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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201580023801.2 (22)申请日 2015.04.28 (30)优先权数据 1453891 2014.04.29 FR (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2016.10.31 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/FR2015/051150 2015.04.28 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2015/166184 FR 2015.11.05 (83)生物保藏信息 CNCM I-4830 2013.12.18 (71)申请人 克洛德贝纳尔-里昂第一大学。
2、 地址 法国维勒班 申请人 食品动物健康农艺与环境学院 国家科学研究中心 法国国家发展研究院 (72)发明人 R巴利 G孔泰 J伯尔尼伦 F贝尔韦尔特 C普里让-孔巴雷特 Z-N安德里安贾卡-坎普斯 R迪波努瓦 F维希涅夫斯基-戴伊 C伯特兰 L米谢 (74)专利代理机构 隆天知识产权代理有限公司 72003 代理人 王芝艳 吴小瑛 (51)Int.Cl. A01N 37/04(2006.01) A01N 37/06(2006.01) A01N 37/36(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 13/00(2006.01) 。
3、(54)发明名称 二羧酸用于控制全寄生或半寄生植物生长 的用途 (57)摘要 本发明涉及包含2至5个碳原子的二羧酸用 于控制全寄生或半寄生植物生长的用途， 本发明 还涉及以编号I-4830登记于CNCM(法国国家微生 物保藏中心)的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)L4菌株， 其能够产生呈现出对抗独 脚金(Striga)和列当(Orobanche)的生物除草剂 活性的二羧酸。 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 CN 106455558 A 2017.02.22 CN 106455558 A 1.一种或多种包含2至5个碳原子的二羧酸控制全寄生或半寄生植物的生长的用。
4、途。 2.根据权利要求1的用途， 其特征在于所述二羧酸选自草酸、 丙二酸、 苹果酸、 戊二酸、 马来酸和乙炔二羧酸。 3.根据权利要求1的用途， 其特征在于所述二羧酸是L形式的苹果酸。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途， 其特征在于所述二羧酸与至少一全寄生或 半寄生植物的种子接触。 5.根据权利要求4的用途， 其特征在于所述二羧酸以足以阻止种子萌发和/或足以抑制 萌发种子的胚根(procaulome或radicle)延长的量使用。 6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途， 其用于控制独脚金(Striga)属植物的生 长。 7.根据权利要求1至5中任一项所述的用途， 其用于控制列当(O。
5、robanche)属植物的生 长。 8.根据权利要求1至7中任一项的用途， 其特征在于将二羧酸施用于待保护的农艺学植 物的种子和/或幼苗， 所述农艺学植物特别选自玉米、 水稻、 小麦、 高粱、 豇豆、 烟草、 向日葵、 油菜籽、 卷心菜、 番茄、 茄子、 马铃薯、 胡椒、 芹菜和豆。 9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途， 其特征在于所用的二羧酸由以编号I-4830 保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)的巴西 固氮螺菌(Azospirillum brasilense)L4菌株产生。 10.根据。
