本发明涉及董尼酮作为杀菌剂的应用以及含有适合这种应用的 董尼酮的组合物的制备方法。
真菌对杀菌剂产生抗性的能力意味着不断需要新的杀菌剂来防 治它们。已知某些萘醌及其衍生物具有杀菌活性，如US4970328 和US4929642。Jacobsen和Wengel(Pestic．Sci．，1986，17， 686-690)制备了呋喃氧邻位碳上具有一个或两个烷基取代基的1，4 -萘醌的呋喃衍生物，(A)和(B)，并对它们进行了进一步研究。发现 二烷基衍生物(B)具有中等杀菌活性，而单烷基衍生物(A)则无活 性；显然，这两个化合物的杀菌活性不如Jacobsen和wengel所研究 的一些非呋喃化合物。
本发明人现已发现，天然存在的萘醌杀菌衍生物董尼酮可用作杀 菌剂，它们具有优越的杀菌活性，尤其是对目前所用杀菌剂具有抗性 的菌株更是如此。天然杀菌剂的其它优点包括天然产物源和潜在的安 全性产品。
本发明的第一方面是提供了董尼酮作为杀菌剂的应用。董尼酮的 结构见式Ⅰ所示。还应当理解，由于董尼酮能够以不同对映体形式存 在，因而本发明不仅包括这些单一对映体而且还包括这些对映体的混 合物。董尼酮可从好望角苣苔属植物(Streptocarpus dunnii)或蒲 包花属植物(Calceolaria Integrifolia)的地上部分提取得到，或 者通过酸催化环合反应由Ⅱ或Ⅲ制备，其中的Ⅲ是利用甲醇和 氢氧化钾的水溶液由Ⅳ形成。
本发明的第二个方面是提供了杀菌组合物，该组合物包括载体和 作为活性成分的董尼酮。这一方面必定还包括制备这种组合物的方 法，即将董尼酮与至少一种载体混合。同样，可以设想，董尼酮的不 同对映体或对映体混合物可能会具有不同的活性水平或作用谱，因而 本发明组合物可能包括单一对映体或对映体混合物。
本发明组合物可以含有0．0001-0．1％(重量)式Ⅰ活性成分。 当组合物为用前混配型时，优选它们含有0．0002-0．075％(重量) 活性成分。然而，组合物也可以用前稀释的高浓度(例如高至95％) 浓缩物形式出售。
为制备本发明组合物，可以将董尼酮与各种合适的惰性载体如溶 剂、稀释剂和／或表面活性剂混合，形成粉剂，颗粒固体，可温性粉 剂或其它固体制剂或乳液，乳油，喷雾剂，气雾剂或其它液体制剂。 适宜的溶剂和稀释剂包括水，脂族或芳族烃如二甲苯或其它石油馏分 以及醇如乙醇。表面活性剂可以是阴离子、阳离子或非离子型的。其 中还可以包括抗氧化剂或其它稳定剂以及香料和着色剂。这些惰性载 体的类型和用量比与常规杀菌组合物中所用的相同。
除这些惰性载体外，本发明组合物中还可以包含一种或多种其它 活性成分。这些其它活性成分既可以为具有杀菌活性的其它化合物， 也可以为对本发明化合物显示出增效作用的其它化合物。
本发明的第三个方面提供了杀灭有害真菌的方法，该方法包括用 上面所述的董尼酮或组合物处理所述有害真菌侵袭的场所。优选的 是，上述场所包括真菌本身或这些真菌要侵袭或已侵袭的环境。
本发明用下列实施例进一步说明。 实施例1-制备董尼酮
Cooke早已描述过董尼酮的制备[自然，(1948)，163，178]。将 按照WO95／32176制得的2-[1，1-二甲基-2-丙烯基]-3-羟基 -1，4-萘醌(500mg，2．06mmol)溶于浓硫酸(10ml)，在室温下搅拌 10分钟，然后倾入冰水(100ml)内。该水混合物用乙醚提取(3× 50ml)，并将合并的乙醚层用水(2×50ml)和饱和氯化钠溶液(50ml) 洗涤，然后用硫酸镁干燥。过滤所得溶液，蒸除溶剂，产物用石油醚 (60-80℃)重结晶，得到橙-红色针状董尼酮(476mg)，mp98-99 ℃。 实施例2-提取董尼酮
从蒲包花属植物(Calceolaria Integrifolia)中提取董尼酮的 过程可按照Rüdi和Evgster的方法(Helvetica Chimica Acta，60， 945-947，(1977))进行。从好望角苣苔属植物(Streptocarpus dunnii)中提取董尼酮的过程可按照Price和Robinson的方法(J． Chem．Soc．，(1939)，1522)进行。 实施例3和4-测定董尼酮的抗真菌活性
