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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610277808.3 (22)申请日 2016.04.27 (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38号 (72)发明人 师恺 张欢 史军营 宰文珊 齐振宇 喻景权 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 胡红娟 (51)Int.Cl. A01N 41/04(2006.01) A01P 1/00(2006.01) A01P 21/00(2006.01) (54)发明名称 植物磺肽素- 在提高植物黄化曲叶病。
2、毒病 抗性中的应用 (57)摘要 本发明公开了植物磺肽素- 在提高植物黄 化曲叶病毒病抗性中的应用以及在制备提高植 物黄化曲叶病毒病抗性的制剂中的应用。 本发明 以植物磺肽素- 为主要有效成分制备的制剂， 通 过诱导植物体内的生长素的信号路径， 可显著增 强植物对黄化曲叶病毒病的抗性， 减少因黄化曲 叶病毒病给植株带来的经济损失。 采用本发明制 剂防治植物黄化曲叶病毒病简单易行， 成本较 低， 可显著延迟和抑制黄化曲叶病毒在叶片上的 生长及病害的扩散， 大大提高了植株对黄化曲叶 病毒病的抗性。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 105900983 A 2016.08.31。
3、 CN 105900983 A 1.植物磺肽素- 在提高植物黄化曲叶病毒病抗性中的应用。 2.植物磺肽素- 在制备提高植物黄化曲叶病毒病抗性的制剂中的应用。 3.如权利要求1或2所述的应用， 其特征在于， 所述植物为番茄。 4.一种制剂， 其特征在于， 所述制剂的有效成分为植物磺肽素- 。 5.如权利要求4所述的制剂， 其特征在于， 以1L计， 包括： 植物磺肽素- 6.510.5g； 表面活性剂 0.020.03L； 水 0.970.98L。 6.如权利要求4所述的制剂， 其特征在于， 以1L计， 包括： 植物磺肽素- 8.47g； 表面活性剂 0.025L； 水 0.975L。 7.一种提。
4、高植物黄化曲叶病毒病抗性的方法， 其特征在于， 包括： 将权利要求46任一 所述的制剂用水稀释后喷施于植物叶片表面或滴灌在植物根部附近。 8.如权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述的制剂稀释后， 喷施于植物叶片表面的 植物磺肽素- 的浓度为67.76101.64mg/L。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105900983 A 2 植物磺肽素- 在提高植物黄化曲叶病毒病抗性中的应用 技术领域 0001 本发明涉及植物化学保护技术领域， 尤其涉及植物磺肽素- 在提高植物黄化曲叶 病毒病抗性中的应用。 背景技术 0002 番茄在我国的栽培面积和总产量均位居世界首位， 需求量和种植面。
5、积都在逐年增 加。 病毒病严重威胁着番茄的生产安全， 其中由番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus， TYLCV)引起的病毒病20世纪30年代末在以色列首次发现， 于20世纪90年代传 入我国， 现已成为严重危害番茄生产的毁灭性病害。 0003 黄化曲叶病毒的主要传播媒介为烟粉虱， 可侵染茄科、 豆科及十字花科等作物。 该 病在番茄上的症状主要表现为： 初期生长迟缓或停滞， 开花延迟， 花朵和结实减少。 植株明 显矮化， 叶脉变紫， 叶片变形焦枯， 新叶出现黄绿不均斑块， 有凹凸不平的皱缩或变形， 严重 时叶片萎缩， 开花后不结果或多畸形果， 产量和质量品。
6、质降低甚至绝收， 给种植者造成了严 重的经济损失。 0004 来源于野生种的黄化曲叶病毒抗性基因目前已经定位的有5个， 我国利用抗性基 因已经育有一些抗性品种。 但大多抗病新品种通常只含有1个或2个抗性基因， 面对TYLCV的 易变异性， 这样的品种通常抗性不稳定。 除此之外， 目前生产上推广的番茄品种多数为感病 品种。 生产上， 化学农药施用是防治番茄黄化曲叶病毒病及传毒媒介的主要途径。 0005 其中， 菌克毒克、 植病灵或吗啉胍乙酮等被用以防治病毒病， 但田间实际防效 差； 吡虫啉、 丁硫吡虫啉、 扑虱灵、 氟虫腈等被用以杀灭烟粉虱， 但在烟粉虱虫口数量极大 的情况下， 这些杀虫剂对防治。
