发明领域
本发明属于美容领域，更具体地属于保护性美容护肤的领域。本发明涉及卤虫(Artemia salina)提取物用于保护皮肤免受热应力(特别是冷热应力或者重复的温度变化)导致的损伤的美容用途。
本发明的另一目的是美容护理方法，其包括在身体或面部的皮肤的至少一部分局部施用在包含生理学上可接受的介质的组合物中的卤虫提取物，以获得保护性效果，更具体地保护皮肤免受由热应力导致的损伤。
发明背景
表皮的主要功能是确保外部环境和身体之间的保护性屏障。直接与外部环境接触的皮肤暴露于环境条件中的多种变化。根据变化的性质和程度，它们可造成由物理、化学或生物学应力导致的损伤。主要应力为热应力，暴露于氧自由基、紫外辐射和红外辐射、重金属、渗透冲击(osmotic shock)和压力冲击(pressure shock)，以及诸如发热、炎症、病毒感染等病理学状况。
热应力定义为影响身体最佳功能并超过身体的生理学体温调节机制的应力。热应力在环境来源或内部来源的温度的降低(冷热应力(cold thermal stress))或升高(热热应力(hot thermal stress))后产生。从最佳温度偏差几度就可能具有重大的后果。
热冲击定义为由突然且显著的温度变化(至少10℃的温度变化)导致的应力。
皮肤可在许多生理学情况或偶然情况中暴露于热应力。平均皮肤温度在最佳功能中可被评估为约33℃的恒定值，并且可根据对环境的暴露而快速改变，例如在浸入24℃浴中后平均皮肤温度降至27℃(Marino and Booth,1998)，并且在日光照射后可升高为超过37℃。
冷热应力可包括深度体温过低(其中组织和器官的温度降至低于25℃(诸如暴露于极冷的温度或者在某些医学技术中为了保护器官和组织免于缺 氧))和中度体温过低(25℃-35℃的温度)(例如当在夏天和冬天每天在室内和室外之间移动时重复暴露于空调，或者沐浴)。
皮肤经常经受中度冷热应力和随后的连续升温。以下是暴露于冷的细胞生理学效应(Fujita等人)：
-蛋白质变性和解聚增加
-减慢细胞周期的进展，通常G1期是最敏感的
-抑制转录和翻译，这导致蛋白质合成的普遍减少
-破坏细胞骨架的成分
-膜通透性的改变，这导致细胞溶质Na+和H+离子增加。
此外，对于重复的温度变化的重复的皮肤暴露可导致对于细胞表型或细胞膜的结构和脂质组成的有害效应，由此改变皮肤的屏障功能，并导致刺激、干燥或开裂。这些由温度变化和冷热应力导致的效应加速了皮肤的老化过程。
通过建立特定的细胞应答使得能够有热应力有抗性。在冷热应力的情况中，细胞通过诱导特定的基因家族的转录来建立保护系统，所述基因家族导致冷激蛋白或“CSP”(它们与热激蛋白或“HSP”不同)的合成和细胞内蓄积。
在CSP中，可冷诱导的RNA结合蛋白或CIRBP是在人中通过CIRBP基因编码的蛋白质。这些蛋白质被组成型表达以及在暴露于冷后表达。CIRBP在控制对于多种细胞应力(包括短波长紫外光、缺氧和体温过低)的细胞应答中发挥关键作用。在中度体温过低期间，其表达快速且显著增加(Fujita等人,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,1999；Larry等人,J.Appl.Physiol.,2002)，CIRBP的其它作用有：
-抑制RNA降解
-通过这些基因的启动子区的成分来增加特定靶基因的转录，
-mRNA前体的其它供选择的剪接
CIRBP的特殊性质使它们成为受关注的对温度骤变的身体应答的生物学标记物。
卤虫提取物已被用在美容剂中。例如，文件FR 2 817 748记载了用于预防由UV损伤导致的皮肤老化的卤虫提取物，文件FR 2 835 743记载了 用于限制类视色素的副作用的卤虫提取物，并且申请WO 1999038483记载基于卤虫提取物的美容产品，其用于皮肤细胞的再生和刺激。
然而，至今没有人建立起卤虫提取物与保护皮肤免受由热应力导致的损伤之间的联系。
