技术领域
本发明涉及分子生物学、细胞生物学以及医学领域。具体地，本发明涉及 利用肝细胞核因子1α(Hepatocyte Nuclear Factor-1α，HNF1α)诱导人体恶 性实体瘤细胞发生分化，从而应用于实体肿瘤治疗的方法和用途。
背景技术
恶性实体瘤的治疗是目前临床的难点之一，尤其对于手术无法切除的恶性 实体瘤，临床尚缺乏有效的治疗手段。选择与肿瘤细胞发生发展密切相关的关 键蛋白、分子和基因进行特异性靶向调控是恶性实体瘤治疗的核心问题之一。
肿瘤诱导分化治疗(differentiation therapy)是近20年来肿瘤临床治疗 方面的重要突破。诱导分化治疗是通过诱导分化方法促进肿瘤细胞向成熟阶段 分化，恢复正常的细胞表型和功能并抑制恶性肿瘤细胞的增殖。诱导分化治疗 打破了肿瘤发展不可逆的传统认识，有力的推动了整个癌症研究领域的发展。
我国学者曾率先运用全反式维甲酸诱导分化治疗急性早幼粒细胞性白血 病，取得了较好的疗效。然而，尽管白血病的分化治疗取得了很大进展，但恶 性实体瘤的分化治疗仍然是肿瘤治疗研究领域的难题。迄今为止，对于诸如肝 癌、胃癌、肠癌、肾癌以及胰腺癌等人体恶性实体肿瘤的诱导分化治疗仍未见 明确报道。迄今实验表明，全反式维甲酸对恶性实体瘤的分化无明显作用。
选择合适的药物或相关物质进行特异性靶向调控是肿瘤诱导分化治疗的难 点。有研究利用药物或蛋白体外调控实体肿瘤的分化状态，但效果有限。体内 实验大多提示：上述方法在诱导肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤组织坏死方面有一定 的作用，但是很难实现显著调控或逆转实体瘤低分化程度。
在众多候选物质中筛选出有效的诱导肿瘤分化的试剂是非常困难的，也是 收效甚微的。因此，选择出与肿瘤细胞诱导分化密切相关的关键蛋白、分子和 基因进行特异性靶向调控是肿瘤诱导分化治疗的核心问题之一。
近年来，随着人类基因组计划研究的不断深入，为人们利用基因技术手段 调控甚至改变细胞重要基因的表达以改变其表型、分化状态和生物学功能创造 了条件。然而，虽然已经证实有一些物质或基因在体外实验中可改善肿瘤细胞 的某些生物性特性(如增殖及克隆形成能力降低、部分正常细胞功能基因表达上 调)，一些物质甚至证实了可降低癌细胞在动物体内的成瘤作用，但是往往发现 这些物质对正常细胞也有影响(副作用)，并不能特异性地在体内诱导实体肿瘤 发生分化。本发明人曾研究了全反式维甲酸、生长抑素、肿瘤坏死因子以及三 氧化二砷等物质体外对肝癌细胞株分化的调控作用，均未筛选出有明确分化治 疗作用的药物或蛋白，同时体内研究也发现这些物质不能有效地诱导实体肿瘤 发生分化。
因此，本领域迫切需要开发与恶性实体瘤细胞诱导分化密切相关的特定蛋白 或基因，能够作为特异性调控的靶标，从而有效地诱导分化实体瘤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与恶性实体瘤细胞诱导分化密切相关的特定的 基因-HNF1α基因及其编码产物HNF1α蛋白，以及HNF1α基因/蛋白在诱导分 化实体瘤中的用途。
本发明的另一个目的在于提供一种通过HNF1α基因/蛋白分化诱导恶性实 体瘤从而治疗肿瘤的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种肝细胞核因子1α(Hepatocyte Nuclear Factor-1α，HNF1α)基因和/或蛋白的用途，它们被用于制备诱导恶性实体瘤 细胞分化的诱导分化试剂或组合物。
本发明还提供肝细胞核因子1α(Hepatocyte Nuclear Factor-1α，HNF1α) 基因和/或蛋白的用途，它们被用于制备使恶性实体瘤的肿瘤细胞阻滞于G2/M 期的组合物。
在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物含有(a)HNF1α蛋白、HNF1α编码序 列或含所述编码序列的表达载体以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述的表达载体包括病毒载体和非病毒载体。较佳地， 所述的非病毒载体为脂质体。
在另一优选例中，所述的实体瘤选自：肝癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、肺癌、 前列腺癌或生殖腺肿瘤。
在另一优选例中，所述的药物组合物还用于体内抑制实体瘤的形成。
在另一优选例中，所述的肝细胞核因子1α是人的肝细胞核因子1α。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有化疗剂。
在本发明的第二方面，提供了一种诱导或促进哺乳动物中实体瘤分化的方 法，它包括步骤：给需要治疗的哺乳动物对象施用肝细胞核因子1α蛋白、其 编码序列或含所述编码序列的表达载体。
在另一优选例中，所述的哺乳动物是人。
附图说明
图1.Real-time RT-PCR检测人肝肿瘤细胞株HNF1α基因表达。
图2.Real-time RT-PCR检测人肝癌及癌旁组织HNF1α基因表达。
图3.免疫组化检测人肝癌及癌旁组织HNF1α蛋白表达(I：癌旁组织HNF1α 表达高于肝癌组织；II：肝癌及癌旁组织HNF1α表达相当；III癌旁组织HNF1α 表达低于肝癌组织)。
图4.免疫组化检测大鼠DEN诱导肝癌模型过程中HNF1α基因表达逐步下 调。
图5.RT-PCR获得HNF1αcDNA片段。
图6.体外连接获得穿梭质粒pAdTrack-CMV-HNF1αBglII、kpnI酶切鉴定。
图7.Pac I酶切鉴定重组腺病毒质粒pAdHNF1α。
图8.酶切鉴定重组腺病毒质粒pAdHNF1α。
图9.AdHNF1α分别感染Hep3B(A、B)、Huh7(C、D)、MHCC-H(E、F)；及 MHCC-L(G、H)细胞3d后GFP表达。
图10.AdHNF1α感染肝肿瘤细胞3d后western blot检测HNF1α蛋白表达。
图11.AdHNF1α感染肝肿瘤细胞3d后HNF1α蛋白表达定量分析。