6、权利要求1至9中任一项所述的用途， 其特征在于将以编号I-4830保藏在CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)的巴西固氮螺菌L4 菌株直接施用于待保护的作物或土壤以免全寄生或半寄生植物生长， 并直接原位产生二羧 酸。 11.以编号I-4830保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)的巴西固氮螺菌L4菌株的用途， 其用于产生农作物或农艺学利 益植物的植物生长促进剂， 以保护它们对抗全寄生植物的生长， 所述农作物或。
7、农艺学利益 植物特别选自玉米、 水稻、 小麦、 高粱、 豇豆、 烟草、 向日葵、 油菜籽、 卷心菜、 番茄、 茄子、 马铃 薯、 胡椒、 芹菜和豆。 12.巴西固氮螺菌L4菌株， 其以编号I-4830保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,法国)。 13.用于控制全寄生或半寄生植物生长的除草组合物， 其含有包含2至5个碳原子的二 羧酸和来自K2HPO4或KH2PO4的离子， 一种或多种填料诸如二氧化硅、 粘土、 高岭土或滑石以 及一种或多种表面活性剂诸如十二烷基苯或木质素磺酸钙。 14.根据权利要求13的组合物， 。
8、其特征在于所述二羧酸选自草酸、 丙二酸、 苹果酸、 戊二 酸、 马来酸和乙炔二羧酸。 15.根据权利要求13的组合物， 其特征在于所述二羧酸是L形式的苹果酸。 16.根据权利要求13至15中任一项所述的组合物， 其特征在于它们以每升溶液包含1- 20g二羧酸的溶液形式存在。 17.用于农作物或农艺学利益植物的种子的包衣， 其包含以编号I-4830保藏在CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,法国)菌株巴西固氮螺菌L4 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 106455558 A 2 的细菌。 18.根据权利要求17。
9、的涂层， 其特征在于它还包含一种或多种选自泥炭、 珍珠岩、 阿拉 伯树胶、 羧甲基纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮、 壳聚糖和藻酸盐的成分。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 106455558 A 3 二羧酸用于控制全寄生或半寄生植物生长的用途 0001 本发明涉及保护农作物(禾本科(Poaceae)、 茄科(Solanaceae)、 十字花科 (Brassicaceae)、 菊科(Asteraceae)对抗玄参目(Scrophulariales)的根全寄生性和半寄 生性植物(即在其宿主植物的根上发育)， 并且特别是独脚金(Striga)和列当(Orobanche) 的技术领域。 更确切地说。
10、， 本发明涉及包含2至5个碳原子的二羧酸或以编号I-4830登记于 CNCM的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)L4菌株用于控制全寄生性或半寄生性植 物生长的用途。 0002 全寄生植物是天然不产生叶绿素并且因此必须从宿主植物摄入它们的有机物质 的寄生植物。 半寄生植物是仅合成其发育必需的部分含碳物质的产生叶绿素的寄生植物。 这些寄生植物借助形成的吸器附接至宿主的根， 从而以牺牲它们的宿主为代价而进行发 育， 而其中所述吸器建立了宿主植物的木质部的输导导管和寄生植物的输导导管之间的连 接(Bouwmeester et al.,2003,Curr.Opin.Plant。
11、 Biol.6:358364)。 一旦产生了连接， 寄 生植物从宿主植物吸取汁液， 减缓气生植物的发育， 诱导缺绿症并降低光合作用(Ejeta and Butler,2000.Parasitic plants.In:R.A.Frederiksen and G.N.Odvody(eds) .Compendium of Sorghum Diseases ,2nd edition .APS Press ,The American Phytopathological Society,pp.5356)。 为了生存， 这些寄生植物必须产生大量种子。 因 此， 一旦出现气生植物， 寄生植物开花并产生大量种子。