发明人已证明，施用有效量的卤虫提取物使得能够保护细胞免受可导致皮肤损伤的热应力，特别是冷热应力或者重复的温度变化。
本发明以及所得的优点会在阅读说明书后得到更好地理解。
发明内容
本发明涉及卤虫提取物用于保护皮肤免受由热应力导致的损伤的美容用途和/或皮肤病学用途。
根据本发明，术语“皮肤”包括存在于身体表面上的所有角质附件，特别是体毛、睫毛、眉毛、指甲和毛发。
因此，在本发明的意义中，“保护皮肤免受由温度变化导致的损伤”理解为意指卤虫提取物用于减少或预防由温度的重复变化或冷热应力导致的皮肤损伤和刺激。重复的皮肤损伤被认为是难看的，并且通常与加速的皮肤老化有关。
本发明还涉及卤虫提取物用于保护皮肤免受由冷热应力导致的损伤的美容用途和/或皮肤病学用途。
本发明还涉及卤虫提取物用于保护皮肤免受由突然和/或重复的温度变化导致的损伤的美容用途和/或皮肤病学用途。
本发明还涉及卤虫提取物用于维持暴露于冷热应力的皮肤细胞中的CIRBP的生理学水平的美容用途和/或皮肤病学用途。
实际上，卤虫是生活在半咸水中的小甲壳动物。当环境条件变得艰难(脱水、增加的矿物含量)时，卤虫形成囊状物并进入休眠期，在休眠期时它可保持数年。当条件再次变得有利时，卤虫再水化，并流畅地继续它的发育周期。
由于对其高矿化(hypermineralized)的生物小区的适应，卤虫能够形成重要的适应技能：它合成GP4G(二鸟苷四磷酸(diguanosine tetraphosphate))，其为ATP、GTP和G蛋白激活剂的前体。它具有专门调节渗透性的细胞， 其为浮游生物的良好水矿(hydromineral)平衡的必然结果。
在一个具体实施方案中，卤虫提取物包含120-195mg/升的二鸟苷四磷酸，优选包含至少150mg/升的二鸟苷四磷酸。
在下文中，术语“活性剂”和“卤虫提取物”可互换使用。
“局部施用”理解为是指将本发明的活性剂或包含所述活性剂的组合物施用或涂布(spread)到皮肤或粘膜的表面，或者在皮肤或粘膜的表面上施用或涂布的行为。
“生理学上可接受的”理解为意指本发明的活性剂或者包含其的组合物适合与皮肤或粘膜接触，而不导致毒性或不耐受反应。
“由热应激导致的损伤”理解为意指暴露于冷，导致已被损伤的皮肤区域虚弱、干燥、刺激或开裂。
在一个具体实施方案中，可将本发明的卤虫提取物稀释在一种或多种生理学上适合的溶剂中，所述溶剂例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一缩二丙二醇、乙氧基化二甘醇或丙氧基化二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任意混合物。
本发明的另一目的是美容护理方法，其包括在身体或面部的皮肤的至少一部分上局部施用在包含生理学上可接受的介质的组合物中的卤虫提取物，以保护皮肤免受由热应力导致的损伤。
本发明还涉及美容护理方法，其包括在身体或面部的皮肤的至少一部分上局部施用在包含生理学上可接受的介质的组合物中的卤虫提取物，以保护皮肤免受由重复的温度变化和/或冷热应力导致的损伤。
有益地，所述卤虫提取物以所述组合物的总重量的0.0001％至20％的浓度存在，优选以所述组合物的总重量的0.01％至10％的浓度存在，更优选以所述组合物的总重量的0.05％至5％的浓度存在于生理学上可接受的介质中。
根据本发明的另一有利的实施方案，所述活性剂可被包封或包含在美容载体(例如脂质体或在美容剂领域使用的任何其它微囊剂)中，或者吸附在粉末状有机聚合物、矿物支持物(support)(诸如滑石粉和膨润土)上。
用于实施本发明的组合物可特别以水性、水醇性(hydro-alcohol)或油性溶液剂；水包油乳剂、油包水乳剂或复合型乳剂的形式存在；它们也可以适合于在皮肤、粘膜、唇和/或毛发上施用的混悬剂或散剂的形式存在。
