《桑白皮水提物在制备治疗雌激素类缺乏症药物中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《桑白皮水提物在制备治疗雌激素类缺乏症药物中的应用.pdf（12页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104107222A43申请公布日20141022CN104107222A21申请号201410340224722申请日20140717A61K36/605200601A61P5/3020060171申请人河南中医学院地址450008河南省郑州市金水区金水路1号72发明人郑晓珂张娜王晓帆曹彦刚袁培培王小兰冯卫生匡海学74专利代理机构郑州天阳专利事务所普通合伙41113代理人聂孟民54发明名称桑白皮水提物在制备治疗雌激素类缺乏症药物中的应用57摘要本发明涉及桑白皮水提物在制备治疗雌激素类缺乏症药物中的应用，可有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病如妇女更年期综合症等的。
2、用药问题，以及给临床医生提供参考，旨在中药配伍时考虑该作用提高处方疗效，技术方案是，桑白皮水提物在制备治疗雌激素类缺乏症药物中的应用，该桑白皮水提物是将桑白皮每次用其10倍重量的水煎煮3次，每次1H，第一次煎煮时，先浸泡30分钟，合并3次水煎液，减压浓缩干燥，得到桑白皮水提物，本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次以上试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌激素类药物，开辟了桑白皮药用新用途，临床意义巨大。51INTCL权利要求书1页说明书8页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图2页10申请公布号CN10410。
3、7222ACN104107222A1/1页21一种桑白皮水提物在制备治疗雌激素类缺乏症药物中的应用，该桑白皮水提物是将桑白皮每次用其10倍重量的水煎煮3次，每次1H，第一次煎煮时，先浸泡30分钟，合并3次水煎液，减压浓缩干燥，得到桑白皮水提物。权利要求书CN104107222A1/8页3桑白皮水提物在制备治疗雌激素类缺乏症药物中的应用技术领域0001本发明涉及医药新用途，特别是一种桑白皮水提物在制备治疗雌激素类缺乏症药物中的应用，可用于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病，并在中药配伍时根据不同群体的病人，可在组方时考虑该作用从而提高处方疗效。背景技术0002桑白皮CORTEXMORI是桑科植。
4、物桑MORUSALBAL的干燥根皮。始载于神农本草经，列为中品，历代本草均有收载。桑白皮中主要含有黄酮类化合物，此外，还含有香豆素类化合物、多糖类，以及甾体、鞣质和挥发油等多种成分。桑白皮含有的多种化学成分决定了其药理活性比较广泛。桑白皮味甘，性寒，归肺经，具有泻肺平喘、利尿消肿功能，主治肺热喘咳、面目浮肿、小便不利。民间常用于消炎、利尿、解热、镇咳、祛痰等。另外，现代药理研究证实，桑白皮还具有降血糖、降血压、降血脂、抗艾滋病病毒HIV、抗肿瘤等作用。但至今尚未有关于桑白皮雌激素样活性方面的研究报道。发明内容0003针对上述情况，本发明的目的就是提供一种桑白皮水提物在制备治疗雌激素类缺乏症药物。
5、中的应用，可有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病如妇女更年期综合症等的用药问题，以及给临床医生提供参考，旨在中药配伍时考虑该作用提高处方疗效。0004本发明解决的技术方案是，桑白皮水提物在制备治疗雌激素类缺乏症药物中的应用，该桑白皮水提物是将桑白皮每次用其10倍重量的水煎煮3次，每次1H，第一次煎煮时，先浸泡30分钟，合并3次水煎液，减压浓缩干燥，得到桑白皮水提物，该桑白皮水提物可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，以及供临床医生在中药配伍时考虑该作用提高处方疗效，实现桑白皮水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病如妇女更年期综合症等药物。
