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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510497847.X (22)申请日 2015.08.14 A61N 1/36(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路 866 号 (72)发明人 严敏 张冯江 杨瑾婷 王文娜 刘云青 (74)专利代理机构 杭州九洲专利事务所有限公 司 33101 代理人 陈继亮 (54) 发明名称 一种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂 的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种采用直线加速器灭活自体血 回收中混杂的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的 方法， 该方法包括如下步。
2、骤 ： (1)、 HepG2， SK-Hep1 和 Huh7 肝肿瘤细胞株分别与经过血液回收机浓 缩后的红细胞混合混匀， 混匀后肝肿瘤细胞密 度为 5106/ml， 混合细胞在 2-8条件下将运 输至放疗科 ； (2)、 将混合细胞放置于血液辐照 容器， 设置箱子距离辐照源为 60cm， 辐照面积为 4040cm2； 使用医用直线加速器进行 30Gy 辐照， 该直线加速器能量为 6MeV ； (3)、 辐照后使用密度 为 1.063g/ml 的 Percoll 行密度梯度离心法分离 肿瘤细胞株和红细胞。本发明的有益效果为 ： 线 性加速器 30Gy 有效且安全的灭活混杂在回收红 细胞中的Hep。
3、G2， SK-Hep1和Huh7肝肿瘤细胞并保 存红细胞质量。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 106166328 A 2016.11.30 CN 106166328 A 1/1 页 2 1.一种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方 法， 其特征在于 ： 该方法包括如下步骤 ： (1)、 HepG2， SK-Hep1 和 Huh7 肝肿瘤细胞株分别与经过血液回收机浓缩后的红细胞混 合混匀， 混匀后肝肿瘤细胞密度为 5106/ml， 混合细胞在 2-8条件下将运输至放疗科。
4、 ； (2)、 将混合细胞放置于血液辐照容器， 设置箱子距离辐照源为 60cm， 辐照面积为 4040cm2； 使用医用直线加速器进行 30Gy 辐照， 该直线加速器能量为 6MeV ； (3)、 辐照后使用密度为1.063g/ml的Percoll行密度梯度离心法分离肿瘤细胞株和红 细胞。 采用MTT法、 EdU法、 平板克隆形成法、 裸鼠皮下移植瘤模型检测辐照后肿瘤细胞株的 增殖活力、 DNA复制、 克隆性、 成瘤性 ； 同时检测辐照后红细胞的Na+-K+-ATPase活性， 2,3-二 磷酸甘油酸 (2,3-DPG) 水平， 游离血红蛋白 (free Hb) 水平， 渗透脆性， 及血气值变。
5、化。 权 利 要 求 书 CN 106166328 A 2 1/3 页 3 一种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂的肝肿瘤细胞 并保存红细胞质量的方法 技术领域 0001 本发明属于医学技术领域， 具体涉及一种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂 的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方法。 背景技术 0002 术中自体血液回收方法有效节约血液资源， 并大大减少异体输血反应， 已广泛用 于多种手术。 但在肿瘤手术中的应用一直有争议， 主要担心手术回收的血液含有肿瘤细胞， 并经浓缩后回输给患者会引起肿瘤的转移。 0003 仅仅使用自体血液回收机是不能完全去除回收血液中的肿瘤细胞。 目前白细胞过 滤器和 射。
6、线辐照是研究最多的两种方法。但有报道肿瘤手术中回收血液混有的肿瘤细 胞数量超过 107时， 使用白细胞过滤器是不安全的。而术中肿瘤破裂就会引起回收血液的 肿瘤细胞负荷大大增加， 如超过 2107/200ml。故在肿瘤手术中使用白细胞过滤进行自体 血液回收仍然是不安全的。而有报道使用 137Cs 血液辐照仪对回收含有肿瘤细胞的血液进 行 射线辐照， 可以有效且安全的杀灭至少 10log 的肿瘤细胞。尽管如此， 关于 射线辐 照仍有一些问题。 因为射线源一般为 137Cs和60Co， 使用这些活性射线源有很多的安全问 题 ： 需要合适有效措施来保障活性射线源的放置的安全， 防治非法分子盗取活性射线。