7、番茄黄化曲叶病毒病的效果往往不佳， 且会有农药残留的问 题。 因此， 寻找一种高效无害的病害防治手段是今后农作物黄化曲叶病毒病防治研究和发 展的方向。 0006 植物诱导抗病性是利用植物本身的防卫体系， 借助于诱导因子激发植物整体抗性 水平， 使原来的感病反应产生局部的或系统的抗性， 提高抵抗病害的能力， 又称获得性免 疫， 是植物病害防治的一种新思路。 0007 一般来说， 植物通过诱导物产生系统抗病性， 随后通过内源信号传递至整个植株， 产生一系列的生理生化反应， 激活植物体内的抗病基因， 产生一些具有抗病毒活性的物质。 植物诱导抗病性具有抗病谱广、 持续时间较长、 可掌控的抗病性表达时间。
8、和空间等优点， 其 中最重要的是目前发现的大部分诱导物对环境无污染， 如能田间实际应用， 将会在一定程 度上减少化学农药的使用， 对降低农残， 加快无毒农药取代有毒农药的进程， 以及改善生态 环境和生态平衡都具有重要意义。 0008 脂类、 多糖、 核酸类、 蛋白类物质均能够诱导寄主植物产生系统抗病性。 目前我国 防治蔬菜病毒病的生物制剂有效成分主要包括香菇多糖、 葡聚烯糖、 低聚糖素、 宁南霉素、 氨基寡糖素、 苦参碱等， 这些成分可以激发植株自身的防御系统， 同时对某些病毒的复制和 扩散有一定的作用。 但目前针对TYLCV进行防治的生物制剂的研究和应用还相对较少。 说 明 书 1/5 页 。
9、3 CN 105900983 A 3 0009 植物磺肽素(PSK)是一种植物肽， 最初在芦笋叶肉细胞悬浮培养中的培养基中得 到鉴定分离。 PSK由约80个氨基酸长的前体肽经酪氨酸残基的翻译后磺化和蛋白水解加工 而产生(Yang等，“Oryza sativa PSK gene encodes a precursor of phytosulfokine- , a sulfated peptide growth factor found in plants” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States o。
10、f America， 1999,96:13560-13565)。 剪切 修饰后成熟的PSK以两种形式存在： 磺化的五肽PSK (H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr- Gln-OH)及其C-端截短的四肽PSK (H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-OH) (Matsubayashi Y.等，“Phytosulfokine ,sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus oficinalis L.。 ” Proceeding。
11、s of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1996， 93:7623-7627)， 被认为是一种新型的 “肽类激素” 。 0010 其结构式如下： 0011 0012 目前， 对PSK 已有的研究表明， 其在细胞增殖和分化、 分生组织形成、 自交不亲和 性 、 器官 脱落 、 气孔运 动 、 抗性反应等过程中 均具有植物生长 调节物 质的 属性 (Matsubayashi等，“Peptide hormones in plants。 ” Annual Reviewof Plant Biology，。
12、 2006， 57:649-674)。 0013 在PSK 参与植物抗病性的研究中， PSK 对不同的病原菌的作用有所不同。 拟南芥 植物PSK 的受体pskr1/pskr2双突变体较野生型植株对黑斑病菌Alternariabrassicicola 更加敏感。 与此形成对比， 拟南芥pskr1/pskr2突变体却对细菌性叶斑病菌Pseudomonas syringae更具抗性(Igarashi等，“The peptide growth factor,phytosulfokine, attenuatespattern-triggered immunity。 ” The Plant Journal。
13、， 2012， 71:194-204)。 发明内容 0014 本发明发现植物磺肽素- (PSK )具有诱导植物的生长素(IAA)信号路径， 提高植 物对黄化曲叶病毒的抗性， 降低植物黄化曲叶病毒病的发生。 0015 基于以上发现， 本发明提供了植物磺肽素- 在提高植物黄化曲叶病毒病抗性中的 应用。 0016 本发明还提供了PSK 在制备提高植物黄化曲叶病毒病抗性的制剂中的应用。 说 明 书 2/5 页 4 CN 105900983 A 4 0017 所述的植物具体可以为番茄。 0018 PSK 是由约80个氨基酸长的前体肽经酪氨酸残基的翻译后磺化和蛋白水解加工 而产生的五肽； 可诱导提高植物的。