6、中的应用，并在中药配伍时根据不同群体的病人，可在组方时考虑该作用从而提高处方疗效。0005本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次以上试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌激素类药物，开辟了桑白皮药用新用途，临床意义巨大。附图说明0006图1为本发明桑白皮水提物对MCF7增殖的影响N6示意图，其中，与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。0007图2为本发明桑白皮水提物对性未成熟小鼠子宫系数的影响N10示意说明书CN104107222A2/8页4图，其中，与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比。
7、较，表示P005，表示P001。0008图3为ER介导时，本发明桑白皮水提物对ERE调控的报告基因LUC瞬时表达结果N3示意图，其中，与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。0009图4为ER介导时，本发明桑白皮水提物对ERE调控的报告基因LUC瞬时表达结果N3示意图，其中，与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。具体实施方式0010以下结合实施例和试验相关资料对本发明的具体情况作详细说明。0011本发明在具体实施中，所述的桑白皮水提物在制备雌激素类药物中的应用，该桑白皮水提物是由以下实施例给出00。
8、12实施例10013将桑白皮100G每次用其10倍重量的水，煎煮3次，每次1H，第一次煎煮时，先浸泡30分钟，合并三次水煎液，减压浓缩干燥，得到桑白皮水提物，连续反复三次，平均得率为167，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，以及在中药配伍时根据不同群体的病人，考虑该作用从而提高处方疗效。0014实施例20015将桑白皮500G每次用其10倍重量的水，煎煮3次，每次1H，第一次煎煮时，先浸泡30分钟，合并三次水煎液，减压浓缩干燥，得到桑白皮水提物，连续反复三次，平均得率为170，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，以及。
9、在中药配伍时根据不同群体的病人，考虑该作用从而提高处方疗效。0016实施例30017将桑白皮1000G每次用其10倍重量的水，煎煮3次，每次1H，第一次煎煮时，先浸泡30分钟，合并三次水煎液，减压浓缩干燥，得到桑白皮水提物，连续反复三次，平均得率为174，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，以及在中药配伍时根据不同群体的病人，考虑该作用从而提高处方疗效。0018根据上述方法按桑白皮和水的比例可以通过工业化生产制得任意量的桑白皮水提物，用于制备雌激素类药物，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病的用药治疗问题，并经试验得到了充分证明。以及在中药配伍时根。
10、据不同群体的病人，考虑该作用从而提高处方疗效。0019试验资料如下0020采用细胞增殖实验、动物实验及报告基因技术研究桑白皮水提物的雌激素样作用，其有关试验资料如下0021首先通过MCF7细胞增殖实验ESCREEN，发现桑白皮水提物在不含雌激素的培养基中能够促进MCF7细胞的增殖，提示体外桑白皮水提物具有一定的雌激素样作用。0022进而通过小鼠子宫增重实验，证明桑白皮水提物能够显著增加性未成熟雌性小鼠说明书CN104107222A3/8页5的子宫系数，确认桑白皮水提物具有雌激素样作用。0023最后通过ERE调控的报告基因瞬时表达检测，明确桑白皮水提物的雌激素样作用是通过雌激素受体途径介导的，并。
11、验证是通过与雌激素受体ER和ER的结合而发挥雌激素样作用，且主要是通过ER介导发挥雌激素样作用。0024发明人已通过实验证明了本发明药物在制备雌激素类药物中的新用途。其主要实施方案如下0025一、实验材料与方法00261实验药物，本发明桑白皮水提物，0027桑白皮CORTEXMORI为桑MORUSALBAL的干燥根皮。秋末叶落时至次春发芽前采挖根部，刮去黄棕色粗皮，纵向剖开，剥取根皮，晒干，即可。桑白皮每次用其10倍重量的水煎煮3次，每次1H，第一次煎煮时，先浸泡30分钟，合并3次水煎液，减压浓缩干燥，得到桑白皮水提物。00282实验动物与细胞株及质粒0029昆明种小鼠，雌性，出生21天刚断乳。