12、， 种子可以在土壤中保持存活几年 (Haussmann et al.,2000,Field Crop Res.66:195211)。 独脚金(Striga)和列当 (Orobanche)属的植物是同一目(玄参目(Scrophulariales)的成员， 但是不属于同一科 (独脚金属植物是玄参科(Scrophulariaceae)的成员并且是半寄生植物， 而列当属植物是 列当科(Orobanchaceae)的成员并且是全寄生植物)。 这些植物具有许多共同点： 方便散播 的小种子， 萌发取决于独脚金内酯型刺激剂的存在， 通过吸器的发育掠夺宿主植物的营养。 另一方面， 它们分布在不同的地区： 独脚金。
13、在全世界的所有热带和亚热带区域并特别是在 撒哈拉以南非洲， 而列当主要在亚洲和中欧的温带国家并特别是地中海区域。 它们非常广 泛地影响各种有农艺学利益的植物(玉米、 水稻、 高粱、 小米、 向日葵、 油菜籽、 烟草、 番茄等) 的生长， 无论是在温带区域(列当)还是在热带区域(独脚金)。 它们引起大量作物的实质性 产量损失。 在非洲大陆上： 大约五千万公顷被独脚金所寄生， 导致损失超过一千万吨的谷类 作物(Gressel et al.,2004,Crop Prot.23:661689)。 作为农业气候条件、 区侵袭水平 (plot infestation level)和谷类作物脆弱性的函数， 。
14、由独脚金的寄生造成的谷物产量损 失可在5-100变化(Haussmann et al.,2000,Field Crop Res.66:195211)。 在欧洲， 特 别是在地中海盆地， 一千六百万公顷被列当寄生， 每年的损失对于向日葵估计为五千万欧 元， 对于烟草为一亿七千五百万欧元， 以及对于番茄为两亿欧元(Blbl et al.,2009, Helia 32:141152)。 0003 这些寄生植物的种子非常小， 这促进了它们通过风、 通过动物或者通过被污染的 农业机械的长距离传播。 被污染的宿主植物的种子的运输也是一种散播源。 由于寄生植物 的种子产量巨大(高达100,00个种子/株植物。
15、)， 被侵染的田块通常必须被废弃。 0004 迄今为止， 保护作物对抗列当或独脚金植物涉及使用非选择性除草剂， 加上使用 说 明 书 1/7 页 4 CN 106455558 A 4 对这些除草剂具有抗性的谷物品种(De Groote et al.,2008,Agric.Syst.97:8394)。 这 些化学控制手段除了环境毒性之外成本还高。 此外， 在Ecophyto 2018计划的背景下， 植物 药理学产品(包括除草剂)的使用将大大减少。 0005 也可以在不存在宿主植物的情况下刺激独脚金种子的萌发。 由于紫独脚金 (S.hermonthica)是半寄生的， 在不存在宿主植物的情况下的这。
16、种刺激可以在2-3天内导致 寄生植物的死亡， 并且最终导致土壤中保存的根寄生植物的种子的减少。 这可以通过使用 乙烯获得(Logan and Stewart,1991,Plant Physiol.97:14351438)。 乙烯是可以诱导独 脚金种子萌发的植物激素， 但是在土壤中应用乙烯成本极高， 这阻碍了该技术在农业中的 应用(Berner et al.,1999,Biological Control 15:274282)。 0006 存在其他控制手段， 例如手拉或使用与非宿主植物的轮作， 但它们的效果较差。 对 植物寄生植物具有抗性的谷物品系的品种选择也是一种替代解决方案， 但成本高。 0。
17、007 目前， 没有替代的控制产品， 诸如使用天然存在的分子， 对抗市场上存在的独脚金 或列当。 0008 在文献中， 多种研究已经显示各种生物制剂限制寄生植物独脚金或列当生长的能 力。 这包括单食性食草昆虫的幼虫， 诸如Phytomyza orobanchia， Eulocastra argentisparsa， 真菌诸如Fusarium oxysporum f .sp.orthoceras， F .oxysporum f.sp.strigae或产生霉菌毒素(即镰刀菌酸(fusaric acid)， 伏马菌素(fumonisins)和脱 氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON。
18、)的Fusarium arthrosporioides(Amsellem et al.,2001 ,BioControl 46:211228； Abuelgasimand Kroschel,2003,FAO plant production and protection.Paper No.120.Addendum1 ,109144； Lendzemo et al.2004Field Crop Res.91:5161； Venne et al.,2009,Pest.Manag.Sci.65:572580)。 霉菌毒素(特别是DON)能够抑制独脚金和列当种子的萌发， 但它们可以引发哺乳动物的健 康。