图12.AdHNF1α感染肝肿瘤细胞3d后免疫荧光检测HNF1α蛋白表达定 位。
图13.AdHNF1α感染人肝肿瘤细胞株后HNF1α基因和肝细胞相关功能基因 mRNA表达定量分析
图14.AdHNF1α感染肝肿瘤细胞株3d后细胞凋亡变化。
图15.AdHNF1α感染肝肿瘤细胞株3d后细胞周期变化。
图16.Real-time RT-PCR及western blot检测AdHNF1α感染肝肿瘤细胞株3 d对细胞周期相关蛋白的影响。
图17.外源导入HNF1α对不同人肝肿瘤细胞株细胞增殖能力的影响。
图18.外源导入HNF1α对不同人肝肿瘤细胞株细胞克隆形成的影响。
图19.AdHNF1α感染肝肿瘤细胞Hep3B后体内接种成瘤实验。
图20.AdHNF1α感染肝肿瘤细胞Huh7后体内接种成瘤实验。
图21.AdHNF1α瘤内注射基因治疗皮下成瘤模型。
图22.HNF1α基因治疗肝肿瘤细胞肝脏原位注射致实验性肝肿瘤模型。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现了HNF1α基因/蛋白可有效地 在体内诱导或促进恶性实体瘤向正常细胞分化。实验表明，HNF1α不仅对肿瘤 细胞凋亡有影响，更可对实体瘤细胞的分化产生诱导或促进作用(细胞形态变化、 肝细胞相关功能基因表达明显上调及体内对肿瘤的预防、干预和治疗作用)。因 此HNF1α作为首次被证实的可有效地在体内诱导或促进恶性实体瘤向正常细胞 分化的关键基因/蛋白，具有潜在的应用前景。本发明人在此基础上完成了本发 明。
如本文所用，术语“基因/蛋白”指基因和/或蛋白。
如本文所用，术语“HNF1α蛋白”、“HNF1α多肽”、“本发明多肽”、 “本发明蛋白”可互换使用，都指肝细胞核因子1α(Hepatocyte Nuclear Factor-1α)蛋白。它们可包括含有或不含起始甲硫氨酸(Met)的HNF1α。狭义 上，所述术语指人的HNF1α；广义上，所述术语不仅包括人的HNF1α，还包括 其他哺乳动物的HNF1α，尤其是灵长类动物的HNF1α，如猿或猴的HNF1α。该 术语还包括HNF1α蛋白的活性片段、活性衍生物和类似物。
本发明多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明 的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或 真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重 组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。 本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发 明的天然HNF1α蛋白(如人HNF1α)相同的生物学功能或活性的多肽。这些多肽 片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选 保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不 是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇) 融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽 (如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG 片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本 领域熟练技术人员公知的范围。
例如，在本发明中，术语“人HNF1α多肽”指具有野生型HNF1α序列的多 肽。该术语还包括具有与人HNF1α蛋白相同的诱导实体瘤分化功能的、野生型 序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个， 较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取 代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10 个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的 氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末 端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。同样，该术语还包括人 HNF1α蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明还包括人HNF1α蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人HNF1α 多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差 异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸) 的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如 乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加 工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖 基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷 酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修 饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人HNF1α蛋白保守性变异多肽”指与野生型氨基酸序列相 比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸 被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表 1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro；Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
