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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610511681.7 (22)申请日 2016.07.04 (71)申请人 拜欧迪赛尔 （北京） 生物科技有限公 司 地址 100176 北京市北京经济技术开发区 凉水河二街8号院13号楼6层601A (72)发明人 史真 史伟云 (51)Int.Cl. A01N 1/02(2006.01) (54)发明名称 一种无血清成分的眼角膜中期保存液 (57)摘要 本发明涉及一种无血清成分的眼角膜中期 保存液， 其成分为： 复方电解质眼内冲洗液， 氯化 钠， 硫酸镁， 磷酸二氢钾。
2、， 硫酸软骨素， 玻璃酸钠， HEPES缓冲液， 盐酸地塞米松， 还原型谷胱苷肽， 左氧氟沙星； 是一种具有特定电解质离子浓度， pH值， 晶体渗透压和胶体渗透压的微红色、 透明 液体。 该角膜保存液所需原料易得， 不含血清成 分， 避免了传染某些特殊病毒的风险， 其以各种 离子来平衡细胞内、 外液的渗透压， 保存效果显 著。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 106135197 A 2016.11.23 CN 106135197 A 1.一种无血清成分的眼角膜中期保存液， 其成分及含量如下： (1)复方电解质眼内冲洗液； (2)氯化钠2.34-2.92g/L； (3)硫酸镁0.6-。
3、0.72g/L； (4)磷酸二氢钾2.72-4.08g/L； (5)硫酸软骨素25-30g/L； (6)玻璃酸钠5-10g/L； (7)HEPES缓冲液20-25ml/L； (8)盐酸地塞米松1-2mg/L； (9)还原型谷胱苷肽1.5-3g/L； (10)左氧氟沙星0.1-0.2g/L。 2.如权利要求1所述的眼角膜中期保存液， 其母液为复方电解质眼内冲洗液。 3.如权利要求1所述的眼角膜中期保存液的晶体渗透压在330-380mOsm/kg H2O之间， 通 过合理组合氯化钠、 硫酸镁和磷酸二氢钾的含量来维持。 4.如权利要求1所述的眼角膜中期保存液的胶体渗透压310-350mOsm/kg 。
4、H2O之间， 通过 选择和配比硫酸软骨素、 玻璃酸钠的含量来维持。 5.如权利要求1所述的眼角膜中期保存液， 应用盐酸地塞米松和还原型谷胱苷肽维持 细胞膜的稳定性， 可保存角膜内皮细胞活性的达2周。 6.如权利要求1所述的组织保存保护液， 以20ml为一个瓶装单位， 用于单片眼角膜组织 的保存。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106135197 A 2 一种无血清成分的眼角膜中期保存液 技术领域 0001 本发明属于化学组合物技术领域， 具体为一种无血清成分的眼角膜中期保存液及 其制备方法和应用。 背景技术 0002 眼角膜的保存方法在临床应用方面多为活性保存。 常见的角膜的活性保。
5、存(眼库 的重要技术之一)根据角膜内皮细胞的活性的保存时间可分为短期、 中期、 长期3种。 短期保 存方法是将角膜组织无菌处理后湿房4保存， 保存时间在24小时之内。 中期保存一般采用 保存液保存， 使用目前世界范围内最常用的是角膜活性保存液， 如Optisol， 可保存角膜内 皮细胞活性达14天。 长期保存， 如器官培养法， 可保存角膜组织活性4周， 以用于临床。 0003 鉴于短期保存的保存时间过于短暂， 长期保存法的方法复杂， 所需设备昂贵， 不易 推广应用， 所以用角膜保存液进行中期保存是当前最受认可的方法和研制的热点。 然而很 多中期保存液内用血清成分来维持组织的营养和细胞内外液的平。