研究董尼酮对体外条件下生长在14天苗龄幼苗上的真菌的抗真 菌活性。实施例3中所研究的真菌品系有小麦壳针孢(Septoria tritici)，大麦云纹孢(Rhynchosporium secalis)，玉蜀黍黑粉菌 (Ustilago maydis)，粗糙链孢雹(Neurospora crassa)，灰色葡萄 孢(Botrytis cinerea)，禾谷镰孢(Fusarium graminearum)，眼斑 病菌Pseudocercosporella herpotrichoides(eyespot)，禾白粉 菌(Erysiphe graminis f．sp hordei)。观察所研究化合物的剂量 水平对上述真菌品系菌落大小的作用并由此得出有关它们抗真菌活 性的结论。 实施例3-体外试验
将真菌菌落在马铃薯葡糖琼脂(PDA)上培养并生长，高压灭菌 并用所研究化合物处理，其中的马铃薯葡糖琼脂由贮存液(20mg ml-1) 在乙醇∶丙酮(1∶1)中制备。对于每一化合物，制备四倍稀释系列浓 度，剂量范围从20μg ml-1至0．08μg ml-1。对于仅以酵母状菌落形式 生长的真菌，其生长以最低抑制浓度(MIC)测定；对于其它品系， 根据菌落直径测定生长程度，并根据剂量响应曲线计算50％有效剂 量(ED50)值。在系列试验之一中，使用Czapek-DOX加真菌胨(1％w／v CDM)代替PDA。将每一种真菌在最佳温度下培养生长。并比较董尼酮 和作为对照物的已知抗真菌化合物的抗真菌活性。下表1(a)-(g) 所示的结果表明，测试化合物的抗真菌活性与所用菌株的性质有关。 董尼酮对小麦壳针孢(Septoria tritici)，大麦云纹孢 (Rhynchosporium secalis)和玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)具有 抵抗活性；董尼酮抗这些病原菌的活性水平与目前使用的唑类杀菌剂 相似或者优于它们。董尼酮还对灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)和 禾谷镰孢(Fusarinm graminearum)显示出某些活性；这两类病原菌 采用目前的唑类杀菌剂很难防治。另外还观察到显著的抗粗糙链孢雹 (Neurospora crassa)活性。 表1(a)小麦壳针孢(Septoria tritici) 灵敏度 MIC(μg／ml) 分离物 粉唑醇 董尼酮 S27 40 5 RL2 1 5 表1(b)大麦云纹孢(Rhynchosporium secalis) 灵敏度MIC(μg/m1) 分离物 多菌灵 唑菌醇 丙环唑 董尼酮 CDM琼脂 81 0.1 ＞50 2.0 5 86 0.1 3.2 0.4 ＞5 97 0.1 ＞50 ＞10 5 101 0.1 ＞50 ＞10 ＞5 110 0.1 ＞50 2.0 ＞5 115 0.1 1.6 0.08 20 117 0.1 12.5 2.0 5 118 0.1 ＞50 ＞10 20 120 100 ＞50 ＞10 20 PDA 810 0.1 ＞50 ＞10 20 表1(c)玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis) ED50(μg／ml) 分离物 董尼酮 ATCC-14826野生型 3.0 表1(d)粗糙链孢雹(Neurospora crassa) ED50(μg／ml) 分离物 董尼酮 Am 132a 2 表1(e)灰色葡萄孢(Botrytis cinerea) 灵敏度 ED50(μg／ml) 分离物 二甲酰亚胺 苯并咪唑 董尼酮 R3B6 R R ＞20 RW10 S S ＞20 S=敏感性；R=抗性 表1(f)禾谷镰孢(Fusarium graminearum) 灵敏度 ED50(μg／ml) 分离物 苯并咪唑 董尼酮 JF18 R 20 R=抗性 表1(g)眼斑病菌(Pseudocercosporella herpotrichoides) 灵敏度 ED50(μg／ml) 分离物 苯并咪唑 董尼酮 CR03A R 17 R=抗性 实施例4-进一步的体外试验
采用实施例3中所述方法测试董尼酮对黑色曲霉(Aspergillus niger)，稻瘟霉菌(Pyricularia oryzae)和茄属丝核菌 (Rhizoctonia solani)的分离物的杀菌活性。对于每一种处理，都 将每种真菌在培养皿中的琼脂上进行测试，一式四份，琼脂每个平板 中有三份复制型菌落(对于R．slani则一份)。将黑色曲霉(A．niger) 和茄属丝核菌(R．solani)在20-25℃培养4天；稻瘟霉菌(P．oryzae) 则培养7天。然后根据菌落直径的增加值测量菌落活性。