如本文所用，术语“HNF1α基因”或“本发明基因”可互换使用，都指编 码HNF1α蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。 DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链 的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与野生型编 码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中 是指编码具有野生型氨基酸序列的蛋白质，但与野生型编码区序列有差别的核酸 序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是 还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，只要这些多核苷酸变异体编码与本发 明上述的HNF1α多肽或其的活性片段、活性类似物和活性衍生物。
在本发明中，人HNF1α核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、 重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据人HNF1α的核苷酸序 列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人 员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常 是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离 得到有关序列。
本发明也涉及包含HNF1α编码序列的载体(尤其是病毒载体)，以及用本发 明的载体或HNF1α编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生 本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用HNF1α多核苷酸序列可用来表达或生产 重组的HNF1α多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用编码人HNF1α多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的 重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人HNF1α多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组 表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳 动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但 不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56： 125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem. 263：3521，1988)。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可 以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译 控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人HNF1α编码DNA序列和合适 的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成 技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列 可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代 表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子 包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反 转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表 达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转 化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以 及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转 化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞； 或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；真 菌细胞如酵母；动物细胞如CHO、COS、293细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主 为原核生物如大肠杆菌时，可用CaCl2法或电穿孔方法进行。当宿主是真核生物， 可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿 孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达HNF1α多肽。根据所用的宿主细 胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或 化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