6、衡， 虽有一定效用， 但存 在传染某些特殊病毒的风险。 因而应用不含生物成分(血清)的各种离子来平衡细胞内、 外 液的渗透压是开发新型角膜保存液的方向。 0004 我国角膜活性保存液如今仍依赖于进口， 如最常使用的Optisol保存液， 虽然在保 持角膜内皮细胞活性方面功能显著， 但价格昂贵， 且由于国内无此产品的经销， 无法推广应 用。 因此， 我国目前多应用短期方法保存角膜， 这使得原本就严重匮乏的角膜供体材料来源 因保存问题更添危机。 由此可见， 研制理想的， 并符合我国国情的新型角膜中期保存液以最 大限度的利用有限的供体材料是亟待解决的问题。 0005 角膜保存液的研发， 对我国眼库的。
7、建设将起到重要作用， 将有利于角膜供体的保 存， 以及其在单位间、 地区间合理流动， 并对于充分合理的利用珍贵的角膜供体资源， 救治 更多的眼疾病患具有非常重要的意义。 发明内容 0006 本发明提供了一种不含血清成分、 以特定电解质离子浓度来维持角膜细胞内外压 平衡的眼角膜中期保存液的制备方案。 0007 本发明所述的眼角膜保存液其成分为： 0008 1、 复方电解质眼内冲洗液作为保存液母液； 0009 2、 氯化钠2.34-2.92g/L、 硫酸镁0.6-0.72g/L， 磷酸二氢钾2.72-4.08g/L， 使晶体 渗透压维持在330-380mOsm/kgH2O之间； 0010 3、 硫。
8、酸软骨素25-30g/L， 玻璃酸钠5-10g/L， 来维持其液体的胶体渗透压为310- 350mOsm/kg H2O之间。 由于硫酸软骨素、 玻璃酸钠的协同作用， 可以减少角膜保存液中的负 电荷， 同时保持一定的胶体渗透压， 使被保存的眼角膜在保存期不发生水肿； 0011 4、 盐酸地塞米松1-2mg/L， 还原型谷胱苷肽1.5-3g/L， 以稳定角膜细胞溶酶体膜及 生物膜， 增强细胞对内毒素的抵御能力， 更好地保持角膜细胞的形态和功能； 说 明 书 1/3 页 3 CN 106135197 A 3 0012 5、 HEPES缓冲液20-25ml/L， 用以调节pH值为7.2-7.5； 00。
9、13 6、 左氧氟沙星0.1-0.2g/L， 用以杀灭供体携带的革蓝氏阳性和阴性的病原菌。 0014 本发明所述的角膜保存液为微红色、 透明液体； 以20ml为一个瓶装单位， 用于单片 角膜的保存。 附图说明 0015 图1人新鲜角膜放入角膜保存液0天， 眼库用角膜内皮镜检测， 内皮细胞数2300个/ mm2 0016 图2人新鲜角膜放入角膜保存液14天， 眼库用角膜内皮镜检测， 内皮细胞数2100 个/mm2 0017 图3人新鲜角膜放入角膜保存液0天， 茜苏红染色， 50角膜内皮细胞为较典型的 六边形， 细胞数2350个/mm2 0018 图4人新鲜角膜放入角膜保存液14天， 茜苏红和胎盼。
10、蓝联合染色， 45角膜内皮细 胞为较典型的六边形， 约8-10内皮细胞核着色， 说明细胞已失去活性， 细胞数2150个/mm2 0019 图5猫鲜角膜放入角膜保存液14天， 茜苏红染色， 65角膜内皮细胞为较典型的五 边形， 细胞数4150个/mm2 具体实施方式 0020 下面通过实施例对本发明进行具体的描述， 这些实施例只用于进一步详述说明本 发明， 不能理解为对本发明保护范围的限定， 在本发明保护范围之内做出非本质的调整需 本发明方授权。 0021 本发明的实施例1 0022 角膜保存液的制备： 0023 1、 复方电解质眼内冲洗液500ml作为母液待用； 0024 2、 取硫酸软骨素2。
11、5g加入去离子水275ml加热溶解高压灭菌， 制成硫酸软骨素溶 液； 氯化钠2.93g、 硫酸镁0.6g， 磷酸二氢钾2.72g加入注射用水100ml溶解高压灭菌， 制成钠 镁钾盐溶液； 玻璃酸钠5g， 加入注射用水100ml溶解高压灭菌， 制成玻璃酸钠溶液； 0025 3、 取无菌容器加入复方电解质眼内冲洗液500ml， 高压灭菌硫酸软骨素275ml， 钠 镁钾盐溶液100ml， 玻璃酸钠溶液100ml； 加入还原型谷胱苷肽3g， 地塞米松注射液1.5mg， 左 氧氟沙星注射液0.2g混匀； 0026 4、 Hepes缓冲液调节PH值至7.2 0027 5、 调节晶体渗透压为340mOsm/。