12、，体重912G，购于河南省实验动物中心。人乳腺癌细胞MCF7购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。HEK293细胞株购于中国典型培养物保藏中心。半乳糖苷酶GALACTOSIDASE，GAL对照质粒PGALCONTROL、重组报告基因PERETALLUC由军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓博士惠赠。重组人ERHUMANER,HER表达载体PCXN2HER和重组人ERHUMANER,HER表达载体PCXN2HER由东京大学医学系SATOSHIINOUE博士惠赠。00303主要试剂0031DMEM高糖培养基和阳离子脂质体LIPOFECTAMINETM2000REAGENT购自GIBCOINV。
13、ITROGEN公司；胎牛血清购自广州四季青公司；无酚红DMEM高糖培养基、葡聚糖活性炭去激素胎牛血清购自HYCLONE公司；17雌二醇17ESTROGEN，E2、氨苄青霉素AMP、TRIS碱均购自SIGMA公司；戊酸雌二醇片拜耳医药；邻硝基苯D半乳吡喃糖苷ONITROPHENYLDGALACTOPYRANOSIDE,ONPG、EDTA、MTT及DMSO为AMRESCO公司产品；STEADYGLO稳定荧光素酶检测系统试剂盒STEADYGLOLUCIFERASEASSAYSYSTERM、闪亮裂解缓冲液GLOLYSISBUFFER购自PROMEGA公司；酵母粉OXOID公司；胰蛋白胨OXOID公司；。
14、琼脂糖BIOWEST公司；感受态大肠杆菌DH5TRANSGEN公司；质粒小提试剂盒天根公司；其余试剂均为国产分析纯。00324所用主要仪器0033普通手术器械；二氧化碳培养箱STIK；倒置显微镜NIKONECLIPSETS100；SORVALLST16RCENTRIFUGE高速低温冷冻离心机THERMOFISHERSCIENTIC公司；酶标仪BIORAD680；纯水仪SARTORIUS611VF；903磁力搅拌器上海振捷实验设备有限公司；ZRD7080全自动新型鼓风干燥箱上海智城分析仪器制造有限公司；微量加样器NICHIPETEXPLUS；AB204N电子读数分析天平梅特勒托利多仪器上海有限公。
15、司产品；10CM培养皿、96孔培养板、冻存管均为CORNING公司生产；超净工作台江苏苏净集团；BIOMATE3S紫外分光光度计THERMOFISHERSCIENTIC公司；VERITASTM微板光度计TURNERBIOSYSTEMS公司；SK6200H型超声波清洗器上海科导超声仪器有限公说明书CN104107222A4/8页6司；LRH系列生化培养箱上海一恒科技有限公司。00345实验方法003551MCF7细胞增殖实验0036MCF7细胞人乳腺癌细胞经无酚红含5去雌激素血清的DMEM培养基培养1周后，选取对数生长期细胞，PBS洗两次，用005胰蛋白酶消化后，加入无酚红DMEM培养基吹打均匀。
16、，以6104个/ML的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为200L。培养24H待细胞贴壁后，换为含药培养液继续培养。37、5CO2培养72H后，每孔加入MTT溶液5MGML120L，37继续培养4H，小心吸净培养液，每孔加入150LDMSO，震荡510MIN，使紫色结晶完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在490NM下测定各孔吸光度值A，计算平均A值和增殖率PROLIFERATIONRATE，RP。实验平行重复三次。0037RP实验组A值空白组A值空白组A值1100003852小鼠子宫增重实验0039将小鼠按体重均衡和随机的原则分组。给药持续7天。空白对照组每日蒸馏水02ML10G1灌胃；阳性。
17、对照组每日戊酸雌二醇033MGKG1D1灌胃；桑白皮水提物按临床用药的10倍量提取率为低剂量，临床用药的20倍量提取率为中剂量，临床用药的40倍量提取率为高剂量计算，配成相应浓度的混悬液，每日按02ML10G1灌胃。最后一次给药24H后，脱颈处死小鼠，立即摘取子宫称重，计算子宫系数子宫湿重体重1100。实验平行重复三次。结果与空白组相比，计算P值考察有无统计学意义。004053ERE调控的报告基因瞬时表达检测0041531细胞接种0042于转染前24H将处于对数生长期的HEK293细胞人胚肾细胞接种于24孔板，密度为160104个/05ML/孔，且培养液为含10去雌激素血清的不含抗生素的无酚红。
