 除 去溶剂， 得对甲苯磺酸油脂。 0023 步骤2)为在氩气保护下， 将氢化钠与四氢呋喃混合搅拌均匀， 然后滴加3-(二甲胺 基)-1,2-丙二醇， 再滴加对甲苯磺酸油脂， 然后升温至66， 微回流反应24h， 降至。
11、室温后抽 滤， 石油醚萃取滤液、 合并水洗有机相、 干燥、 除去溶剂， 得黄色油状物， 然后硅胶柱层析分 离得 0024步骤3)为在中加入碘甲烷， 室温下搅拌反应24h， 除去溶剂后， 得 说 明 书 3/6 页 5 CN 104873976 B 5 0025步骤4)为将溶于二氯甲烷或二溴甲烷中， 加入717树脂， 搅拌反应 72h后抽滤得粗品， 硅胶柱层析分离得所述用于脂质体的化合物。 0026 本发明的有益效果： 所述化合物可以较好的改变脂质体制剂的特性、 减少毒性并 增加稳定性， 增加其核酸分子的细胞及组织的传递作用。 附图说明 0027 图1是本发明实施例1所述化合物的核磁氢谱； 00。
12、28 图2是本发明实施例1所述化合物的核磁碳谱。 具体实施方式 0029 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明， 应当理解， 此处所描述的优选实 施例仅用于说明和解释本发明， 并不用于限定本发明。 0030 实施例1 三甲基2,3-(二亚油烯基氧基)丙基氯化铵的合成 0031 0032 1)将亚油醇(顺-9， 12-十八(碳)二烯醇)13.35g， 三乙胺7.78g， 4-二甲氨基吡啶 0.732g加入0.25L三口烧瓶中， 加入二氯甲烷30ml,于-10度低温循环泵中搅拌,降至-5度以 下,将对甲苯璜酰氯13.35g溶于二氯甲烷20ml于恒压滴液漏斗中滴加， 保持液温-5度， 90min。
13、s滴毕， 5ml二氯甲烷冲洗恒压滴液漏斗， 缓慢升温， 室温反应15h后， TLC石油醚:乙酸 乙酯5:1监测无亚油醇， 分离有机相， 水相二氯甲烷萃取2次， 取有机相用无水硫酸镁干燥， 旋蒸脱溶， 得无色油状物20。 0033 2)500ml四口烧瓶中加入氢化钠1.5g， 四氢呋喃50ml， 搅拌均匀， 氩气保护。 将3- (二甲胺基)-1,2-丙二醇1g通过恒压滴液漏斗滴加， 10mins滴毕， 滴加对甲苯磺酸亚油醇脂 9g， 0.5h内滴毕， 升温至66度， 微回流反应24h， 颜色淡黄， 降温后， 布氏漏斗抽滤， 石油醚萃 说 明 书 4/6 页 6 CN 104873976 B 6 。
14、取滤液， 合并水洗有机相， 无水硫酸镁干燥， 旋蒸脱溶， 得红色油状物10g。 硅胶柱层析， 洗脱 剂二氯甲烷： 甲醇10： 1分离得2.73g淡黄色油状物。 0034 3)将N,N,二甲基-2,3-(二亚油烯基氧基)丙胺0.57g加入50ml单口瓶中， 加入碘甲 烷0.6ml， 室温下搅拌反应24h， 旋蒸抽干反应剩余碘甲烷， 得淡黄色油状物0.6g。 0035 4)三甲基2,3-(二亚油烯基氧基)丙基碘化铵0.6g溶于20ml二氯甲烷中， 加入 717树脂2g， 搅拌反应72h后抽滤得粗品， 硅胶柱层析， 洗脱剂二氯甲烷： 甲醇10： 1分离得无 色油状物0.4g。 0036 所得化合物鉴。
15、定分析： MS:630.6166Calculate Exact Mass:630.6184。 0037 核磁氢谱1H NMR(500MHz CDCl3)见图1， 核磁13C NMR(500MHz CDCl3)碳谱见图2。 0038 实施例2 siRNA制剂制备 0039 将实施例1合成的三甲基2,3-(二亚油烯基氧基)丙基氯化铵溶在乙醇中， 与 ALDH siRNA混合产生水不溶性的沉淀物(1:1.5)， 分离和干燥沉淀物后， 将沉淀物溶解在氯 仿或类似溶剂中， 并进一步与其他脂质,磷脂酰乙醇胺:胆固醇:胆固醇PEG(0.2:3:2.5: 2)在氯仿混合， 如(WO/2010/135207)所。