14、生长素(IAA)合成及信号转导基因FZY2、 TAA1、 PIN1等的 表达从而提高植物对黄化曲叶病毒病的抗性。 0019 本发明还提供了一种提高植物黄化曲叶病毒病抗性的制剂， 所述制剂的有效成分 为植物磺肽素- 。 0020 作为优选， 所述的制剂， 以1L计， 包括： 植物磺肽素- 6.510.5g； 表面活性剂0.02 0.03L； 水0.970.98L。 0021 所述表面活性剂可使制剂在植物表面的湿润、 分散、 展着和渗透性能显著增强， 有 效减少制剂喷洒后随风漂移， 提高制剂的抗雨水冲刷能力和药效、 减少制剂的用量、 延长制 剂的有效期。 0022 所述表面活性剂可采用有机硅、 吐。
15、温60或Silwet-L77中的一种； 优选为有机硅， 有 机硅表面活性剂价格更为低廉， 且在提高制剂的延展性、 降低制剂表面张力上效果更为显 著， 使制剂更易被植株吸收。 0023 更优选， 所述的制剂， 以1L计， 包括： 植物磺肽素- 8.47g； 表面活性剂0.025L； 水 0.975L。 在上述各组分配比下制得的制剂中， 植物磺肽素- 在植物表面的分散性、 展着性以 及渗透性效果最佳。 0024 所述的制剂通过如下方法进行制备： 0025 (1)将植物磺肽素- 先溶解于少量水中， 再加水， 得到混合溶液； 0026 (2)向混合溶液中加入表面活性剂， 获得所述制剂。 0027 本发。
16、明还提供了一种提高植物黄化曲叶病毒病抗性的方法， 包括： 将权利要求4 6任一所述的制剂用水稀释后喷施于植物叶片表面或滴灌在植物根部附近。 0028 本发明制剂可在连续强光、 高温、 干旱等易发番茄黄化曲叶病毒病的环境下或已 出现轻微黄化曲叶病毒病症状的时期进行使用。 0029 制剂的使用浓度、 次数， 尤其是制剂中PSK 的浓度可根据植物的苗龄、 具体生长情 况以及植物生长环境情况、 病害程度来确定。 0030 作为优选， 所述的制剂稀释后， 喷施于植物叶片表面的植物磺肽素- 的浓度为 67.76101.64mg/L。 0031 本发明的优点在于： 0032 (1)本发明对于已知化合物磺肽素。
17、- 发掘了新的提高植物黄化曲叶病毒病抗性的 用途， 开拓了一个新的应用领域。 0033 (2)本发明制剂中的磺肽素- 为植物友好型物质， 可在环境和生物体内降解， 使用 后也无残留， 对人畜和环境无毒害。 0034 (3)本发明以磺肽素- 为主要有效成分制备的制剂， 通过诱导植物体内的生长素 (IAA)的信号路径， 可显著增强植物对黄化曲叶病毒病的抗性， 减少因黄化曲叶病毒病给植 株带来的经济损失。 0035 (4)采用本发明制剂防治植物黄化曲叶病毒病简单易行， 成本较低， 可显著延迟和 抑制黄化曲叶病毒在叶片上的生长及病害的扩散， 大大提高了植株对黄化曲叶病毒病的抗 性。 说 明 书 3/5。
18、 页 5 CN 105900983 A 5 附图说明 0036 图1为实施例1中番茄黄化曲叶病毒接种后第7天、 14天、 21天后， 喷施制剂与喷清 水对照间的番茄新叶中TYLCV相对DNA含量的比较； 0037 空心柱代表对照植株， 斜纹柱代表处理植株； 小写字母a、 b代表不同处理间在5 水平上的差异显著。 0038 图2为实施例2中喷施过制剂与喷清水对照的植株进行番茄黄化曲叶病毒接种后 处理后， 番茄叶片病害发生情况的比较； 0039 A为番茄黄化曲叶病毒接种21天后病毒病发病率； B为番茄黄化曲叶病毒接种21天 后叶片内TYLCV相对DNA含量； 0040 空心柱代表对照植株， 斜纹柱。
19、代表处理植株； 小写字母a、 b代表不同处理间在5 水平上的差异显著。 0041 图3为实施例3中本发明制剂的田间效应， 喷施过制剂与喷清水对照的番茄病害发 生率与发生严重情况的比较； 0042 A为番茄黄化曲叶病毒病发生率； B为喷施与未喷施本发明制剂后健康与发病番茄 叶片的净光合速率(Pn)； 空心柱代表对照植株， 斜纹柱代表处理植株； 小写字母a、 b、 c代表 不同处理间在5水平上的差异显著。 具体实施方式 0043 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。 0044 实施例1 0045 一、 制剂的制备 0046 取磺肽素- (PSK )2.54g(药品购自法国NeoMPS公司)； 。
20、缓慢加入294.0mL的水， 并 将混合溶液混合均匀， 最后向混合溶液中加入6.0mL的有机硅溶液， 搅拌均匀后， 获得制剂。 0047 二、 制剂的施用和检测 0048 取上述制剂100毫升， 加清水10升， 混合均匀后， 在傍晚均匀喷施于苗龄为四叶一 心的番茄叶片表面， 直至叶片湿润为止， 持续喷施2天， 以喷清水的番茄植株作为对照。 0049 对上述处理植株用消毒竹签挑取农杆菌侵染性克隆菌体于番茄第1-2片真叶茎秆 处针刺接种番茄黄化曲叶病毒。 将上述处理的所有植株置于28、 70湿度、 12h光照/12h 黑暗、 光强为400 mol m-2s-1的环境下培养。 0050 于接种后第7。