12、kgH2O； 0028 6、 调节胶体渗透压为350mOsm/kgH2O； 0029 7、 分装为每20ml的保存瓶中， 4度冷藏备用。 0030 本发明的实施例2 0031 对角膜保存液的效果检测： 0032 1、 取新鲜(宰后2小时内取得)猪眼球， 无菌处理， 并剪取带1-2mm巩膜缘的全角膜， 分别置于20ml实施例1制备的角膜保存液和20ml作为对照的Optisol角膜活性保存液中； 0033 2、 于4条件下保存3天、 7天和14天， 以备对保存效果检测。 说 明 书 2/3 页 4 CN 106135197 A 4 0034 3、 于保存3天取出角膜片， 行锥兰染色， 结果发现角膜。
13、活性保存液保存的角膜内皮 细胞的数量、 六边形态及角膜的透明度与对照的Optisol角膜活性保存液之间没有差别； 0035 4、 于保存1周时取出角膜片， 行锥兰染色， 结果发现角膜活性保存液保存的角膜内 皮细胞的数量、 六边形态及角膜的透明度与对照的Optisol角膜活性保存液之间没有差别； 0036 5、 于保存至2周时取出角膜片， 行锥兰染色， 结果发现角膜活性保存液保存的角膜 内皮细胞的数量、 六边形态及角膜的透明度在与对照的Optisol角膜活性保存液之间没有 差别， 角膜活性保存液组内皮细胞的数量下降， 但角膜片内皮细胞数在1800个/mm2以上， 角 膜透明度良好。 0037 本。
14、发明的实施例3 0038 角膜中期保存液保存猫角膜用穿透性角膜移植： 0039 1、 取新鲜(宰后2小时内取得)猫角膜植片于实施例1所配角膜保存液中， 4冷藏 保存2周， 待移植； 0040 2、 健康家猫6只， 行麻醉后， 常规应用直径7.0mm环钻， 钻切中央角膜； 切下角膜后， 取保存2周的猫角膜植片置于切割枕上， 用7.25mm直径的环钻从内皮面钻取植片， 覆盖在猫 角膜植孔上， 10/0尼龙缝线间断缝合， 水密形成前房； 0041 3、 术后1天、 3天、 5天、 7天及14天用裂隙灯观察角膜植片透明度， 14天用角膜内皮 镜检测角膜植片内皮数； 结果发现， 术后1-3天， 植片透明。
15、， 轻度水肿， 术后5天， 植片透明度 一直保持良好， 术后14天， 角膜内皮镜检查内皮细胞数均在1800个/mm2以上。 0042 本发明的实施例4 0043 人新鲜角膜保存后的角膜内皮细胞密度及角膜内皮细胞形态的检查： 0044 1、 人角膜组织(各种原因死亡的捐献者， 6小时内取材)共40例， 放置于眼库用角膜 保存瓶内， 每个角膜材料均使用20ml保存液， 其中20片角膜放入实施例1所配保存液中， 另 20片放入进口的Optisol角膜中期保存液， 封口膜封好瓶口， 放于4冰箱保存。 0045 2、 使用眼库专用内皮显微镜对角膜材料进行监测， 进行内皮细胞计数和形体分 析， 检测时间点。
16、分别为0天、 1天、 3天、 7天和14天。 0046 3、 结果发现， 保存时间7天， 角膜内皮细胞密度与0天无统计学差异。 在保存14天 后， 角膜内皮细胞计数为225232(个/mm2)； 内皮细胞六边行比率从0天的45， 到14天的 32； 角膜内皮细胞死亡率为(9.104.4)。 本发明的保存液和Optisol角膜中期保存液 的效用没有差别。 使用该实施例1所配角膜中期保存液存放角膜期间， 角膜内皮细胞活性稳 定， 变化较小。 0047 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 3/3 页 5 CN 106135197 A 5 图1 图2 图3 图4 图5 说 明 书 附 图 1/1 页 6 CN 106135197 A 6 。