这些组合物可以或多或少地具有流动性，并具有乳膏剂、洗剂、乳液(milk)、精华液(serum)、润发油、凝胶剂、糊剂或泡沫剂的外观。它们也可以固体形式存在，例如棒状剂(stick)，或可以气雾剂形式施用在皮肤上。
这些组合物还可包含在所囊括的应用领域中常用的任何添加剂，以及对于它们的配制所需的辅剂，例如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、着色剂、防晒剂、自晒黑剂(self-tanning agent)、色素、填充剂、防腐剂、香料、气味吸收剂、美容剂或药物活性成分、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物等。
在所有情况下，本领域技术人员会确保选择这些辅料及其比例以便不损害本发明的组合物的期望的有益特性。例如，这些辅料可相当于所述组合物的总重量的0.01-20％。当本发明的组合物是乳剂时，脂肪相可占所述组合物的总重量的5-80重量％，优选5-50重量％。在所述组合物中使用的乳化剂和辅助乳化剂会选自所考虑领域中常规使用的那些。例如，它们可以所述组合物的总重量的0.3-30重量％的比例使用。
有益地，除了本发明的活性剂，可用于实现本发明的组合物可包含至少一种提供与本发明的效果相似和/或互补的效果的其它活性剂。根据本发明，会将所述活性剂定义为“额外的活性剂”。
例如，所述额外的活性剂可选自：抗老化剂、固化剂、澄清剂、补水剂、排水剂、促进微循环药剂、剥落剂、去屑剂(desquaming agent)、刺激细胞外基质剂、激活能量代谢剂、抗菌剂、抗真菌剂、安抚剂、抗辐射剂、抗UV剂、抗痤疮剂、抗炎剂、麻醉剂、获得热的感觉剂、获得冷的感觉剂、减肥剂。
此类额外的药剂可以选自：
-维生素A，特别是视黄酸、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯，
-维生素B3，更特别是烟酰胺、烟酸维生素E，
-维生素B5、维生素B6、维生素B12、泛醇，
-维生素C，特别是抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四棕榈酸酯、 抗坏血酸磷酸酯镁和抗坏血酸磷酸酯钠，
-维生素E、维生素F、维生素H、维生素K、维生素PP、辅酶Q10，
-金属蛋白酶抑制剂或TIMP活化剂，
-DHEA、其前体及其衍生物，
-氨基酸，例如精氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、羟脯氨酸二棕榈酸酯、棕榈酰甘氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸及其衍生物、N-酰基氨基酸化合物，
-天然肽或合成肽，其包括二肽、三肽、四肽、五肽和六肽及其亲脂性衍生物、异构体，以及与诸如金属离子(例如铜、锌、锰、镁等)的其它物质的络合物。例如以COLLAXYLTM、PEPTIDE VINCI 02TM、CHRONOGENTM、LAMINIXYL ISTM、PEPTIDE Q10TM的名字市售已知的肽，
-植物肽提取物，例如大豆、斯佩耳特小麦(spelt)、葡萄藤、油菜籽、亚麻子、水稻、玉米、豌豆的提取物，
-酵母提取物，
-脱氢乙酸(DHA)，
-合成或天然的植物甾醇，
-水杨酸及其衍生物、α-和β-羟酸、硅烷醇，
-氨基糖、葡糖胺、D-葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰基甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺，
-多酚、异黄酮和类黄酮化合物的提取物，例如葡萄提取物、松树提取物、橄榄提取物，
