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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510161135.0 (22)申请日 2015.04.08 A01N 1/02(2006.01) (71)申请人 中国医学科学院医学实验动物研究 所 地址 100021 北京市朝阳区潘家园南里 5 号 (72)发明人 张连峰 刘牧 (54) 发明名称 大鼠精子玻璃化冷冻的一种新型冷冻保护剂 (57) 摘要 本发明公开了一种用于 SD 大鼠以及以 SD 大 鼠为遗传背景的基因工程大鼠的精子冷冻保护 剂， 所述的大鼠精子冷冻保护剂利用豆浆 (bean milk) 提取液作为大鼠精子冷冻保护剂 (rat sperm cryopreser。
2、vation agent ； RS-CPA)的一个 主要添加成分， 所占比例为 5， 另外该冷冻保护 剂中还包括棉籽糖。 本发明的大鼠冷冻保护剂， 通 过添加了豆浆提取液， 大大提高了复苏后精子的 活力和受精率， 冷冻复苏率在 10以上。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 CN 106135194 A 2016.11.23 CN 106135194 A 1/1 页 2 1.一种用于 SD 大鼠以及以 SD 大鼠为遗传背景的基因工程大鼠的精子冷冻保护剂， 所 述冷冻保护剂的组分包含豆浆提取液， 其特征在于， 豆浆提取液。
3、在整个精子冻存保护剂中 的比例是 5。 2.如权利要求 1 所述的精子冷冻保护剂， 所述棉籽糖的质量体积比为 11.8。 3.一种如权利要求 1 所述豆浆提取液的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (1) 选取优质干燥的大豆 50g， 清水洗净大豆表面的浮尘 (3 遍 ) ； 放入 2000ml 玻璃 烧杯内， 加入适量的双蒸水， 浸泡过夜 (12h) ； (2) 弃浸泡液， 加入 1000ml 细胞培养级用纯净水 (culture water) ； (3) 制备豆浆液。步步高豆浆机 (A505 型 )， 程序 ：“五谷豆浆” 挡， 30min ； 冷却至室温 ； 滤网粗滤 ； (4)。
4、 离心。10000rpm( 或 11500g)， 30min ； 轻轻地适量吸取离心后， 离心管中间部位的 乳白色变性蛋白悬浮液 ( 去除离心之后， 液体表面上的卵磷脂漂浮物， 同时弃去离心管底 部的沉淀物 ) ； 0.22m 滤膜过滤后， 获得用于制备大鼠精子冷冻保护剂的豆浆提取液。 权 利 要 求 书 CN 106135194 A 2 1/3 页 3 大鼠精子玻璃化冷冻的一种新型冷冻保护剂 技术领域 0001 本发明属于生物工程领域， 具体地， 是关于一种大鼠精子的超低温冷冻剂， 更具体 地， 是关于一种用于 SD 大鼠以及以 SD 大鼠为遗传背景的基因工程大鼠的玻璃化精子冷冻 保护剂。 。
5、背景技术 0002 精子的冷冻保存对于动物实验研究具有积极的作用， 可以大大节省保存空间。而 影响冷冻保存效果的关键因素之一是在冷冻保存过程中所使用的冷冻保护剂。 0003 大鼠 (rat) 精子由于其生理结构不同于小鼠 (mouse) 和其他哺乳动物的精子， 所 以冷冻保存后的复苏率一直比较低。 各国的科学家一直在寻找更能适用于大鼠精子的冷冻 保护剂。 0004 这里我们申请的是一种独创的大鼠精子玻璃化冷冻保护液和其冷冻方法。 利用豆 浆 (bean milk) 提取液作为大鼠精子冷冻保护剂 (rat sperm cryopreservation agent ； RS-CPA) 的一个主要成。
6、分， 可以制备一种新型的大鼠精子冷冻保护剂。利用该冷冻保护剂， 在超低温的液氮(-196)内， 可以长期保存各种转基因大鼠的精子。 在此冷冻保护剂的保 护下， 大鼠精子经冷冻 - 复苏后， 含有一定数量、 活性良好的精子。同时， 可以借助大鼠的超 数排卵、 ICSI 和胚胎移植等辅助生殖技术， 得到冷冻保存的子代转基因大鼠。 0005 本方法可大量制备， 效果相对较好。同时， 该技术无需昂贵的特殊仪器设备 ； 相对 操作简单， 成本较低廉 ； 可用于大鼠的保种工作， 对几乎所有近交系或各种转基因大鼠的精 子进行超低温冷冻保存。 发明内容 0006 本发明的首要目的在于解决现有报道大鼠精子冷冻保。
7、护剂复苏率低的问题。 0007 本发明的第二个目的在于提供所述大鼠玻璃化精子冷冻保护剂的制备方法。 0008 本发明的第三个目的在于提供所述大鼠玻璃化精子冷冻保护剂的应用。 0009 根据本发明， 提供了一种用于 SD 大鼠以及以 SD 大鼠为遗传背景的基因工程大鼠 的玻璃化精子冷冻保护剂， 所述冷冻保护剂的一个主要添加成分是豆浆提取液， 所占比例 为 5， 另外该冷冻保护剂中还包括棉籽糖， 棉籽糖的质量体积比为 11.8。 0010 本发明还提供了所述豆浆提取液的制备方法， 包括以下步骤 ： 0011 (1)选取优质干燥的大豆50g， 清水洗净大豆表面的浮尘(3遍) ； 放入2000ml玻 。