重组的HNF1α多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如 果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组 的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于： 常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超 离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC) 和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的HNF1α多肽可直接做为诱导分化试剂诱导或促进恶性实体瘤发生分 化。此外，编码HNF1α蛋白的多核苷酸或携带HNF1α编码序列的载体也可用于 诱导或促进实体瘤分化。
将多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组 织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中， 再将细胞移植到体内等。
重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达野生型的HNF1α蛋白，以 增加实体瘤中HNF1α蛋白的数量和活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、 腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将HNF1α基因转 移至细胞内。构建携带HNF1α基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献 (Sambrook，et al.)。另外重组人HNF1α基因可包装到脂质体中，然后再转入细 胞内。
本发明HNF1α蛋白、HNF1α多核苷酸及载体，当施用(给药)于哺乳动物 对象(如人)时，可诱导或促进恶性实体瘤发生分化。通常，可将这些物质配制于 无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质(包括水性载体介质)，形成药物组合 物。水性载体介质的pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配 制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规 途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、 皮内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于诱导实体瘤的分化(治疗)，代表性的例子包 括(但并不限于)：肝癌、胃癌、肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌及生殖腺 肿瘤等。在使用本发明HNF1α基因/蛋白或药物组合物时，还可同时或辅助使用 其他治疗剂，如顺铂、TNF等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量(如0.0001-99wt％) 的本发明HNF1α蛋白、HNF1α多核苷酸或载体以及(b)药学上可接受的载体或 赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、 及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明药物组合物可以被制成针剂形 式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。 诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针 剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明药物组合物中还可含有其他 治疗剂，如化疗药物。
使用药物组合物时，是将安全有效量的HNF1α蛋白、HNF1α多核苷酸或 载体施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在 大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重 -约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素， 这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还提供了一种诱导和/或促进恶性实体瘤分化的方法，该方法包括给 需要的哺乳动物对象(如人)施用本发明的HNF1α蛋白、HNF1α多核苷酸或载 体，从而在该对象体内诱导和/或促进实体瘤分化。
本发明还提供了一种肿瘤细胞(尤其是恶性实体瘤)基因治疗的方法，它包 括将HNF1α基因导入肿瘤细胞，使之表达，其中所述将HNF1α基因导入肿瘤 细胞的方法包括用质粒转染、腺病毒或腺相关病毒介导。
本发明的主要优点在于：
(a)利用多种基因工程技术方法研究并首次证实了恶性实体瘤的分化治疗。
(b)筛选并证实重要转录因子HNF1α对恶性实体瘤分化的调控作用。
