《一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610764150.9 (22)申请日 2016.08.30 (71)申请人 中国科学院昆明植物研究所 地址 650201 云南省昆明市盘龙区黑龙潭 蓝黑路132号 (72)发明人 李唯奇 林亮 徐倩 贾艳霞 (74)专利代理机构 北京国智京通知识产权代理 有限公司 11501 代理人 孙文彬 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属 植物的方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用细胞薄层培养高效 。
2、组培虾脊兰属植物的方法， 包括以下步骤： 配制 类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培 养基， 并进行灭菌处理； 采用类圆球茎诱导培养 基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎的细 胞薄层进行培养； 采用新类圆球茎培养成苗培养 基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培 养成苗进行培养， 制备得到剑叶虾脊兰和细花虾 脊兰组培苗； 将剑叶虾脊兰和细花虾脊兰组培苗 移栽至基质中生长良好， 植株成活率达90以 上。 本发明可以大大缩短虾脊兰属植物的组培成 苗时间。 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 CN 106386481 A 2017.02.15 CN 106386481 A 1.一种利用细胞薄层。
3、培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)配制类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培养基， 并进行灭菌处理； 2)采用外植体节段诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的外植体节段进行诱导， 产 生最初的类圆球茎； 3)采用类圆球茎诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎的细胞薄层进行 培养； 4)采用新类圆球茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培养成 苗进行培养， 制备得到剑叶虾脊兰和细花虾脊兰组培苗。 2.根据权利要求1所述的利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 其特征在 于， 所述步骤1)中的类圆球茎诱导培养基具体为： 添加2(w/v)蔗。
4、糖和0 .3(w/v) Phytagel的VW培养基或添加2(w/v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel和0.1(w/v)活性炭的VW 培养基； 以上培养基的pH值为5.8。 3.根据权利要求1所述的利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 其特征在 于， 所述步骤1)中的新类圆球茎培养成苗培养基具体为： 均以VW培养基为基础培养基， 添加 2(w/v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel和0.1(w/v)活性炭； 或者， 添加2(w/v)蔗糖、 0.3 (w/v)Phytagel、 1.0mg/L吲哚丁酸和0.1(w/v)活性炭； 或者， 添加2(w/v)蔗糖、 0.3 (w/。
5、v)Phytagel、 1.0mg/L6苄基腺嘌呤和0.1(w/v)活性炭； 或者， 添加2(w/v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel、 1.0mg/L IBA、 1.0mg/L 6-BA和0.1(w/v)活性炭； 以上培养基的pH 值为5.8。 4.根据权利要求1所述的利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 其特征在 于， 所述步骤1)中的灭菌处理具体为： 将类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培养 基放入培养瓶中并及时放入高压灭菌锅内灭菌， 灭菌条件为： 121、 105kPa下灭菌25分钟， 灭好菌后及时取出倒入培养皿中， 冷却备用。 5.根据权利要求1所述的利用细胞薄层。
6、培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 其特征在 于， 所述步骤2)中的外植体节段诱导培养基具体为： 添加0.06M蔗糖、 2.27 M thidiazuron 和0.3(w/v)Phytagel的VW培养基， 以上培养基的pH值为5.8。 6.根据权利要求1所述的利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 其特征在 于， 所述步骤2)中的由外植体节段诱导产生最初类圆球茎的过程具体为： 从剑叶虾脊兰和 细叶虾脊兰离体植株上切取2毫米长的节段作为外植体， 将节段在无菌条件下接入外植体 节段诱导培养基； 培养条件为25， 14/10h光/暗交替的光照周期， 光强为40 mol m-2s-1。 7.根据。