-脂质，例如神经酰胺或磷脂；动物来源的油，例如角鲨烯或角鲨烷；植物油，例如甜杏仁油、椰子油、蓖麻油、希蒙得木油、橄榄油、油菜籽油、花生油、向日葵油、小麦胚芽油、玉米胚芽油、大豆油、棉花油、紫苜蓿油、罂粟籽油、笋瓜油、月见草油、粟油、大麦油、黑麦油、红花油、西番莲油、榛子油、棕榈油、杏仁油、鳄梨油、金盏花油；乙氧基化植物油、牛油树脂，
-所有紫外线过滤剂和防晒剂，
-环AMP及其衍生物、腺苷酸环化酶的激活剂和磷酸二酯酶的抑制剂、积雪草(Centella asiatica)提取物、积雪草皂苷和亚细亚酸、甲基黄嘌呤、咖 啡碱、咖啡因及其衍生物、茶碱、可可碱、福司柯林、七叶苷和七叶苷糖、ACE抑制剂、肽Val-Trp、神经肽Y抑制剂、脑啡肽、二叶银杏(Gingko biloba)提取物、薯蓣提取物、芦丁、玛黛茶提取物、瓜拉那提取物、寡糖、多糖、肉碱、常春藤提取物、墨角藻提取物、夏枯草(Prunella vulgaris)的水解提取物、鸡冠花(Celosia cristata)的水解提取物、榆绿木(Anogeissus leiocarpus)的提取物、苦木薯(Manihot utilissima)叶的提取物、棕榈酰卡尼丁、肌肽、牛磺酸、接骨木提取物、海藻提取物例如掌叶树(Palmaria Palmata)提取物、序列Arg-Gly-Ser-NH2的合成肽(通过名称ATPeptideTM销售)。
根据本发明可使用的组合物会通过任何合适的途径施用，特别是口服或局部外用，并且本领域技术人员会对组合物的制剂进行适应性改变。
有益地，本发明的组合物以适合于局部施用的形式存在。因此，这些组合物必须包含生理学上可接受的介质，即与皮肤和上皮附件相容的介质，并必须涵盖所有的美容剂形式。
当然，显然本发明一般针对哺乳动物，更具体地针对人。
所述美容处理方法的具体实施方案也由之前的描述得到。在阅读为了说明性且非限制性目的而给出的实施例后，本发明的其它优点和特性会更清楚。
图1：在用卤虫提取物处理或未用其处理的细胞中，在冷热应力后CIRBP的表达。
图2：在用卤虫提取物处理或未用其处理的细胞中，在冷热应力后IRBP mRNA的评价。
实施例 1 ：卤虫提取物的制备
于30℃至75℃的温度下，在适合的介质(主要由水构成)中，并且在4-7的pH下，将50克卤虫孢囊在1升蒸馏水中再水化30分钟至6小时。然后将这些孢囊研磨。将由此获得的提取物离心并过滤。然后将提取物通过灭菌过滤来灭菌，并加热至65℃。
然后将提取物处理以符合美容剂要求(颜色、香味、外观、无菌度等)。
然后实施通过高效液相色谱法(HPLC)的测定，以确证超过150mg/升的二鸟苷四磷酸含量。
实施例 2 ：在用本发明的卤虫提取物处理或未用其处理的细胞中，在冷热应力后 CIRBP 的表达
该研究的目的是测定用卤虫提取物预处理经受体温过低应力的角质形成细胞的效果。具体而言，通过在用实施例1的卤虫提取物预处理或未用其预处理的情况下，对经受中度体温过低(32℃)的角质形成细胞的蛋白质印迹来测定CIRBP(冷诱导RNA结合蛋白)。
方案：通过向来自皮肤的正常人角质形成细胞(NHK)的生长培养基中加入1％和3％的实施例1的卤虫提取物来对其进行处理。该施用每天重复一次，持续48小时。同时，将NHK培养物在未处理的情况下维持以构成未处理对照。该培养在37℃下进行。
然后通过将预处理的或未预处理的NHK培养物置于32℃下持续6小时来使其经受体温过低应力。在该孵育后，将NHK溶解以通过蛋白质印迹分析CIRBP表达。该常规的免疫印迹技术包括以下步骤：将转移膜用1x TBS/5％乳溶液饱和1小时，用第一抗体CIRBP(Novusbio)在4℃下孵育一夜，然后用偶联至过氧化物酶的第二抗体(Santa Cruz)在环境温度下孵育1小时。通过加入底物(SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate,Thermo Scientific)，使用照相机(Chemi-Imager system,Alpha Innotech Corporation)显示发光。