(c)体内外证实恶性实体瘤分化治疗的可行性及其对临床研究的潜在意义。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。
实施例1
Realtime RT-PCR检测人肝肿瘤细胞株HNF1α基因表达
1.将市售的常规肝肿瘤细胞株Huh-7、Hep3B、MHCC-H、MHCC-L、PLC、 YY、7721均以5×105/皿接种于六孔板，以含10％胎牛血清的新鲜培养液培养， 第二天抽提细胞RNA，分光光度计测定OD260值，配成工作浓度(1μg/μl及 0.1μg/μl)，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
2.Realtime RT-PCR：取4μg RNA、2μl Random primer、DEPC水加至33μl 于70℃置5min、0℃置5min后，加入10μl 5×Buffer、3μl dNTP、2μl RNA逆 转录酶和2μl RNA酶抑制剂混匀后，37℃置1.5h，即可得到逆转录产物。将逆 转录产物稀释后取1μl为模版进行Realtime PCR扩增，基因引物序列见表1-1， 反应体系如下，反应条件为：94℃预变性30s，之后94℃10s，60℃30s，共 进行40个循环后进行溶解曲线的检测。
结果表明：各肝肿瘤细胞株的HNF1αmRNA表达均明显下调。
表1-1人引物序列
实施例2
Realtime RT-PCR及免疫组化检测人肝癌组织及癌旁组织HNF1α基因及蛋 白表达
1.Realtime RT-PCR：Trizol法抽提人肝癌及癌旁组织RNA，以分光光度计 测定其OD260值，配成工作浓度(1μg/μl及0.1μg/μl)，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性。取4μg RNA进行逆转录及Realtime PCR扩增(逆转录反应、Realtime PCR 反应条件及引物序列同前)。
结果表明：11对人肝癌组织/癌旁组织中，7例(63.64％)肝癌组织中HNF1α 表达较癌旁组织降低。
2.免疫组化：人肝癌及癌旁组织蜡块4mm连续切片，60℃烤箱中烘烤30 min固定，脱蜡至水后，3％H2O2室温放置10min清除内源性过氧化物酶，柠檬 酸缓冲液微波进行抗原修复，加1∶10正常兔血清室温封闭30min，滴加HNF1α 抗体(1∶200)4℃过夜；次日PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤3次，每次5min；加二抗 室温孵育30min；PBS洗涤后，加SABC(1∶100)室温孵育20min，DAB显色， 常规树脂封片，光镜下观察。根据阳性染色范围，将免疫组化切片用图像分析 仪行半定量分析，每张切片扫4个视野，用图像分析系统测量阳性染色面积并 自动计算其与总面积的百分比。
结果显示：17对人肝癌组织/癌旁组织中，52.94％(9/17)患者肝癌组织HNF1α 表达较癌旁组织降低。
实施例3
免疫组化法检测DEN致大鼠原发性肝癌模型肝组织HNF1α基因及蛋白表 达
1.DEN以70mg/kg腹腔注射制备大鼠原发性肝癌模型，造模过程中，于造 模前、造模第10w、18w、22w分别处死大鼠。
2.取大鼠肝组织，于10％中性福尔马林固定过夜，组织修剪成1.0×1.0×0.5 cm块状，流水浸泡12h，乙醇梯度(50％-75％-80％-95％-无水乙醇)脱水，二甲苯 透明后浸蜡制成组织蜡块。蜡块连续切片后进行免疫组化染色。
结果显示随着造模时间延长，大鼠肝组织中HNF1α表达逐渐减弱，肝癌组 织中HNF1α表达最弱。
实施例4
构建表达HNF1α的重组复制缺陷型腺病毒AdHNF1α
1.获取HNF1α1896bp cDNA片段：根据人HNF1αcDNA序列设计、合 成引物。在5′端加入BglII限制性酶切位点：正义引物5′-GGAAGATCTCG AGCCATGGTTTCTAAACTGAG-3(SEQ ID NO：5)；反义引物在5′端加入Kpn I 限制性酶切位点：5′-CGGGGTACCTTACTG GGAGGAAGAGGCCAT-3′(SEQ ID NO：6)。PCR扩增获取HNF1αcDNA片段，产物1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定 片段大小，并割胶回收置入Eppendorf管内，称取胶重量。Eppendorf管中加入 NT液200ml/100mg胶，50℃5-10min至胶熔化，将液体过柱，13,000rpm 离心1min，加入600μl NT3缓冲液，13,000rpm离心2min。30μl双蒸水过柱 洗脱DNA片段，静放1min，13,000rpm离心1min，小心移取洗脱液于干净的 Eppendorf管内。分光光度计测定OD 260值，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小。
反应条件：98℃10s，68℃8min，35个循环。
2.构建表达HNF1α的腺病毒质粒pAdHNF1α：Kpn I、BglII酶切穿梭质粒 pAdTrack-CMV(购自霍华德-休斯医学研究所，美国)和HNF1αcDNA 4h后并纯 化，取0.1μg质粒pAdTrack-CMV、0.4μg HNF1αcDNA、10×T4缓冲液2μl、T4DNA 连接酶1μl(2U)以及ddH2O，总体积20μl，16℃连接过夜。将连接产物加入常规 的感受态细菌DH5α转化，用含卡那霉素的LB培养基平皿铺板，37℃恒温过夜， 选择单菌落克隆，将扩增出HNF1αcDNA片段的菌落克隆用Qiagen-tip 100试 剂盒中抽，获取质粒pAdTrack-CMV-HNF1α并鉴定。Pme I内切酶酶切线性化 pAdTrack-CMV-HNF1α，分别取0.4μg线性pAdTrack-CMV-HNF1α和0.1μg超 螺旋pAdEasy-1质粒2,000V、200Ohms、25μFD电穿孔共转化20μl感受态 BJ5183细菌，卡那霉素LB培养基平板筛选，选择病毒质粒pAdHNF1α测序鉴 定。