7、权利要求1所述的利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 其特征在 于， 所述步骤3)中的采用类圆球茎诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎的细 胞薄层进行培养具体为： 在体视显微镜下， 用无菌的镊子和手术刀徒手制备类圆球茎细胞 薄层， 将剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎做横切， 得到厚度为0.6毫米的细胞薄层， 将 细胞薄层转入类圆球茎诱导培养基中培养。 8.根据权利要求1所述的利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 其特征在 于， 所述步骤4)中的采用新类圆球茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细叶虾脊兰的新类圆 球茎培养成苗进行培养的培养条件具体为： 温度25， 光照时间每天1。
8、2小时， 光照强度1500 2000lx， 培养时间共4个月， 培养期间要随时检查， 发现污染的要及时去除。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106386481 A 2 一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 具体地说， 涉及一种利用细胞薄层培养高效组培 虾脊兰属植物的方法。 背景技术 0002 植物薄层细胞培养(thin cell layer culture)技术是20世纪70年代发展起来的 实验技术， 最早是Tran以烟草的表皮细胞作为外植体培养材料并获得了根和芽的分化， 并 用它来研究器官发生的机理； 一些研究把这一技术。
9、应用到植物组织12mm的薄层切片培养 上， 进而应用到一些植物的基因工程中。 0003 细花虾脊兰(Calanthe mannii)， 根状茎不明显， 假鳞茎粗短， 圆锥形， 叶在花期尚 未展开， 折扇状， 倒披针形或有时长圆形， 花葶从假茎上端的叶间抽出， 直立， 高出叶层外， 总状花序长410厘米， 疏生或密生10余朵小花， 花小， 花期5月。 剑叶虾脊兰是兰科虾脊兰 属植物， 具根状茎或假鳞茎。 叶的大小、 花色和唇瓣的形状、 结构常有较大的变化， 其中多数 种类可供观赏， 是切花或盆花的良好材料， 具有一定的开发前景。 虾脊兰用种子或分株法繁 殖， 其种子在自然条件下极难萌发， 自然繁。
10、殖率低。 发明内容 0004 有鉴于此， 本发明针对上述的问题， 提供了一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊 兰属植物的方法， 本方法采用组织培养方法， 可以提供大量种苗， 为此， 利用细胞薄层培养 虾脊兰属植物的技术将具有较高的价值和意义。 0005 为了解决上述技术问题， 本发明公开了一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属 植物的方法， 包括以下步骤： 0006 1)配制类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培养基， 并进行灭菌处理； 0007 2)采用外植体节段诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的外植体节段进行诱 导， 产生最初的类圆球茎； 0008 3)采用类圆球茎诱导培养基对剑叶虾脊兰和细。
11、花虾脊兰的类圆球茎的细胞薄层 进行培养； 0009 4)采用新类圆球茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培 养成苗进行培养， 制备得到剑叶虾脊兰和细花虾脊兰组培苗。 0010 进一步地， 步骤1)中的类圆球茎诱导培养基具体为： 添加2(w/v)蔗糖和0.3 (w/v)Phytagel的VW培养基或添加2(w/v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel和0.1(w/v)活性 炭的VW培养基； 以上培养基的pH值为5.8。 0011 进一步地， 步骤1)中的新类圆球茎培养成苗培养基具体为： 均以VW培养基为基础 培养基， 添加2(w/v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel和。
12、0.1(w/v)活性炭； 或者， 添加2(w/ v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel、 1.0mg/L吲哚丁酸和0.1(w/v)活性炭； 或者， 添加2(w/v) 蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel、 1.0mg/L6苄基腺嘌呤和0.1(w/v)活性炭； 或者， 添加2(w/ 说 明 书 1/7 页 3 CN 106386481 A 3 v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel、 1.0mg/L IBA、 1.0mg/L 6-BA和0.1(w/v)活性炭； 以上培养 基的pH值为5.8。 0012 进一步地， 步骤1)中的灭菌处理具体为： 将类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培 。