21、天、 14天、 21天分别随机取上部幼嫩新叶， 利用北京TIANGEN公司生产 的Plant Genomic DNA Kit试剂盒进行DNA提取， 后利用美国Applied Biosystems公司生产 的Step ONE Plus Real-Time PCR System仪器及该公司的SYBR RT-PCR Kit荧光染料试剂 盒对TYLCV的相对DNA表达量进行荧光定量qPCR的方法进行检测， 采用的TYLCV特异引物为： 0051 F： 5 -CTTCAAGGAATTCATGGGGG-3 ， R： 5 -GTCCCCAAGTAGTCTGTCTT-3 。 0052 结果如图1所示， 上述制。
22、剂处理的植株叶片比对照的植株叶片具有明显较强的 TYLCV抗性。 接种后第7天、 14天、 21天后， 经制剂处理过的植株上部幼嫩叶片内的TYLCV病毒 DNA相对含量分别为对照植株的14.8、 27.9和39.6。 0053 实施例2 说 明 书 4/5 页 6 CN 105900983 A 6 0054 一、 制剂的制备 0055 取磺肽素- (PSK )2.03g(药品购自法国NeoMPS公司)； 缓慢加入292.5mL的水， 并 将混合溶液混合均匀， 最后向混合溶液中加入7.5mL的有机硅溶液， 搅拌均匀后， 获得制剂。 二、 制剂的施用和检测 0056 取上述制剂100毫升， 加清水。
23、10升， 混合均匀后， 在傍晚均匀喷施于苗龄为三叶一 心的番茄叶片表面， 直至叶片湿润为止， 持续喷施2天， 以喷清水的番茄植株作为对照。 0057 对上述处理植株用消毒竹签挑取农杆菌侵染性克隆菌体于番茄第1-2片真叶茎秆 处针刺接种番茄黄化曲叶病毒。 将上述处理的所有植株置于32、 70湿度、 12h光照/12h 黑暗、 光强为400 mol m-2s-1的环境下培养并观察植株发病情况。 0058 于接种后第21天， 对番茄黄化曲叶病毒病发病率进行统计； 并随机取上部幼嫩新 叶， 利用北京TIANGEN公司生产的Plant Genomic DNA Kit试剂盒进行DNA提取， 后利用美国 A。
24、pplied Biosystems公司生产的Step ONE Plus Real-Time PCR System仪器及该公司的 SYBR RT-PCR Kit荧光染料试剂盒对TYLCV的相对DNA表达量进行荧光定量qPCR的方法进行 检测， 采用的TYLCV特异引物为： 0059 F： 5 -CTTCAAGGAATTCATGGGGG-3 ， R： 5 -GTCCCCAAGTAGTCTGTCTT-3 。 0060 结果如图2A和B所示， 接种第21天后， 在对照植株中， 人工接种后TYLCV的发病率为 89， 而该制剂处理后的番茄黄化曲叶病毒病的发病率则下降了52.8， 叶片TYLCV的相对 D。
25、NA表达量也比对照下降了56.5。 0061 实施例3 0062 一、 制剂的制备 0063 取磺肽素- (PSK )3.05g(药品购自法国NeoMPS公司)； 缓慢加入291.0mL的水， 并 将混合溶液混合均匀， 最后向混合溶液中加入9.0mL的有机硅溶液， 搅拌均匀后， 获得制剂。 0064 二、 制剂的施用和检测 0065 选取栽培技术及管理完全一致的两个相邻的塑料大棚， 在秋初高温少雨季节， 对 处理棚使用上述制剂， 取制剂200毫升， 加清水20升， 混合均匀后， 在清晨和傍晚分两次均匀 喷施于苗龄为七叶一心的番茄叶片表面至叶片湿润为止， 持续喷施2天； 而对照棚仅喷施相 同体积。
26、的水。 0066 20天后随机统计处理棚与对照棚中各60株番茄的发病率， 并通过光合作用参数比 较处理棚与对照棚植株的健康状况。 光合作用速率采用美国Li-Cor公司生产的便携式光合 仪Li-6400测定净光合速率， 叶片温度、 光强和CO2浓度分别设定为25、 800 mol m-2s-1、 360 mol mol-1。 0067 结果如图3所示， 在番茄黄化曲叶病毒病高发阶段处理本发明制剂20天后， 明显增 强了番茄植株对TYLCV的抗性， 本发明制剂处理的植株比对照植株的病株率下降了57.1。 处理植株与对照植株中未发病健康植株的净光合速率(Pn)相似， 上述制剂处理后仍然发病 的植株也比对照条件下发病植株的净光合速率(Pn)平均高46.5。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105900983 A 7 0001 序 列 表 1/1 页 8 CN 105900983 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 9 CN 105900983 A 9 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 10 CN 105900983 A 10 。