3.包装、扩增腺病毒AdHNF1α：复苏293细胞，以4.8×106/皿接种于10-cm 的组织培养皿，加入DMEM 37℃、5％CO2培养，24h后细胞密度生长至60％～ 80％。Pac I酶切线性化pAdHNF1α，与不含血清的DMEM培液250μl混匀，配 成A液；取Lipofectamin 20μl，加入不含血清的DMEM培液250μl混匀，配成 B液，A液与B液充分混匀，室温放置30min后加入待转染的293细胞中，4h 后更换培液。7d后收集293细胞以及上清，于液氮和37℃水浴中反复冻融4次， 5,000rpm离心5min，收集病毒上清，病毒上清再次感染293细胞进行扩增，2～ 3d后收集病毒；重复感染、收集步骤，将最终收集的病毒上清分装，测定病毒 上清滴度，最终得到滴度约为1×1010efu/ml的腺病毒AdHNF1α(以下实施例中 简称“病毒”)，置于-80℃保存备用。
实施例5
Realtime RT-PCR、Western印迹及细胞免疫荧光法检测AdHNF1α感染人肝 肿瘤细胞株后HNF1α表达及定位
1.人肝肿瘤细胞株Hep3B、Huh7、MHCC-H、MHCC-L均以5×105/皿接种 于35mm培养皿，将病毒(腺病毒AdHNF1α)分别以MOI 100、500、300、300 感染细胞，24h后更换含10％胎牛血清的新鲜MEM或DMEM培液，3d后观察 GFP表达。以Trizol试剂盒抽提总RNA，逆转录反应2h，取1μl稀释的逆转 录产物为模板进行HNF1αrealtime PCR扩增，同时以β-actin在相同反应条件进 行realtime PCR反应作为内参照，反应条件及反应体系同前。
结果表明：AdHNF1α感染人肝肿瘤细胞株后HNF1αmRNA在肿瘤细胞中 表达明显上调。
2.AdHNF1α分别感染Hep3B、Huh7、MHCC-H、MHCC-L，细胞裂解液收 取全细胞蛋白，蛋白标准定量后，各取10μg于10％SDS-PAGE电泳分离蛋白， 将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)ddH2O冲洗，将电泳胶、PVDF膜、滤纸放于 Transferring Buffer中平衡后，置于电转移槽中，18V，40min。用5％BSA/PBST 20ml室温封闭膜2h后，HNF1α单抗(1∶200)4℃孵育过夜，次日PBST洗涤后， 与驴抗羊荧光二抗(1∶2000)室温孵育30min，PBST洗涤2次后，经Odyssey红 外激光成像系统检测荧光并进行灰度扫描。
结果显示，AdHNF1α感染人肝肿瘤细胞株后HNF1α蛋白表达均明显上调。
3.细胞免疫荧光：将玻片以75％乙醇浸泡后，酒精灯烧灼，冷却后置于35mm 培养皿内。Hep3B、Huh7、MHCC-H、MHCC-L分别以5×105/皿接种于35mm 培养皿，将病毒分别以MOI 100、500、300、300感染细胞，3d后观察GFP表 达。将细胞以预冷PBS洗涤2次，加入4％PFA(w/v)/0.1％Triton-X-100/PBS 1ml 4℃固定30min；0.05％PBST洗涤3次；5％马血清室温湿盒内封闭2h；吸去培 养皿中的封闭液，用蜡笔沿盖玻片的四周描一个方框，并沿玻片的中间画一条 线，使左右两半面积一大一小；一半加5％马血清，另一半加一抗稀释液(HNF1α 抗体1∶200用封闭液配制)；置湿盒内4℃孵育过夜；次日0.05％PBST洗涤3次 后，加二抗稀释液(cy2标记驴抗兔抗体1∶500，用封闭液配制)，放入湿盒，室 温孵育30min；PBST洗涤后，滴上约30μl mounting solution(含核DNA显色剂 DAPI)，指甲油封片晾干后，共聚焦显微镜观察HNF1α表达及定位情况。
结果显示：Ad HNF1α感染后，HNF1α表达明显增强，并主要定位于核内。
实施例6
外源导入HNF1α对人肝肿瘤细胞肝细胞相关功能基因的影响
Realtime RT-PCR检测肝细胞相关功能基因的表达：Hep3B、Huh7、 MHCC-H、MHCC-L均以5×105/皿接种于35mm培养皿，将病毒分别以MOI 100、 500、300、300感染细胞，24h后更换含10％胎牛血清的新鲜MEM或DMEM 培液，3d后观察GFP表达。以Trizol试剂盒抽提总RNA，逆转录反应2h，取 1μl稀释的逆转录产物为模板进行realtime PCR扩增，反应条件及反应体系同 前，引物序列见表1-2。
结果表明：AdHNF1α感染组中部分肝细胞相关功能基因表达较对照组明显 上调，主要包括葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G-6-P)、乙醇脱氢酶 1(alcohol dehydrogenase 1，ADH1)、胆绿素还原酶(biliverdin reductase，BR)、载脂 蛋白CIII(apolipoprotein CIII，APOCIII)、转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)、磷 酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)、C-反应蛋 白(C-reactive protein，CRP)、细胞色素氧化酶P450 7A1(cytochrome P450 7A1， CYP7A1)、钠离子/牛磺胆酸盐同向运转器(Na+/taurocholate co-transporter， NTCP)、脂酶A(lipase A，LIPA)等。