还对眼斑病菌(Pseudocercosporella herpotrichoides)的四 种分离物，即两种缓慢生长的R-型和两种快速生长的W-型分离物 用董尼酮进行了测试。每种类型中的一种分离物对诸如多菌灵和咪鲜 安之类的杀菌剂敏感，而另一种则为完全抗性。在20℃生长两周后 测量菌落直径。
还对马铃薯块茎病原菌茄病长蠕孢(Helminthosporium solani) 和硫色镰孢(Fusarium sulphureum)的四种分离物用董尼酮进行了试 验。每种病原菌中的两种分离物对杀菌剂涕必灵(TBZ)敏感，而其 它两种则具有一定程度的抗性。接着进行和眼斑病菌(P． Herpotrichoides)所用的相同步骤，但只是复制物在麦芽提取物琼 脂上生长，而且测量两次生长情况。
表2(a)至2(f)中所示的结果表明，董尼酮对黑色曲霉 (Aspergillus niger)，稻瘟霉菌(Pyricularia oryzae)和茄属丝核 菌(Rhizoctonia solani)具有活性。其抗眼斑病菌 (Pseudocercosporella herpotrichoides)活性是反复无常的。没 有证据表明董尼酮与多菌灵(表2(d))具有交互抗性，或与涕必灵对 茄病长蠕孢(H．solani)或硫色镰孢(F．sulphureum)具有交互抗性 (表2(e)和(f))。 表2(a)-董尼酮抗黑色曲霉(Aspergillus niger)活性 化合物 菌落直径生长的抑制％ 100 mg／l 20 mg／l 4 mg／l 1 mg／l 董尼酮 100 99 30 咪鲜安 97.1 表2(b)-董尼酮抗稻瘟霉菌(Pyricularia oryzae)活性 化合物 菌落直径生长的抑制％ 100 mg／l 20 mg／l 4 mg／l 1 mg／l 董尼酮 100 99 75 多菌灵 99.4 14.7 表2(c)-董尼酮抗茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)活性 化合物 菌落直径生长的抑制％ 100 mg／l 20 mg／l 4 mg／l 1 mg／l 董尼酮 100 93 37 多菌灵 81.2 3.3 表2(d)-董尼酮抗眼斑病菌(Pseudocercosporella herpotrichides)的W-型和R-型分离物的活性 真菌类型 对多菌灵的敏 感性 在5mg／ml用量下的活性 多菌灵 董尼酮 W-型 敏感 100 50 W-型 抗性 5 30 R-型 敏感 100 -15 R-型 抗性 -14 4 表2(e)-董尼酮对已对涕必灵(TBZ)具有不同程度抗性的茄病长蠕 孢(Helminthosporium solani)分离物的活性 分离物 在5mg/ml用量下的活性 8天 14天 涕必灵 董尼酮 涕必灵 董尼酮 S1 100 65 100 53 S2 100 63 100 86 R1 43 57 20 87 R2 100 70 100 56 S1，S2=对涕必灵敏感的分离物；R1，R2=对涕必灵具有抗性的分离 物。
表2(f)-董尼酮对已对涕必灵具有不同程度抗性的硫色镰孢 (Fusarium sulphureum)分离物的活性 分离物 在5mg/ml用量下的活性 8天 14天 涕必灵 董尼酮 涕必灵 董尼酮 S1 100 22 100 nd S2 100 11 100 5 R1 60 4 64 6 R2 70 16 70 12 S1，S2=对涕必灵敏感的分离物；R1，R2=对涕必灵具有抗性的分离 物。 nd=无数据；对照组培养基中的真菌菌落达到培养板的边缘。 实施例5-14天苗龄幼苗
在用禾白粉菌(Erysiphe graminis f．sp hordei)的分生孢子 接种之前，对14天苗龄幼苗喷淋24小时。将在稀吐温20溶液(1 滴吐温20／100ml水)中制得的董尼酮溶液喷雾到幼苗上；所用溶液 中董尼酮的最终浓度为0．75mg ml-1和0．075mg ml-1，前一种浓度 相当于三唑杀菌剂的大田施用量。对照组幼苗只喷洒吐温20溶液。 接种7天后根据叶面积感染的百分数评估禾白粉菌的生长情况。表3 中所给出的结果说明，董尼酮在低于目前所用的三唑杀菌剂的剂量水 平下仍具有有效的杀菌活性，而且不产生明显的药害。当处理某些种 类植物时，由于较高浓度可能会产生一些药害，因而优选使用低于 0．75mg ml-1的浓度。 表3-董尼酮对禾白粉菌(Erysiphe graminis f．sp hordei)生长的 影响 病害防治％ 分离物 唑菌醇 董尼酮(mg／ml) 0.75 0.075 23D5 S 100 45 212 R 100 50 S=敏感；R=抗性。