7、源严 重危害公共安全 ； 需要特殊的保护措施和检测方法来保障员工的身体安全。 使用射线辐 照的方法另外很大的缺陷就是很难普及和推广应用， 因为它的安全问题及费用问题， 很多 医院是没有血液辐照仪的， 只有少数的血液中心才可以获得。若使用 射线辐照就需要外 送至血液中心， 这样会大大延长血液回收的时间。 0004 众所周知 X 线直线加速器的主要用于肿瘤病人的放疗， 而 X 线直线加速器是 射 线源最好的替代方法。目前在一些肿瘤医院， 直线加速器也广泛的用于血液辐照。研究表 明同剂量的 X 线辐照和 137Cs 的 辐照的生物作用是没有临床差异的， 同样的最低 25Gy 可 以有效预防输血相关性。
8、移植物抗宿主病， 而不超过 50Gy 的剂量就不损伤血液细胞。但是 X 线直线加速器用于灭活回收血液中混有的肿瘤细胞没有研究过。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足， 而提供一种采用直线加速器灭活自 体血回收中混杂的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方法， 研究 X 线直线加速器灭活回收血 液中混有的肝肿瘤细胞 (HepG2,SK-Hep1,Huh7) 的有效性， 及对回收血液中红细胞质量的 影响。 0006 本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。 这种采用直线加速器灭活自体血回 收中混杂的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方法， 该方法包括如下步骤 ： 0007 (1)、 He。
9、pG2， SK-Hep1 和 Huh7 肝肿瘤细胞株分别与经过血液回收机浓缩后的红细 胞混合混匀， 混匀后肝肿瘤细胞密度为 5106/ml， 混合细胞在 2-8条件下将运输至放疗 说 明 书 CN 106166328 A 3 2/3 页 4 科 ； 0008 (2)、 将混合细胞放置于血液辐照容器， 设置箱子距离辐照源为 60cm， 辐照面积为 4040cm2； 使用医用直线加速器进行 30Gy 辐照， 该直线加速器能量为 6MeV ； 0009 (3)、 辐照后使用密度为1.063g/ml的Percoll行密度梯度离心法分离肿瘤细胞株 和红细胞。采用 MTT 法、 EdU 法、 平板克隆形成。
10、法、 裸鼠皮下移植瘤模型检测辐照后肿瘤细 胞株的增殖活力、 DNA复制、 克隆性、 成瘤性 ； 同时检测辐照后红细胞的Na+-K+-ATPase活性， 2,3- 二磷酸甘油酸 (2,3-DPG) 水平， 游离血红蛋白 (free Hb) 水平， 渗透脆性， 及血气值变 化。 0010 本发明的有益效果为 ： 线性加速器 30Gy 有效且安全的灭活混杂在回收红细胞中 的 HepG2， SK-Hep1 和 Huh7 肝肿瘤细胞并保存红细胞质量。使用 X 射线的线性加速器与血 液辐照仪 射线放射源相比有更多优势， 不仅更有效的以更低剂量灭活肝肿瘤细胞 ； 而且 不是活性放射源， 对操作员更安全 ； 。
11、同时不需要运输至血液中心进行辐照， 节约了成本 / 时 间。 附图说明 0011 图 1 是 30Gy 和 50Gy 的 X 线辐照完全抑制各株肿瘤细胞的克隆形成的示意图 ； 0012 图 2 是 30Gy 和 50Gy 的 X 线辐照完全抑制各株肿瘤细胞的皮下移植瘤的形成的示 意图 ； 0013 图 3 是 X 线辐照对红细胞质量的影响示意图。 具体实施方式 0014 下面通过具体实施方式对本发明作进一步阐述， 实施例将帮助更好地理解本发 明， 但本发明并不仅仅局限于下述实施例。 0015 本发明所述的这种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂的肝肿瘤细胞并保存 红细胞质量的方法， 该方法包括如。
12、下步骤 ： 0016 (1)、 HepG2， SK-Hep1 和 Huh7 肝肿瘤细胞株分别与经过血液回收机浓缩后的红细 胞混合混匀， 混匀后肝肿瘤细胞密度为 5106/ml， 混合细胞在 2-8条件下将运输至放疗 科 ； 0017 (2)、 将混合细胞放置于血液辐照容器， 设置箱子距离辐照源为 60cm， 辐照面积为 4040cm2； 使用医用直线加速器进行 30Gy 辐照， 该直线加速器能量为 6MeV ； 0018 (3)、 辐照后使用密度为1.063g/ml的Percoll行密度梯度离心法分离肿瘤细胞株 和红细胞。采用 MTT 法、 EdU 法、 平板克隆形成法、 裸鼠皮下移植瘤模型检。