其中，在Hep3B和Huh7中，G-6-P分别上调4.67±1.18倍(P＜0.05)、2.03±0.51 倍(P＜0.05)；ADH1分别上调1.91±0.24倍(P＜0.05)、2.91±0.94倍(P＜0.05)；BR 分别上调1.52±0.13倍(P＜0.05)、1.12±0.33倍；APOCIII分别上调1.90±0.18倍 (P＜0.05)、1.97±0.17倍(P＜0.05)；TTR分别上调1.91±0.05倍(P＜0.05)、1.32±0.25 倍(P＜0.05)；PEPCK分别上调4.90±0.65倍(P＜0.01)、8.91±1.36倍(P＜0.05)；CRP 分别上调83.65±13.06倍(P＜0.01)、42.68±18.07倍(P＜0.01)；CYP7A1分别上调 31.23±3.33倍(P＜0.01)、27.44±3.15倍(P＜0.01)；LIPA分别上调1.42±0.22倍 (P＜0.05)、1.22±0.24倍(P＜0.05)；NTCP分别上调2.60±0.56倍(P＜0.05)、2.65±0.32 倍(P＜0.05)。其它肝细胞相关功能基因，如：ALB、GS、CYP1A2、CYP2E、APOA2、 INSR等均无明显上调(P＞0.05)。
表1-2肝细胞相关功能基因引物序列
实施例7
外源导入HNF1α对人肝肿瘤细胞凋亡及细胞周期的影响
1.流式细胞仪测定人肝肿瘤细胞凋亡率：Hep3B、Huh7、MHCC-H、MHCC-L 均以5×105/皿接种于35mm培养皿，将病毒分别以MOI 100、500、300、300感 染细胞，24h后更换含10％胎牛血清的新鲜MEM/DMEM培液，第3d收集细 胞，于EPICS XL流式细胞仪(Coulter)测定细胞凋亡率并进行统计学分析。各组 复设2盘，重复3次。
结果表明：上调肝肿瘤细胞HNF1α表达后，除MHCC-L外，各肿瘤细胞株 凋亡率无明显增加。
2.流式细胞仪测定人肝肿瘤细胞细胞周期变化：Hep3B、Huh7、MHCC-H、 MHCC-L均以5×105/皿接种于35mm培养皿，将病毒分别以MOI 100、500、300、 300感染细胞，24h后更换含10％胎牛血清的新鲜MEM/DMEM培液，第3d 收集细胞，于EPICS XL流式细胞仪(Coulter)测定细胞凋亡率并进行统计学分 析。各组复设2盘，重复3次。
结果表明：上调HNF1α表达后，各肿瘤细胞细胞株G2/M期细胞较感染空 载病毒AdGFP组及空白对照组明显增加，P＜0.05。
3.Realtime RT-PCR及Western印迹检测细胞周期相关蛋白mRNA及蛋白的 表达：AdGFP和AdHNF1α分别感染Hep3B、Huh772h，以Trizol试剂盒抽提 总RNA，细胞裂解液收取全细胞蛋白，分别进行Realtime RT-PCR(反应条件及 体系同前，引物序列见表1-3)及Western印迹检测。
结果表明：HNF1α上调后，细胞周期相关蛋白cyclinA2、cyclinB1上调， 细胞分裂周期蛋白2(cell division cycle 2，CDC2)下调，P21上调(P＜0.05)； cyclinD、cyclinE变化无统计学意义(P＞0.05)。上述研究提示，HNF1α对肿瘤的 抑制作用是通过调控P21及CDC2，导致肿瘤细胞发生G2/M期阻滞。
4.双荧光素酶报告基因检测系统检测P21报告基因表达情况：将2×106Hep3B 细胞接种于大盘，24h后观察其贴壁生长至大约60％～70％满，换无血清无抗生素 培液培养；取10μg P21报告基因表达质粒WWP、1μg内参照质粒SV40与 OPTI-MEM 250μl混匀，配成A液；Lipofectamine 2000 20μl，加入OPTI-MEM 250μl 混匀，配成B液；A液与B液充分混匀，室温放置30min后加入Hep3B细胞中， 6h后更换含血清的MEM培液；4h后吸去MEM培液，PBS洗细胞2次，1×胰酶 消化10min，加入含血清MEM中和胰酶，计数细胞，以1×105/盘将细胞分盘至24 孔板；培养至细胞贴壁后，分别以MOI 100感染AdGFP、AdHNF1α，每组复设3 孔，培养72h后；弃去培养液，PBS洗涤后，每一孔中加入500μL的Passive Lysis Buffer(PLB)；室温轻轻震荡15min后，收集细胞裂解液，取20μL的细胞裂解液至 荧光测定管中，加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，混匀；Luminometer荧光计 量仪测定萤火虫荧光素酶的活性，每一裂解样品经3次检测后取其平均值，计算萤 火虫荧光素酶的表达值。
结果表明：病毒感染72h后，空白对照组、AdGFP组、AdHNF1α组的萤火虫 荧光素酶的表达值分别为49.47±14.41、59.25±17.59、85.3±29.21，AdHNF1α组较 AdGFP组P21报告基因表达明显上调。
实施例8
外源导入HNF1α对人实体肿瘤细胞增殖的影响
人肝肿瘤细胞株、胃癌细胞株和结肠癌细胞株分别以5×103/孔接种于96 孔板，24h后感染病毒AdHNF1α，此后每天用CCK8试剂检测450nm波长的 吸光度以判断有活性细胞的数量。
结果表明：HNF1α表达对实体肿瘤细胞增殖有明显的抑制作用，同时研究 发现，随着病毒感染滴度的增高，HNF1α上调对部分实体肿瘤细胞增殖抑制作 用表现为时间和剂量的依赖性。
实施例9
外源导入HNF1α对人实体肿瘤细胞克隆形成的影响
人肝肿瘤细胞株、胃癌细胞株和结肠癌细胞株分别以2×105接种于35mm 培养皿，病毒AdHNF1α感染24h后，各取8×103细胞接种于10cm培养皿， 每3天换液，培养3-4w，直至可见明显克隆，4％PFA固定，结晶紫染色，计 数克隆。
结果表明：AdHNF1α感染后，人实体肿瘤细胞株形成的克隆均较对照组减 少，HNF1α上调可明显降低实体肿瘤细胞株的克隆形成能力。
实施例10
上调人肝肿瘤细胞株Hep3B和Huh7 HNF1α表达对体内成瘤的实验研究
分别取AdHNF1α感染24h后的Hep3B5×106和Huh72×106接种于裸鼠 腋下，观察体内成瘤情况，同时用游标卡尺测量新生肿瘤的大小。
结果表明：皮下注射Hep3B成瘤实验中，对照侧(AdGFP侧)自第12d起有 肿瘤生长，至第42d所有7只小鼠均有肿瘤生长；而治疗AdHNF1α组直至6w 时所有7只裸鼠侧均无肿瘤生长。皮下注射Huh7成瘤实验中，对照侧(AdGFP 侧)自第14d起即出现肿瘤，至24d所有8只小鼠皮下均有肿瘤生长，并于6w 时死亡1只；而治疗组直至第41d起才有1只裸鼠发现肉眼可见的肿瘤。