13、养成苗培养基放入培养瓶中并及时放入高压灭菌锅内灭菌， 灭菌条件为： 121、 105kPa下 灭菌25分钟， 灭好菌后及时取出倒入培养皿中， 冷却备用。 0013 进一步地， 步骤2)中的外植体节段诱导培养基具体为： 添加0.06M蔗糖、 2.27 M thidiazuron和0.3(w/v)Phytagel的VW培养基， 以上培养基的pH值为5.8。 0014 进一步地， 步骤2)中的由外植体节段诱导产生最初类圆球茎的过程具体为： 从剑 叶虾脊兰和细叶虾脊兰离体植株上切取大约2毫米长的节段作为外植体， 将节段在无菌条 件下接入外植体节段诱导培养基； 培养条件为25 C， 14/10h光/暗交。
14、替的光照周期， 光强为 40 mol m-2s-1。 0015 进一步地， 步骤3)中的采用类圆球茎诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类 圆球茎的细胞薄层进行培养具体为： 在体视显微镜下， 用无菌的镊子和手术刀徒手制备类 圆球茎细胞薄层， 将剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎做横切， 得到厚度为0.6毫米的细 胞薄层， 将细胞薄层转入类圆球茎诱导培养基中培养。 0016 进一步地， 步骤4)中的采用新类圆球茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细叶虾脊 兰的新类圆球茎培养成苗进行培养的培养条件具体为： 温度25， 光照时间每天12小时， 光 照强度15002000lx， 培养时间共4个月， 培养期间要。
15、随时检查， 发现污染的要及时去除。 0017 与现有技术相比， 本发明可以获得包括以下技术效果： 0018 1)最适宜的细胞薄层切片诱导培养基经过2个月的培养后， Calanthedavidii(剑 叶虾脊兰)和Calanthe mannii(细花虾脊兰)的细胞薄层存活率分别为88.9、 63.3； 细 胞薄层培养体系在两个月内的增值率分别为18.7、 14.5； 细胞薄层在培养基上产生新 类圆球茎的平均数量最高达4.4个新一代PLB； PLB在培养基上的成苗率为100。 0019 2)本发明可以大大缩短虾脊兰属植物的组培成苗时间。 0020 当然， 实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以。
16、上所述的所有技术效果。 附图说明 0021 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解， 构成本发明的一部分， 本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明， 并不构成对本发明的不当限定。 在附图中： 0022 图1是本发明两种兰科植物类圆球茎细胞薄层产生新类圆球茎的情况， 其中， a1-a 3是指剑叶虾脊兰细胞薄层在添加活性炭的VW培养基上产生新类圆球茎的情况； b1-b3是指 细花虾脊兰在添加活性炭的VW培养基上产生新类圆球茎。 具体实施方式 0023 以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式， 藉此对本发明如何应用技术手 段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。。
17、 0024 本发明提供一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 包括以下步 骤： 0025 1、 培养基准备 说 明 书 2/7 页 4 CN 106386481 A 4 0026 1)配制 0027 (1)类圆球茎诱导培养基的组成为添加2(w/v)蔗糖和0.3(w/v)Phytagel的VW 培养基或添加2(w/v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel和0.1(w/v)活性炭的VW培养基。 0028 (2)将剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培养成苗的培养基有四种， 均以VW 培养基为基础培养基： 2(w/v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel和0.1(w/v)活性炭； 2。
18、 (w/v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel、 1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)和0.1(w/v)活性炭； 2(w/ v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel、 1.0mg/L6苄基腺嘌呤(6-BA)和0.1(w/v)活性炭； 2(w/ v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel、 1.0mg/L IBA、 1.0mg/L 6-BA和0.1(w/v)活性炭。 培养基pH 值调节至5.8。 0029 2)灭菌 0030 将加入培养基的培养瓶及时放入高压灭菌锅内灭菌， 灭菌条件为： 121、 105kPa 下灭菌25分钟， 灭好菌后及时取出倒入培养皿中， 冷却备用； 0031 2.类。