18、DMEM培养液，分别设置空白对照孔、雌二醇孔及待测药物孔。0043532质粒的转染00441待细胞布皿8090时，小心吸出原培养基，加入420L含10去雌激素血清的不含抗生素的无酚红DMEM培养基。00452取3只EP管，ER管中加490L无酚红DMEM培养基、9LPCXN2HER质粒80NGL1、9LPERETALLUC质粒400NGL1、9LPGALCONTROL质粒200NGL1；ER管中加490L无酚红DMEM培养基、9LPCXN2HER质粒80NGL1、9LPERETALIUC质粒400NGL1、9LGALCONTROL质粒200NGL1；脂质体管中加入1000L无酚红DMEM培养基。
19、和36L脂质体。00463倒转混匀脂质体管，室温放置5MIN，取510L分别加入ER和ER管，轻轻混匀，室温放置20MIN；00474取80LER管中脂质体/DNA复合物分别加入24孔板ER实验孔，取80LER管中脂质体/DNA复合物分别加入24孔板ER实验孔。前后摇匀，放入培养箱。0048546H后加入对照药物和检测药物。0049533ERE调控的报告基因瞬时表达检测0050加药后24H的细胞，从培养箱中取出细胞，室温平衡20MIN，吸去培养液。按照STEADYGLO稳定荧光素酶检测系统试剂盒STEADYGLOLUCIFERASEASSAYSYSTERM及闪说明书CN104107222A5/。
20、8页7亮裂解缓冲液GLOLYSISBUFFER改良操作步骤操作，收集细胞裂解上清液，加入荧光素酶反应底物荧光素，置于暗处，用VERITASTM微板光度计检测荧光强度。0051534GAL活性检测0052为了考察转染效率，对内参照GAL活性进行检测。0053154L巯基乙醇加入40MLZBUFFER中，混匀，取EP管，每管加1800L；00542每管加20L裂解上清液；00553每管加400LONPG，倒转混匀；00564放置37温箱，至显黄色；00575加NA2CO31ML终止反应；00586测OD420值；00597计算标准化的荧光素酶活性；0060二、统计处理0061实验数据以表示，SPS。
21、S180进行单因素方差分析ONEWAYANOVA统计处理。0062三、实验结果00631给药72小时后桑白皮水提物对MCF7细胞增殖影响0064结果显示，桑白皮水提物在1MGML1、05MGML1、01MGML1时与空白组比，对MCF7细胞均有极显著的促增殖作用P001。见表1，图1。0065表1桑白皮水提物对MCF7增殖的影响N600660067注与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。00682桑白皮水提物对小鼠子宫系数的影响0069结果显示，桑白皮水提物组与空白对照组相比能极显著诱导性未成熟小鼠子宫系数的增加P001，说明桑白皮水提物在体内。
22、具有雌激素样活性。见表2，图2。0070表2桑白皮水提物对性未成熟小鼠子宫系数的影响N100071说明书CN104107222A6/8页80072注与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。00733ERE调控的报告基因瞬时表达检测评价桑白皮水提物是否通过雌激素受体途径发挥雌激素样作用0074利用报告基因技术检测桑白皮水提物与雌激素受体ESTROGENRECEPTORS,ERS相互作用的影响。0075阳性对照组即17雌二醇E2加入的终浓度为108MOLL1，桑白皮水提物加药浓度分别为20MGML1、10MGML1、05MGML1。0076结果显示，。
23、不论是由ER或ER介导，E2标准化后的荧光素酶活性极显著高于空白孔P001。0077由ER介导时，桑白皮水提物2MGML1标准化后的荧光素酶活性显著低于正常孔P005，05MGML1标准化后的荧光素酶活性极显著高于正常孔P001，表3，图3。0078由ER介导时，桑白皮水提物2MGML1标准化后的荧光素酶活性显著高于空白孔P005，10MGML1、05MGML1标准化后的荧光素酶活性极显著高于空白孔P001，表4，图4。说明桑白皮水提物可经过雌激素受体介导激活基因转录，且主要通过ER介导发挥雌激素样作用。0079表3桑白皮水提物通过ER介导的对ERE调控的报告基因瞬时表达检测结果N300800。