实施例11
HNF1α治疗实验性肝肿瘤模型(1)
将5×106个Hep3B细胞重悬于200ul的无血清的MEM中，接种于裸鼠两 侧颈部皮下构建实验性肝肿瘤裸鼠模型。待出现两侧肉眼可辨肿瘤后，挑选双 侧肿瘤大小相当的裸鼠，在左右两侧瘤内分别注射重组复制缺陷型腺病毒 AdGFP和AdHNF1α，剂量2×109pfu，每周注射3次，持续2w；治疗前后及治 疗期间每周以游标卡尺测量皮下肿瘤长径及宽径，计算肿瘤体积，以判断肿瘤 生长情况。6w时处死裸鼠，测量皮下肿瘤大小、重量；并取肿瘤组织制备石蜡 切片，行HE染色，免疫组织化学法检测肿瘤组织HNF1α、PCNA、Ki67表达， 免疫组织化学染色方法及条件同前。
结果表明：7只裸鼠HNF1α基因治疗侧肿瘤大小平均值在不同时间节点均 显著小于对照侧。免疫组化结果显示，治疗组肿瘤细胞异型性有明显改变(形态 相对规则，胞核小，核畸形及核分裂增多少见)；与凋亡相关的蛋白如Bcl-2、 Bax等表达未见明显变化。该结果表明，HNF1α基因/蛋白可有效地在体内诱导 或促进实体瘤向正常细胞分化。
实施例12
HNF1α治疗实验性肝肿瘤模型(2)
将5×106Hep3B个细胞重悬于200ul的无血清的MEM中，通过肝脏原位 注射于NOD/SCID小鼠体内，14d后手术开腹观察肝脏注射部位均有白色点状 肿瘤生长。分别经尾静脉注射AdGFP和AdHNF1α，剂量2×109pfu/鼠，每周 注射2次，持续3w；处死小鼠，测量小鼠体重、肝重，观察肝脏局部肿瘤生长 情况，并取出肝脏，制备石蜡切片并进行HE染色和病理分析。
结果表明：AdGFP组6只小鼠肝脏均有肿瘤生长，其中4只出现腹水，3 只为血性腹水。AdHNF1α组6只小鼠中，2只小鼠肝脏有肿瘤生长，4只未见 肿瘤生长，均未出现明显腹水。免疫组织化学检测显示AdHNF1α治疗组HNF1α 表达明显高于AdGFP组，PCNA、Ki67表达明显低于AdGFP组。
实施例13
外源导入HNF1α对人肝肿瘤细胞CD133表达的影响
将人肝肿瘤细胞HepG2和Hep3B均以5×105/皿接种于六孔板，分别将病毒 AdHNF1α以MOI 40、100感染细胞，24h后更换含10％胎牛血清的新鲜DMEM培 液，第3天收集细胞，CD133/1-PE(Miltenyi Biotec，Aubum，CA)作为一抗孵 育，流式细胞仪CD133+细胞的比例。
结果表明，AdHNF1α感染后肝肿瘤细胞中CD133+的细胞比例明显减少。 CD133+是肿瘤干细胞的特异性标志物，CD133+的细胞比例明显减少表明 AdHNF1α促进诱导肿瘤干细胞发生分化，比例明显下降。另外，未见全反式维 甲酸或三氧化二砷对肿瘤干细胞有明显诱导分化作用。
实施例14
全反式维甲酸、生长抑素(Somatostatin)、肿瘤坏死因子以及三氧化二砷等 对肝癌细胞株HepG2和Hep3B的体外作用
人肝肿瘤细胞株HepG2和Hep3B均以5×105/皿接；以Trizol试剂盒抽提 总RNA，逆转录反应2h，取1μl稀释的逆转录产物为模板进行PCR扩增，检 测肝细胞相关功能基因mRNA表达，免疫组化测定Cyclin、Bax、Bcl-2等增殖 及凋亡相关蛋白表达。
结果表明：各组肝细胞相关功能基因表达未见明显差别，与肿瘤分化相关 的部分基因表达(HNF1α、HN41α、C/EBP)表达未见明显上调种于六孔板，分别 加入全反式维甲酸、生长抑素、肿瘤坏死因子以及三氧化二砷，细胞形态学无 明显改变；肿瘤坏死因子和三氧化二砷组细胞凋亡明显增多、增殖下调。这提 示这些物质对肝癌细胞没有诱导分化作用(因为细胞形态无变化)。
讨论
肝细胞核因子1(hepatocyte nuclear factor，HNF1)属于POU-同源结构域家 族，是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白，在分化成熟 的肝细胞中高表达，其中HNF1α是HNF1的重要亚型。野生型的人HNF1α序 列的登录号为(GeneID：6927)
对HNF1α基因敲除小鼠研究发现：HNF1α是肝脏发生发育中必需的转录因 子，与建立和维持胚胎肝脏的最终正常分化发育密切相关，HNF1α基因敲除小 鼠可出现严重肝肾功能损害，多于出生后数天内死亡。HNF1α以同源或与HNF1β 形成异源二聚体的形式与顺式作用元件结合，与一些转录激活蛋白相互作用来 改变启动子或增强子附近的染色体结构，从而在转录水平实现对分化和功能基 因表达的调控。
由于绝大多数物质或基因虽然在体外实验中可改善肿瘤细胞的某些生物性 特性或可降低癌细胞在动物体内的成瘤作用，但是几乎都是通过诱导细胞凋亡 实现，并不能特异性地在体内诱导实体肿瘤发生分化。因此早先的研究虽认为 下调肝癌细胞株HNF1α的表达后，肿瘤细胞的某些肝细胞功能基因表达降低， 但并不相信也未证实HNF1α居然具有诱导分化恶性实体瘤，进而逆转肿瘤低分 化状态的能力；HNF1α对其它恶性实体肿瘤的分化调控作用亦不明确；更未将 上调HNF1α表达作为诱导分化治疗手段加以研究。
本发明的创新研究的表明：利用基因工程技术调控实体肿瘤细胞HNF1α基 因表达，可有效地对肿瘤细胞的产生诱导分化作用，改善肿瘤细胞生物学特性， 阻滞肿瘤细胞生长(使肝癌细胞阻滞于G2/M期)。HNF1α调控众多细胞分化基因 和功能基因的表达，如通过上调胚胎干细胞HNF1α表达，可明显增强一些重要 功能基因如载脂蛋白、和葡萄糖-6-磷酸酶等表达。
更为重要的是，上调HNF1α表达还可逆转肝癌细胞的去分化状态。因此， 这提示，HNF1α可能还在不同类型肿瘤的分化转录调控中发挥重要作用。因此， 本发明通过体内HNF1α腺病毒载体注射明确HNF1α表达上调对人体恶性实体 瘤动物模型的诱导分化治疗作用，从而提供了一种肿瘤诱导分化治疗的新手段。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。