19、问题。 特别地， 它们存在牛饲料和人类食品的风险， 因此不能被认为是完全无害的物质。 0009 还可以提及标题为 “A factor from Azospirillum brasilense inhibits germination and radicle growth of Orobanche aegyptiaca Tikva” 的Tikva Dadon et al.,2004(Isr.J.Plant Sci.52:8386)的工作， 它描述了由巴西固氮螺菌菌株产生的代谢 物对列当的拮抗活性。 在该出版物中， 由该菌株(未提及其名称)产生的活性分子被鉴定为 存在于上清液的乙醇级分中的寡肽。 。
20、此外， 该菌株仅显示抑制列当种子萌发的一种活性。 此 外， Bouillant et al.,1997(C.R.Acad.III Sci.Vie 320:159162)报道， 没有巴西固氮螺 菌菌株对寄生植物的萌发和生长具有这样的抑制活性。 在后一出版物中， 还报道了在对微 环境中的独脚金的发芽和生长表现出这样的抑制活性的两种巴西固氮螺菌菌株中， 只有这 些菌株中的一种(巴西固氮螺菌L4)对高粱显示植物生长促进作用。 0010 因此， 鉴于全世界这些寄生植物的快速繁殖， 迫切需要开发新的可持续和环境友 好的解决方案以控制玄参目的全寄生或半寄生植物， 这些寄生植物导致农作物和农艺学利 益的植物的。
21、显著破坏。 0011 在这个背景下， 本发明提出使用包含2至5个碳原子的二羧酸来控制全寄生或半寄 生植物的生长， 特别是控制独脚金属植物和/或列当属植物的生长。 还可以使用包含2至5个 碳原子的几种二羧酸的组合来控制全寄生或半寄生植物的生长， 以获得所需的效果。 0012 在本发明的上下文中， 所提出的抑制全寄生或半寄生植物(诸如独脚金或列当植 说 明 书 2/7 页 5 CN 106455558 A 5 物)发育的活性剂选自包含2至5个碳原子的二羧酸(以下也称为二酸)。 这种二酸包含两个 羧酸官能团， 其在草酸的情况下直接连接在一起， 或通过包含1、 2或3个碳原子的饱和或不 饱和碳链连接在。
22、一起。 该碳链优选是直链的， 并且可以是未取代的或被一个或多个取代基， 特别是OH、 OCH3和CH2OCH3类型的取代基取代。 作为这样的二酸的实例， 可以提及的有草酸、 丙二酸、 马来酸、 苹果酸、 戊二酸和乙炔二羧酸。 优选使用L形式的苹果酸， 其对抑制独脚金 或列当植物的生长尤其具有活性。 0013 发明人能够从2013年12月18日按照1977年布达佩斯条约、 以保藏号I-4830保藏于 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,Institut Pasteur, 25rue du Docteur Roux,75。
23、724Paris Cedex 15,France)的细菌菌株巴西固氮螺菌L4的培 养物上清液中， 分离L形式的苹果酸。 1995年从马里被独脚金寄生植物侵染的高粱田中分离 该菌株。 据报道， 巴西固氮螺菌L4菌株具有在体外抑制紫独脚金(Striga hermontica)和分 枝列当(Orobanche ramosa)的生长以及在土壤微环境中保护高粱对抗独脚金并刺激谷物 生长的能力(Bouillant et al.,1997,C.R.Acfad.III Sci.Vie 320:159162； Miche et al.,2000,Eur.J.Plant Pathol.106:347351)， 该。
24、菌株已经以编号I-4830保藏在CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)。 与其他巴西固氮螺 菌菌株相比(并且特别是与Dadon et al.,2004:Isr.J.Plant Sci.52:8386报道的菌株相 比)， 该菌株在培养中产生相当特定的代谢物。 实际上， 鉴于所述的活性， 本发明人分析了以 编号I-4830保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, France)的巴西固氮螺菌L4菌株的培养物上清液， 并且能够证明。