19、圆球茎的诱导 0032 从 剑 叶 虾 脊 兰 和 细 花 虾 脊 兰 离 体 植 株 上 切 取 大 约 2 毫 米 长 的 节 段 (nodalsections)作为外植体， 用于类圆球茎的诱导。 将节段在无菌条件下接入添加了 0.06M蔗糖2.27 M thidiazuron(TDZ)和3gL-1phytagel的VW培养基(外植体节段诱导培养 基)。 培养条件为25， 14/10h(光/暗)的光照周期， 光强为40 mol m-2s-1。 0033 3、 通过细胞薄层培养扩繁类圆球茎剑叶虾脊兰和细花虾脊兰离体节段在含有TDZ 的VW培养基上可以诱导得到类圆球茎。 这些原球茎可以作为通过。
20、细胞薄层培养扩繁类圆球 茎的起始材料。 在体视显微镜下， 用无菌的镊子和手术刀徒手制备类圆球茎细胞薄层。 将剑 叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎做横切， 得到厚度大约为0.6毫米左右的细胞薄层。 将细 胞薄层转入类圆球茎诱导培养基中培养。 培养条件为25， 14/10h(光/暗)的光照周期， 光 强为40 mol m-2s-1。 一个类圆球茎可以获得5个大约0.5mm厚度的薄层切片。 在VW培养基上， 经过4周的培养， 大约89的薄层切片平均产生24个新的类圆球茎(图1)。 新产生的类圆球 茎可以用来切割薄层切片， 用于下一轮的细胞薄层培养。 这样， 经过三轮细胞薄层培养， 可 以得到1000倍。
21、的增值率。 0034 下面结合具体的实验数据来说明本发明的技术效果： 0035 1.类圆球茎的细胞薄层培养程序 0036 在体视显微镜下， 用无菌的镊子和手术刀徒手制备类圆球茎细胞薄层。 将剑叶虾 脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎做横切， 得到厚度大约为0.6毫米左右的细胞薄层。 将细胞薄 层转入类圆球茎诱导培养基中， 在上述培养室条件下培养。 类圆球茎诱导培养基的组成为 添加2(w/v)蔗糖和0.3(w/v)Phtagel的VW培养基或添加或2(w/v)蔗糖、 0.3(w/v) Phtagel和0.1(w/v)活性炭的VW培养基。 0037 在剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎诱导实验中， 每次实验。
22、包括3个重复， 每个 重复中包括20个类圆球茎细胞薄层。 每个实验重复三次， 培养2个月时在体视显微镜下进行 诱导情况统计。 存活率定义为类圆球茎细胞薄层经过2个月培养， 至少产生一个新类圆球 茎。 新类圆球茎发育出至少一片叶可记为分化的类圆球茎。 0038 在实验中发现， 类圆球茎薄层在培养过程中有褐化现象。 褐化导致了一些外植体 的生长抑制。 在后续实验中， 以在改良VW培养基中添加活性炭来减少褐化现象。 但由于活性 说 明 书 3/7 页 5 CN 106386481 A 5 炭的加入在组织培养体系中可能有多种作用， 我们也检测了活性炭的加入对体系的影响。 剑叶虾脊兰类圆球茎薄层切片在V。
23、W培养基和添加活性炭的VW培养基上存活率分别为 88.9和81.7(表1)。 细花虾脊兰类圆球茎薄层切片在VW培养基和添加活性炭的VW培养 基上存活率分别为63.3和62.2(表1)。 细胞薄层各自在VW培养基和添加活性炭的vw培 养基上存活率没有显著差异， 显示活性炭的添加并不影响细胞薄层的存活率。 实验中也发 现， 在添加活性炭的VW培养基上， 细胞薄层颜色更绿， 显示活力更好。 剑叶虾脊兰类圆球茎 薄层切片在VW培养基和添加活性炭的VW培养基上分别平均产生4.4和3.7个新一代PL(表 2)。 细花虾脊兰类圆球茎薄层切片在VW培养基和添加活性炭的VW的培养基上平均产生4.5 和3.5个新。
24、一代PLB(表2)。 0039 两种兰科植物类圆球茎细胞薄层产生新类圆球茎的情况可以大体分为三类。 第一 类是单个类圆球茎细胞薄层产生单个新类圆球茎， 包括首先产生一个新类圆球茎并快速发 育， 后期再产生新类圆球茎的情况。 这种情况下剑叶虾脊兰新类圆球形态规则， 发育快速， 在2个月的培养期结束时一般可以产生叶和根(图1-a1)。 细花虾脊兰的新类圆球茎则相对 发育缓慢， 尽管体积增大， 但不发育叶和根(图1-b)。 第二种情况是单个细胞薄层产生2-5个 类圆球茎。 这种情况下， 新的类圆球茎大体在同一时期产生， 发育阶段比较一致； 形态规则 而基本没有粘连在一起的情况(图1-a2)。 第三种。
25、情况是单个细胞薄层产生多于5个新类圆 球茎。 这种情况下， 新类圆球茎数量非常多， 有相互粘连的情况， 发育阶段差异也比较大(图 1a3)。 在2个月培养期结束时， 需要将新类圆球茎进分离和进一步培养才可以用于组织培 养。 0040 2.新一代类圆球茎的分化情况 0041 类圆球茎薄层切片在VW培养基和VW添加活性炭的培养基上两个月的培养过程中， 不断有新的类圆球茎形成并不断发育。 以新的类圆球茎发育出叶片计为分化， 则可以计算 新的类圆球茎分化的比例。 剑叶虾脊兰新类圆球茎在VW培养基和VW添加活性炭的培养基上 分化的比例为3.6和10.6， 细花虾脊兰新类圆球茎在VW培养基和VW添加活性炭。