24、081注与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。0082表4桑白皮水提物通过ER介导的对ERE调控的报告基因瞬时表达检测结果N30083说明书CN104107222A7/8页90084注与空白对照组比较，表示P005，表示P001；与阳性组比较，表示P005，表示P001。0085MCF7细胞增殖实验结果显示，桑白皮水提物在浓度为2MGML1、1MGML1和05MGML1时对MCF7细胞均具有显著的促增殖作用。0086小鼠子宫增重实验结果显示，桑白皮水提物可显著增加性未成熟小鼠子宫系数，说明桑白皮水提物在体内、体外均具有雌激素样活性。0087ER。
25、E调控的报告基因瞬时表达检测结果显示，桑白皮水提物的雌激素样作用是通过ER和ER共同介导发挥的，且主要是通过ER介导的基因转录。0088综上所述，动物及细胞实验结果显示，桑白皮水提物具有一定的雌激素样作用，其主要是通过ER介导而发挥雌激素样作用。0089四、结论0090MCF7细胞是雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞株，能特异地受雌激素或雌激素样活性物质调节而增殖，是最常用的检测雌激素样活性的细胞株。MCF7细胞雌激素样增殖试验非常灵敏，在无雌激素的培养基中可以区分雌激素激动剂和拮抗剂，因而被广泛应用于体外大量、快速筛选和评价环境雌激素和植物雌激素。在桑白皮水提物对MCF7细胞增殖实验中，桑白皮水提。
26、物在浓度为2MGML1、1MGML1和05MGML1时对MCF7细胞有显著的促增殖作用，提示桑白皮水提物在体外具有雌激素样活性。0091子宫增重实验是最早建立的检测雌激素活性的经典方法，在评价雌激素活性时，它考虑了物质的吸收、代谢、与血浆蛋白结合以及药代动力学等多方面因素，直接反映受试药物经体内代谢后的总体生物学效应。因此，本实验采用性未成熟雌性小鼠子宫湿重与体重之比子宫系数作为评价雌激素样活性的指标。通过上述实验，证明桑白皮水提物可显著增加性未成熟小鼠子宫系数，确认桑白皮水提物在体内具有雌激素样作用。0092上述试验反复进行多次，均取得了相同或相近的结果，提示，桑白皮水提物在体内、体外均具有。
27、一定的雌激素样作用。0093报告基因REPORTERGENE是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即一类其表达产物非常容易被鉴定，且与内源性背景蛋白较易区别的的基因。报告基因技术即将应答元件和报告基因相连，通过检测报告基因表达活性，可知信号转导途径及其对细胞内基因表达的调控和影响。报告基因技术灵敏度高、选择性强且操作简单。在桑白皮水提物对报告基因载体PERETALLUC瞬时表达的诱导作用实验中，通过观察报告基因的表达情况，即荧光强度的高低可以检测到受试物是否可与雌激素受体结合，并作用于雌激素应答元件ERE来调控基因的表达，从而了解桑白皮水提物雌激素样作用的强弱以及其与ER或ER亲和力的大小。实。
28、验结果显示，由ER介导时，桑白皮水提物2MGML1标准化后的说明书CN104107222A8/8页10荧光素酶活性显著低于正常孔P005，05MGML1标准化后的荧光素酶活性显著高于正常孔P001。由ER介导时，桑白皮水提物2MGML1、1MGML1和05MGML1三组标准化后的荧光素酶活性也均显著高于空白孔。提示，桑白皮水提物可经过雌激素受体介导激活基因转录，且主要通过ER介导发挥雌激素样作用。0094有机体是一个复杂的体系，体内体外结果存在一定偏差。本实验应用体外细胞实验、体内整体动物实验及报告基因技术相结合共同来验证受试物的雌激素样活性，保证了结果的准确性。0095通过上述实验，证明桑白皮水提物能够促进MCF7细胞的增殖和增加性未成熟小鼠子宫的湿重，同时桑白皮水提物还可以激活由ER和ER介导的基因转录而发挥雌激素样活性。由以上实验结果可知，桑白皮水提物具有雌激素样作用，所以其可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的妇女更年期综合症的药物。说明书CN104107222A101/2页11图1图2说明书附图CN104107222A112/2页12图3图4说明书附图CN104107222A12。