25、L形式的苹果酸负责对抗全 寄生或半寄生植物的除草活性。 然而， 证明L形式的苹果酸不是存在于以编号I-4830保藏在 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)的细菌菌株巴 西固氮螺菌L4的培养物上清液中的主要成分。 本发明人还表明， 对抗全寄生或半寄生植物 的所述除草活性可推广到包含2至5个碳原子的二羧酸的化学类别。 0014 因此， 本发明提出使用环境影响低的天然存在的活性剂来限制和抑制寄生植物的 生长。 如特别从下表1中的数据所示的， 与主要通过抑制列当和独脚金种子的萌发起作用的 其它生物制剂不同， 包。
26、含2至5个碳原子的二羧酸还能够抑制寄生植物的萌发种子中的胚根 (procaulome或radicle)的延长， 并由此阻止寄生植物的生长。 这应该能够以显著的方式降 低受侵染土壤中的全寄生植物或半寄生植物的存活种子的储存， 而仅通过抑制萌发阶段并 不能完全实现这种效果。 实际上， 在不存在有利于寄生植物萌发的条件下(特别是在不存在 独脚金内酯的情况下)， 种子可以在土壤中保持活力几年。 0015 在本发明的上下文中， 二羧酸可以至少与待根除的全寄生或半寄生植物的种子接 触。 二羧酸将以足以获得所需效果的量使用， 并且特别是阻止种子的萌发和/或抑制来自玄 参目且特别是独脚金和/或列当的全寄生或半。
27、寄生植物的萌发种子的胚根的延长。 优选地， 每公顷处理的土壤可以使用30-300kg的二羧酸。 如果二羧酸以水溶液的形式施用， 可以使 用每升溶液包含1-20g二羧酸的溶液。 0016 二羧酸可以施用于待保护的植物或作物的种子和/或幼苗。 本发明的含有二羧酸 的除草组合物可以特别地以水溶液或颗粒的形式存在。 这些组合物除了活性二羧酸外， 还 可以含有来自K2HPO4或KH2PO4的离子， 一种或多种填料如二氧化硅、 粘土、 高岭土或滑石， 以 及一种或多种表面活性剂如十二烷基苯或木质素磺酸钙(calcium lignosulfonate)。 在L 说 明 书 3/7 页 6 CN 106455。
28、558 A 6 形式的苹果酸的情况下， 其可以通过化学合成或直接由以编号I-4830保藏在CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)的细菌菌株巴西固 氮螺菌L4产生。 在这种情况下， 可以分离酸或者除草组合物可以直接含有细菌培养物上清 液。 培养物上清液可以通过将细菌置于任何合适的培养基中获得。 可以使用本领域技术人 员已知的并且特别描述于Nelson and Knowles,1978,Can J.Microbiol.24:13951403中 的巴西固氮螺菌细菌的生长条件。 特别地， 生长将在26至32的温。
29、度， 通常在28的温度下 在含有用于细菌生长的盐、 营养物和碳源的缓冲水性介质中进行。 作为盐的实例， 可以提及 NaCl、 K2HPO4、 KH2PO4、 MgSO4、 NaCl、 CaCl2、 NH4Cl。 作为营养物的实例， 可以提及Na2MoO4、 MnSO4、 H3BO3、 CuSO4、 ZnSO4、 FeEDTA、 酵母提取物、 生物素。 作为碳源的实例， 可以特别提及葡 萄糖、 苹果酸盐和果糖。 作为这种培养基的实例， 可以提及Nfb和Nfb*培养基， 特别是在 Nelson and Knowles,1978,Can.J.Microbiol.24:13951403and Vial。
30、 et al.,2006, J.Bacteriol.188:53645373中所描述的。 0017 还可以将以编号I-4830保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)并且产生的活性二羧酸中的一种的菌株巴西固氮螺菌L4， 直接 应用于待保护的植物的种子或作物或待保护的土壤以对抗全寄生植物和半寄生植物的生 长， 并由此直接原位产生二羧酸。 此外， 以编号I-4830保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)且在本发。
31、明的背景下使用用于抑制玄参目特 别是独脚金和/或列当的全寄生或半寄生植物的生长的菌株巴西固氮螺菌， 具有用于作物 改良的另一个优点， 因为它还能够刺激植物生长并能够产生用于农业利益的植物的植物生 长促进剂(Bouillant et al.,1997,C.R.Acad.Sci.320:159162)。 因此， 本发明提出使用 以编号I-4830保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, France)菌株巴西固氮螺菌L4， 产生用于待受到保护的农作物或农艺学利益植物的植物生 长促进剂以对抗全寄生或半寄生植物的生长。 表。