26、的培养 基上都表现为不分化(表3)。 根据兰科植物单个类圆球茎可以制备的细胞薄层的数量， 细胞 薄层的存活率， 细胞薄层产生的平均新类圆球茎数量可以计算2个月内的增值率。 在通常情 况下， 剑叶虾脊兰和细花虾脊兰单个类圆球茎可以制备的细胞薄层的数量均为5片。 根据细 胞薄层的存活率， 细胞薄层产生的平均新类圆球茎数量， 可以得到两个月的增值率。 剑叶虾 脊兰在VW培养基和VW添加活性炭的培养基上的增值率分别为18.7和15.2倍， 细花虾脊兰在 VW培养基和VW添加活性炭的培养基上的增值率分别为14.5和11.0倍(表4)。 0042 表1细胞薄层在VW培养基和添加活性炭的VW培养基上产生新类。
27、圆球茎的比例 0043 0044 表2细胞薄层在VW培养基和添加活性炭的VW培养基上产生新类圆球茎的平均数量 说 明 书 4/7 页 6 CN 106386481 A 6 0045 0046 表3新类圆球茎在VW培养基和添加活性炭的培养基上的分化比例 0047 0048 表4细胞薄层培养体系在两个月内的增值率 0049 0050 实施例1 0051 一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 包括以下步骤： 0052 1)配制类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培养基， 将类圆球茎诱导培养 基和新类圆球茎培养成苗培养基放入培养瓶中并及时放入高压灭菌锅内灭菌， 灭菌条件 为： 121、 。
28、105kPa下灭菌25分钟， 灭好菌后及时取出倒入培养皿中， 冷却备用； 0053 其中， 类圆球茎诱导培养基具体为： 添加2(w/v)蔗糖和0.3(w/v)Phytagel的 VW培养基， 以上培养基的pH值为5.8； 0054 新类圆球茎培养成苗培养基具体为： 以VW培养基为基础培养基， 添加2(w/v)蔗 糖、 0.3(w/v)Phytagel和0.1(w/v)活性炭； 培养基的pH值为5.8； 0055 2)采用外植体节段诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的外植体节段进行诱 导， 产生最初的类圆球茎： 从剑叶虾脊兰和细叶虾脊兰离体植株上切取2毫米长的节段作为 外植体， 将节段在无菌条件。
29、下接入外植体节段诱导培养基； 培养条件为25， 14/10h光/暗 交替的光照周期， 光强为40 molm-2s-1； 其中， 外植体节段诱导培养基具体为： 添加0.06M蔗 糖、 2.27 Mthidiazuron(TDZ)和0.3(w/v)Phytagel的VW培养基， 以上培养基的pH值为 5.8。 0056 3)在体视显微镜下， 用无菌的镊子和手术刀徒手制备类圆球茎细胞薄层， 将剑叶 虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎做横切， 得到厚度为0.6毫米的细胞薄层， 将细胞薄层转入 类圆球茎诱导培养基中培养； 说 明 书 5/7 页 7 CN 106386481 A 7 0057 4)采用新类圆球。
30、茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培 养成苗进行培养， 制备得到剑叶虾脊兰和细花虾脊兰组培苗。 0058 实施例2 0059 一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 包括以下步骤： 0060 1)配制类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培养基， 将类圆球茎诱导培养 基和新类圆球茎培养成苗培养基放入培养瓶中并及时放入高压灭菌锅内灭菌， 灭菌条件 为： 121、 105kPa下灭菌25分钟， 灭好菌后及时取出倒入培养皿中， 冷却备用； 0061 其中， 类圆球茎诱导培养基具体为： 添加2(w/v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel和 0.1(w/v)活性炭的VW。
31、培养基； 培养基的pH值为5.8； 0062 新类圆球茎培养成苗培养基具体为： 以VW培养基为基础培养基， 添加2(w/v)蔗 糖、 0.3(w/v)Phytagel、 1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)和0.1(w/v)活性炭； 培养基的pH值为 5.8； 0063 2)采用外植体节段诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的外植体节段进行诱 导， 产生最初的类圆球茎： 从剑叶虾脊兰和细叶虾脊兰离体植株上切取2毫米长的节段作为 外植体， 将节段在无菌条件下接入外植体节段诱导培养基； 培养条件为25， 14/10h光/暗 交替的光照周期， 光强为40 molm-2s-1； 其中， 外植体节段诱导培养基。
32、具体为： 添加0.06M蔗 糖、 2.27 Mthidiazuron(TDZ)和0.3(w/v)Phytagel的VW培养基， 以上培养基的pH值为 5.8。 0064 3)在体视显微镜下， 用无菌的镊子和手术刀徒手制备类圆球茎细胞薄层， 将剑叶 虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎做横切， 得到厚度为0.6毫米的细胞薄层， 将细胞薄层转入 类圆球茎诱导培养基中培养； 0065 4)采用新类圆球茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培 养成苗进行培养， 制备得到剑叶虾脊兰和细花虾脊兰组培苗。 0066 实施例3 0067 一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 包括以下步骤： 。