13、测辐照后肿瘤细 胞株的增殖活力、 DNA复制、 克隆性、 成瘤性 ； 同时检测辐照后红细胞的Na+-K+-ATPase活性， 2,3- 二磷酸甘油酸 (2,3-DPG) 水平， 游离血红蛋白 (free Hb) 水平， 渗透脆性， 及血气值变 化。 0019 对比实验 ： 0020 (1)、 HepG2， SK-Hep1 和 Huh7 肝肿瘤细胞株分别与经过血液回收机浓缩后的 红细胞混合混匀， 肝肿瘤细胞接种密度为 5106/ml， (n 14)， 混合细胞分 ： A( 对照 组 )， B(30Gy)， C(50Gy)。2-8条件下运输至我院放疗科， 使用线性加速器 (Varian 说 明 书。
14、 CN 106166328 A 4 3/3 页 5 Trilogy,USA)， 能量为 6MeV。 0021 (2)、 B 组 或 C 组 放 置 于 血 液 辐 照 容 器，其 材 质 为 聚 酸 甲 酯，大 小 为 24245.5cm3， 箱子顶和壁为1cm厚， 底为0.5cm。 设置箱子距离辐照源为60cm， 辐照面积 为 4040cm2。B 组或 C 组使用医用直线加速器 (Varian Trilogy,USA) 行 30Gy 或 50Gy 辐 照， 该直线加速器能量为 6MeV， A 组不辐照 ； 0022 (3)、 辐照后使用密度为1.063g/ml的Percoll行密度梯度离心法。
15、分离肿瘤细胞株 和红细胞。 采用MTT法、 EdU法、 平板克隆形成法、 裸鼠皮下移植瘤模型检测辐照后肿瘤细胞 株的增殖活力、 DNA 复制、 克隆性、 成瘤性。同时检测辐照后红细胞的 Na+-K+-ATPase 活性， 2,3- 二磷酸甘油酸 (2,3-DPG) 水平， 游离血红蛋白 (free Hb) 水平， 渗透脆性， 及血气值变 化。 0023 其中， 图 1X 线辐照对肿瘤细胞的克隆形成的杀灭作用。A 三株肿瘤细胞的未辐照 组第 7 天的克隆形成 Giemsa 染色图片 ； B 三株肿瘤细胞第 14 的克隆形成的统计图。 0024 图 2X 线 辐 照 对 肿 瘤 细 胞 的 皮 下。
16、 移 植 瘤 形 成 的 杀 灭 作 用。 各 辐 照 剂 量 HepG2(A),Huh7(B), 和 SK-Hep1(C) 细胞接种裸鼠后裸鼠体重的变化， D 三株肿瘤细胞未辐 照组接种裸鼠后， 皮下移植瘤体积的变化。 0025 图 3X 线辐照对红细胞质量的影响。各辐照组红细胞 ATP(A)， 2,3-DPG(B)， free Hb(C) 及渗透脆性 (D)。30Gy X 线辐照对回收红细胞 ATP， 2,3-DPG， free Hb 及渗透脆性均 没有明显影响 ； 而 50Gy X 线辐照对回收红细胞的渗透脆性有明显影响。 0026 结果 ： 线性加速器 30Gy 可以有效抑制 HepG。
17、2， SK-Hep1 和 Huh7 肝肿瘤细胞的 DNA 复制、 克隆性及成瘤性， 并对红细胞的携氧能力、 膜完整性、 渗透脆性均无明显影响。 0027 结论 ： 线性加速器 30Gy 有效且安全的灭活混杂在回收红细胞中的 HepG2， SK-Hep1 和 Huh7 肝肿瘤细胞并保存红细胞质量。使用 X 射线的线性加速器与血液辐照仪 射线放 射源相比有更多优势， 不仅更有效的以更低剂量灭活肝肿瘤细胞 ； 而且不是活性放射源， 对 操作员更安全 ； 同时不需要运输至血液中心进行辐照， 节约了成本 / 时间。 0028 本发明将线性加速器用于回收自体血液中的肿瘤细胞的灭活及对红细胞影响。 本 发明。
18、为寻求有效的肿瘤手术自体血液回收中混杂肿瘤细胞的去除方法提供了可靠的临床 前实验依据， 也为我国临床医学界进一步研究自体血液回收在肿瘤手术中的应用进行了有 益的探索。 0029 以上所述， 仅是本发明的最佳实施例， 并非对本发明作任何形式上的限制。 任何熟 悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明技术方案范围内， 均能利用上述技术内容作出些许 更改， 得到等效的实施例， 但凡是未脱离本发明技术方案的内容， 依据本发明的技术实质对 以上实施例所作的简单修改、 等同变化， 均属于本发明技术方案的保护范围内。 说 明 书 CN 106166328 A 5 1/2 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 106166328 A 6 2/2 页 7 图 3 说 明 书 附 图 CN 106166328 A 7 。