32、述 “植物生长促进剂” 是指促进感兴趣植物 生长的试剂。 通过改变感兴趣的植物的根系统结构显示了以编号I-4830保藏在CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)菌株巴西固氮螺菌 L4的这种效果， 其在出版物ouillant et al.,1997,C.R.Acad.Sci.320:159162中进行了 描述。 特别地， 可以用农作物或农艺学利益植物特别选自玉米(corn)、 水稻(rice)、 小麦 (wheat)、 高粱(sorghum)、 豇豆(cow pea)、 烟草(tobacco)、 向日葵(s。
33、unflower)、 油菜籽 (rapeseed)、 卷心菜(cabbage)、 番茄(tomato)、 茄子(eggplant)、 马铃薯(potato)、 胡椒 (pepper)、 芹菜(celery)、 豆(bean)等， 获得植物生长促进剂。 0018 特别地， 可以使用以编号I-4830保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)菌株巴西固氮螺菌的细菌来包被这种农作物或农 艺学利益植物的种子。 在这种情况下， 将细菌引入构成用于农作物或农艺学利益植物的种 子包衣的基质中。 该包衣可以含有一种或多。
34、种组分， 例如泥炭、 珍珠岩、 阿拉伯树胶、 羧甲基 纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮、 壳聚糖或藻酸盐。 所述细菌将以足以获得所需效果的量使用， 并 且特别是足以阻止玄参目(特别是独脚金和/或列当)的全寄生或半寄生植物的种子萌发， 和/或足以抑制玄参目(特别是独脚金和/或列当)的全寄生或半寄生植物的萌发种子的胚 根(procaulome或radicle)的延长， 和/或足以刺激农作物或农艺学利益植物的生长。 优选 地， 每克待保护的和/或待促进其生长的农作物或农艺学利益植物的种子将使用3107个 说 明 书 4/7 页 7 CN 106455558 A 7 细菌细胞。 0019 因此， 在本发明的上。
35、下文中提出的用于控制玄参目(特别是独脚金和/或列当)的 全寄生或半寄生植物生长的包含2至5个碳原子的二羧酸可以被种子生产者用于包被他们 的种子， 还被植物药理学公司使用， 用于常规农业领域(通过化学方法合成包含2至5个碳原 子的二羧酸)和有机农业领域(通过活生物体生产活性剂， 特别是在L形式的苹果酸的情 况)。 0020 参照附图由下面提到的制备和应用实施例举例说明本发明， 但这决不限制本发 明。 0021 图1显示了代表在Nfb*培养基中生长的巴西固氮螺菌L4菌株上清存在下和在含L- 苹果酸(2mg/mL)的磷酸盐缓冲液(50mM)存在下， 微量滴定板中所获得的对紫独脚金生长的 作用的照片。。
36、 0022 图2显示了巴西固氮螺菌L4菌株上清对紫独脚金和分枝列当种子的萌发百分率 (A)和对紫独脚金和分枝列当种子的procaulome长度(B)的作用。 0023 显示了在体外和/或土壤微环境中图中的二酸和命名为L4以编号I-4830保藏在 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)的细菌菌株巴 西固氮螺菌的培养物上清液对寄生植物独脚金和列当的活性。 0024产品的制备： 0025 对于培养物上清液： 以编号I-4830保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de。
37、 Microorganismes,France)菌株巴西固氮螺菌L4在Nfb*培养基(MgSO4,7H2O 100mg/L,CaCl2,2H2O 13mg/L,NaCl 175mg/L,Na2MoO4,2H2O 1mg/L,MnCl2,4H2O 3.5mg/L, KH2PO4 600mg/L,K2HPO4 900mg/L,生物素1mg/L,FeEDTA 65.6mg/L,胰蛋白胨250mg/L,酵 母提取物125mg/L)(Nelson and Knowles,1978,Can J.Microbiol.24:13951403,Vial et al.,2006,J.Bacteriol.188:5。