33、0068 1)配制类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培养基， 将类圆球茎诱导培养 基和新类圆球茎培养成苗培养基放入培养瓶中并及时放入高压灭菌锅内灭菌， 灭菌条件 为： 121、 105kPa下灭菌25分钟， 灭好菌后及时取出倒入培养皿中， 冷却备用； 0069 其中， 类圆球茎诱导培养基具体为： 添加2(w/v)蔗糖、 0.3(w/v)Phytagel和 0.1(w/v)活性炭的VW培养基； 培养基的pH值为5.8； 0070 新类圆球茎培养成苗培养基具体为： 以VW培养基为基础培养基， 添加2(w/v)蔗 糖、 0.3(w/v)Phytagel、 1.0mg/L6苄基腺嘌呤(6-BA)和。
34、0.1(w/v)活性炭； 培养基的pH值 为5.8； 0071 2)采用外植体节段诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的外植体节段进行诱 导， 产生最初的类圆球茎： 从剑叶虾脊兰和细叶虾脊兰离体植株上切取2毫米长的节段作为 外植体， 将节段在无菌条件下接入外植体节段诱导培养基； 培养条件为25， 14/10h光/暗 交替的光照周期， 光强为40 molm-2s-1； 其中， 外植体节段诱导培养基具体为： 添加0.06M蔗 糖、 2.27 Mthidiazuron(TDZ)和0.3(w/v)Phytagel的VW培养基， 以上培养基的pH值为 5.8。 说 明 书 6/7 页 8 CN 10638。
35、6481 A 8 0072 3)在体视显微镜下， 用无菌的镊子和手术刀徒手制备类圆球茎细胞薄层， 将剑叶 虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎做横切， 得到厚度为0.6毫米的细胞薄层， 将细胞薄层转入 类圆球茎诱导培养基中培养； 0073 4)采用新类圆球茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培 养成苗进行培养， 制备得到剑叶虾脊兰和细花虾脊兰组培苗。 0074 实施例4 0075 一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法， 包括以下步骤： 0076 1)配制类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培养基， 将类圆球茎诱导培养 基和新类圆球茎培养成苗培养基放入培养瓶中并及时放入高压灭。
36、菌锅内灭菌， 灭菌条件 为： 121、 105kPa下灭菌25分钟， 灭好菌后及时取出倒入培养皿中， 冷却备用； 0077 其中， 类圆球茎诱导培养基具体为： 添加2(w/v)蔗糖和0.3(w/v)Phytagel的 VW培养基； 培养基的pH值为5.8； 0078 新类圆球茎培养成苗培养基具体为： 以VW培养基为基础培养基， 添加2(w/v)蔗 糖、 0.3(w/v)Phytagel、 1.0mg/L IBA、 1.0mg/L 6-BA和0.1(w/v)活性炭； 培养基的pH值 为5.8； 0079 2)采用外植体节段诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的外植体节段进行诱 导， 产生最初的类圆。
37、球茎： 从剑叶虾脊兰和细叶虾脊兰离体植株上切取2毫米长的节段作为 外植体， 将节段在无菌条件下接入外植体节段诱导培养基； 培养条件为25， 14/10h光/暗 交替的光照周期， 光强为40 molm-2s-1； 其中， 外植体节段诱导培养基具体为： 添加0.06M蔗 糖、 2.27 Mthidiazuron(TDZ)和0.3(w/v)Phytagel的VW培养基， 以上培养基的pH值为 5.8。 0080 3)在体视显微镜下， 用无菌的镊子和手术刀徒手制备类圆球茎细胞薄层， 将剑叶 虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎做横切， 得到厚度为0.6毫米的细胞薄层， 将细胞薄层转入 类圆球茎诱导培养基中培养。
38、； 0081 4)采用新类圆球茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培 养成苗进行培养， 制备得到剑叶虾脊兰和细花虾脊兰组培苗。 0082 上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例， 但如前所述， 应当理解发明并非 局限于本文所披露的形式， 不应看作是对其他实施例的排除， 而可用于各种其他组合、 修改 和环境， 并能够在本文所述发明构想范围内， 通过上述教导或相关领域的技术或知识进行 改动。 而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围， 则都应在发明所附权 利要求的保护范围内。 说 明 书 7/7 页 9 CN 106386481 A 9 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 10 CN 106386481 A 10 。