8、璃烧杯内， 加入适量的双蒸水， 浸泡过夜 (12h) ； 0012 (2) 弃浸泡液， 加入 1000ml 细胞培养级用纯净水 (culture water) ； 0013 (3) 制备豆浆液。步步高豆浆机 (A505 型 )， 程序 ：“五谷豆浆” 挡， 30min ； 冷却至 室温 ； 滤网粗滤 ； 0014 (4)离心。 10000rpm(或11500g)， 30min ； 轻轻地适量吸取离心后， 离心管中间部位 的乳白色变性蛋白悬浮液 ( 去除离心之后， 液体表面上的卵磷脂漂浮物， 同时弃去离心管 说 明 书 CN 106135194 A 3 2/3 页 4 底部的沉淀物 ) ； 0.。
9、22m 滤膜过滤后， 获得用于制备大鼠精子冷冻保护剂的豆浆提取液。 0015 本发明的大鼠冷冻保护剂， 通过添加了豆浆提取液， 大大提高了复苏后精子的活 力和受精率， 冷冻复苏率在 10以上。 附图说明 0016 无 具体实施方式 0017 以下结合具体实施例， 对本发明作进一步说明。 应理解， 以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。 0018 实施事例 l ： 豆浆液 (bean milk for rat sperm ； RS-BM) 的制备 0019 (1) 选取优质干燥的大豆 50g， 清水洗净大豆表面的浮尘 (3 遍 ) ； 放入 2 000ml 玻璃烧杯内， 加入适量。
10、的双蒸水， 浸泡过夜 (12h) ； 0020 (2) 弃浸泡液， 加入 1 000ml 细胞培养级用纯净水 (culture water) ； 0021 (3) 制备豆浆液。步步高豆浆机 (A505 型 )， 程序 ：“五谷豆浆” 挡， 30min ； 冷却至 室温 ； 滤网粗滤 ； 0022 (4) 离心。10 000rpm( 或 11 500g)， 30min ； 轻轻地适量吸取离心后， 离心管中间 部位的乳白色变性蛋白悬浮液 ( 去除离心之后， 液体表面上的卵磷脂漂浮物， 同时弃去离 心管底部的沉淀物 ) ； 一次制备的大量豆浆液， 可分装后， -20储存。备用 ； 0023 (5) 。
11、取适量离心后的豆浆液， 0.22m 滤膜， 过滤后即为制备好的 RS-BM ； RS-BM 进 一步用于制备大鼠精子冷冻保护剂 (RS-CPA) ； 0024 实施事例 2 ： 大鼠精子的含豆浆提取液的冷冻保护剂的制备 0025 10ml/RS-CPA 的制备 ： 0026 1.8(g)raffinose+0.5ml/RS-BM+9.5ml/R1ECM* 0027 *R1ECM ： 大鼠 1- 细胞胚胎培养液 ( 参见 ： Miyoshi K.， Funahashi H.， Okuda K.， &Niwa K.， Development of rat one-cell embryos in a。
12、 chemically defined medium ： effects of glucose， phosphate and osmolarity， (1994)， Journal of Reproduction and Fertility， 100(1) ： ， 21-26) 0028 实施事例 3 ： 大鼠精子的冷冻保存方法 0029 (1) 手术获取大鼠的附睾 ： 常规脱颈处死大鼠 ； 体外喷洒酒精消毒 ； 无菌手术摘取 大鼠的附睾 ； 0030 (2) 精子在冷冻液中的平衡 ： 把一侧的附睾剪碎， 取约 2g 的附睾， 溶于 1.5ml/ RS-CPA ； 室温平衡 3min， 待精子。
13、在冷冻剂中扩散 ； 0031 (3) 装管 ： 冷冻细管 (France straw)， 装管 (20l/ 管 ) 后封管 ( 热封或 PVA 封 管 ) ； 0032 (4) 大鼠精子冷冻 ： 液氮蒸汽 10min( 液氮表面 3cm， 约 -130 )， 直接投入液氮 (-196 ) 保存 ； 0033 (5) 大鼠精子复苏 ： 从液氮中取出保存有大鼠精子的冷冻管 ； 室温 10sec ； 剪开麦 管的一端， 把大鼠的精子直接吹入(37预热好的R1ECM培养基内) ； 二氧化碳培养箱保存 ； 说 明 书 CN 106135194 A 4 3/3 页 5 观察、 计算、 评价大鼠精子的复苏情况。 0034 结合单精子注射 (ICSI) 或体外受精 (IVF)， 以及胚胎移植 (ET) 等试验技术， 复活 冷冻保存的大鼠品系。 0035 实施事例 4 ： 含 BM 的 RS-CPA 特点 0036 冷冻复苏的效果， 与同期国内外相关的大鼠冷冻保护剂相比， 出于同一水平 ( 大 鼠精子冷冻 - 复苏率， 10 )。 0037 本发明为独立研究的成果， 特别是含有大豆豆浆的大鼠精子冷冻保护剂， 为国内 外首创。其次， RS-CPA 未含任何动物制品， 因此可以避免动物病毒和动物性疾病的传播。 说 明 书 CN 106135194 A 5 。