38、3645373)在28下培养16小时； 离心培养物， 回收上清液并 在0.2 m过滤器上过滤灭菌。 进行菌株巴西固氮螺菌L4的上清液的生物导向纯化(色谱分级 分离偶联级分对抗独脚金的除草活性的生物测试)。 在显示除草活性的级分中， 与化学标准 品比较， 通过质谱来鉴定C4二羧酸。 纯化的化合物和苹果酸(化学标准品)的质谱鉴定使得 可以鉴定活性分子是苹果酸。 圆二色性检测器显示了L-苹果酸的存在。 0026 通过制备浓度为1-20mg/mL的所选二酸的水溶液或磷酸盐缓冲液(50mM， pH 7)溶 液， 测试二酸对寄生植物独脚金和列当的活性。 0027对全寄生或半寄生植物紫独脚金和分枝列当测试除。
39、草效果： 0028 1.在12孔微量滴定板中， 将滤纸(Whatman 3)置于孔的底部并用无菌水润湿。 在每 个孔中， 将全寄生或半寄生植物的约30个经灭菌的种子(用70乙醇， 然后1(w/v)Ca (ClO)2和20漂洗， 然后用水彻底漂洗)置于滤纸的表面。 在30、 黑暗中孵育10天 后， 在萌发刺激剂GR24的存在下， 加入递增量的二酸或培养物上清液。 在30下培养3天后， 使用偶联有相机的显微镜(macroscope)， 在二酸或培养物上清液存在下将寄生植物的发育 与阴性对照(水， 磷酸盐缓冲液或无菌培养基)进行比较。 测量全寄生或半寄生植物的胚根 (procaulome)的长度， 。
40、以显示所测试产品的植物毒性能力。 所有结果示于下表1中。 0029 表1： 各种二羧酸对微量滴定板中紫独脚金生长的影响 说 明 书 5/7 页 8 CN 106455558 A 8 0030 0031 1:无抑制胚根(procaulome)尺寸0.8mm)； +:弱抑制胚根(procaulome)尺寸为 0.2-0.8mm)； +:强抑制胚根(procaulome)尺寸0.2mm) 0032 图1呈现的图代表了在Nfb*中生长的菌株巴西固氮螺菌L4的上清液存在下和在含 L-苹果酸(2mg/mL)的磷酸盐缓冲液存在下， 所获的对微量滴定板中的紫独脚金生长的作 用， 并且显示了它们对全寄生或半寄生。
41、植物的procaulome生长的抑制作用。 0033 图2显示了菌株巴西固氮螺菌L4的上清液对紫独脚金和分枝列当的种子萌发百分 比(A)和对紫独脚金和分枝列当的种子胚根(procaulome)长度(B)的影响。 0034 结论： 观察到以编号I-4830保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France)的菌株巴西固氮螺菌L4的培养物上清液能够体外终止全寄生植 物独脚金和列当的胚根(procaulome)延长(在微量滴定板中的生物测定， 图1和2)， 并且在 受控条件下抑制微环境中高粱作物中独脚金的生长(Boui。
42、llant et al .,1997 , C.R.Acad.Sci.320:159162)。 通过合适的色谱法分离了涉及该作用的分子， 然后通过质谱 法通过与化学标准品比较进行鉴定。 还显示多种二羧酸有效地控制玄参目， 特别是独脚金 和/或列当的全寄生或半寄生植物的生长(表1)。 0035 2.在递增量的苹果酸(2和20g/L)或培养物上清液的存在下， 将紫独脚金种子(约 100粒种子/盆)和高粱种子(1粒种子/盆)同时置于土壤微环境， 然后在温室或田地中生长。 说 明 书 6/7 页 9 CN 106455558 A 9 0036 在培养2个月后， 目测估计独脚金幼苗的出现。 通过与不添加苹。
43、果酸或培养上清液 的对照相比较来估计植物毒性能力。 在2g/L苹果酸存在下观察到与对照条件相比已经出现 的独脚金幼苗数量减少22， 在20g/L苹果酸存在下观察到90的减少。 在细菌上清液的存 在下， 观察到与对照条件相比独脚金数目减少58。 0037 3.植物生长促进作用的结果 0038 在Bouillant et al.,1997C.R.Acad.III Sci.Vie 320:159162中提出了以编号 I-4830保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,France) 细菌菌株巴西固氮螺菌L4的植物生长促进作用。 说 明 书 7/7 页 10 CN 106455558 A 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 11 CN 106455558 A 11 。