16、述工艺。 除去有机溶剂后， 干燥制剂与9蔗糖水水 合， 即可动物给药。 0040 实施例3 0041 试验方法： 0042 1、 体内实验动物的研究中使用的所有程序是机构动物管理和使用委员会(IACUC) 批准的， 并按照当地， 州和联邦法规进行。 通过小鼠尾静脉注射0.2毫升注射实施例2制备 siRNA的配方。 收获的组织和血液用于分析基因表达的变化。 另外， 为了说明三甲基2,3- (二亚油烯基氧基)丙基氯化铵的优越性， 以三甲基2,3-(二正十二烷氧基)丙基氯化铵、 三甲基2,3-(二正十四烷氧基)丙基氯化铵、 三甲基2,3-(二正十六烷氧基)丙基氯化 铵、 三甲基2,3-(二油烯基氧基。
17、)丙基氯化铵等类似化合物作为对比， siRNA制剂的制备方 法同实施例2。 0043 2、 mRNA的分离： 转染后两天， 将细胞用100L PBS洗一次， 然后加入100L (Turbocapture试剂盒， Qiagen公司制)裂解缓冲液。 溶解的细胞产物(80 L)转移到一个96 孔的mRNA的捕捉板， 在室温下孵育1小时。 对于小鼠组织， 给药两天后， 小鼠采集小鼠肝脏组 织。 用Polytron(Turbocapture试剂盒， Qiagen公司制)在裂解缓冲液匀浆。 然后转移80 L到 一个96孔的mRNA的捕捉板， 在室温下孵育1小时。 用100 L洗涤缓冲液洗涤三次， 然后80。
18、 L的 洗脱缓冲液加入到各孔中， 在65下温育5分钟。 洗脱溶液(含有mRNA的)被转移到一个新的 96孔清晰板。 0044 3、 实时RT-PCR： 3 L分离的mRNA用来实时RT-PCR。 RT-PCR方法采用SYBR Green一步 实时RT-PCR试剂盒(SensiMix一步SYBR Green试剂盒， BIOLINE)。 混合11 L master mix(含 逆转录酶)， 1 L的正向和反向引物(6 M)， 0.3 L 50X的SYBR Green和2.7 L水。 反转录反应 的温度在42， 30分钟后， 之后95， 15分钟用于激活Tag聚合酶； PCR循环的温度和时间是 95。
19、， 15秒， 60， 30秒， 72， 20秒。 用CT方法分析基因表达的变化。 0045 3.1小鼠肝脏ALDH酶的抑制效果 0046 说 明 书 5/6 页 7 CN 104873976 B 7 0047 0048 *对照组： 注射没被脂质体包裹的siRNA， 其值为100。 基因抑制效果值愈低， 效果 愈好。 每组五只小鼠， 取平均值。 0049 3.2溶解度 0050 化合物溶解度脂肪链 三甲基2,3-(二正十二烷氧基)丙基氯化铵1.5C12 三甲基2,3-(二正十四烷氧基)丙基氯化铵1C14 三甲基2,3-(二正十六烷氧基)丙基氯化铵0.5C16 三甲基2,3-(二油烯基氧基)丙基氯。
20、化铵1C16(两个双键) 三甲基2,3-(二亚油烯基氧基)丙基氯化铵1.5C16(四个双键) 0051 *将三甲基2,3-(二油烯基氧基)丙基氯化铵的相对溶解度设为1， 数值愈大溶解 度愈高。 0052 3.3稳定性 0053 化合物稳定性脂肪链 三甲基2,3-(二正十二烷氧基)丙基氯化铵2C12 三甲基2,3-(二正十四烷氧基)丙基氯化铵2C14 三甲基2,3-(二正十六烷氧基)丙基氯化铵2C16 三甲基2,3-(二油烯基氧基)丙基氯化铵1C16(两个双键) 三甲基2,3-(二亚油烯基氧基)丙基氯化铵2C16(四个双键) 0054 *将三甲基2,3-(二油烯基氧基)丙基氯化铵的相对稳定性为1。
21、数值愈大稳定性 愈高。 稳定性试验是把制剂放置于37， 一周。 用高压液相分析。 按照新出现的杂质峰的总 面积推算。 0055 最后应说明的是： 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术人员来说， 其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的 保护范围之内。 说 明 书 6/6 页 8 CN 104873976 B 8 图1 说 明 书 附 图 1/2 页 9 CN 104873976 B 9 图2 说 明 书 附 图 2/2 页 10 CN 104873976 B 10 。