结果：
参照图1，结果表明与37℃下的对照相比，当将细胞在32℃下孵育6小时时，CIRBP表达增加27％，并且与著录数据一致。
与32℃下的对照相比，当将细胞用1％的实施例1的卤虫提取物预处理时，在32℃下CIRBP水平显著降低17％。与32℃下的对照相比，当将细胞用3％的实施例1的卤虫提取物预处理时，在32℃下CIRBP水平显著降低28％。
结论：
与未处理的对照细胞相比，在用1％或3％的实施例1的卤虫提取物预处理并经受冷热应力的细胞中观察到CIRBP表达的降低。
实施例 3 ：冷热应力后 CIRBP mRNA 的评价
该研究的目的是测定在中度体温过低应力(32℃)之前，通过用实施例1获得的卤虫提取物处理是否调节CIRBP mRNA。通过定量PCR(Q-PCR)评价CIRBP mRNA水平。
方案：将正常人角质形成细胞(NHK)用生长培养基中1％的卤虫提取物处理。同时，将NHK培养物在未处理的情况下维持以构成未处理对照。该培养在37℃下进行。然后将处理的和未处理的培养物置于32℃下持续6小时。
在该孵育后，将总RNA用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN,74104)提取，并用包含RNase抑制剂的高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems,4368814)反转录。使用Step One Plus热循环仪(Applied Biosystems)进行定量PCR。靶CIRBP和内源性对照18S的引物和探针来自Taqman Expression Assays(对于18S，Applied Biosystems,Hs99999901_s1，并且CIRBP:Hs00989762_g1)，将其在来自Master Mix(Applied Biosystems)的无菌水中稀释。
结果：
如图2中所呈现，结果表明与37℃下的对照相比，在经受中度体温过低(32℃)的未处理角质形成细胞中，CIRBP mRNA的表达显著增加59％。
在暴露于体温过低应力之前用1％的卤虫提取物处理的角质形成细胞的情况中，与在37℃下用提取物预处理的角质形成细胞相比，它们的CIRBP mRNA水平增加12％，并且与32℃下的未处理对照角质形成细胞相比，CIRBP mRNA水平降低33％。
结论：
与未处理的对照细胞相比，在用实施例1的卤虫提取物预处理并经受体温过低的角质形成细胞中观察到较低水平的CIRBP mRNA。
实施例 4 ：实施例 1 的提取物对经皮水分丢失 (TEWL) 的作用
目的：
该研究评价根据实施例1获得的卤虫提取物对暴露于热应力的皮肤的保护功效，特别是对热/冷应力期间经皮水分丢失(TEWL)的功效。经皮水分 丢失(TEWL)是间接反映皮肤的渗透性和屏障功能的参数(Toby Mathias等人,1981)。热/冷应力模拟夏天和冬天内部和外部的温度差异。
方案：
该研究对19位年龄为21-52岁的志愿者(包括“成熟”组(年龄48-57岁)中的9位和“年轻”组(年龄21-34岁)中的10位)进行。
根据志愿者，皮肤的性质为正常或干燥的，无皮肤病理学，并且为表型2-4。
测试以双盲法(用1％的实施例1的卤虫提取物)进行，并持续3周。
将实施例1的卤虫提取物和安慰剂在各个大腿的相同区域上以产品浓度每天施用2次(早晨和晚上)。
所施用的产品的量为2mg/cm2。
热应力处理：首先，将加热垫(电加热垫)施用在大腿上持续10分钟。之后立即施用冰袋((EZY WRAP)冰袋)持续10分钟。
使用蒸发计(Cortex Technology)评价经皮水分丢失(TEWL)。测量值以g/m2/h表达，并且当标准差为0.1时或60秒后被中断。在控制的温度和湿度条件(21℃±1和50％±5)下取测量值。
制备方法：
1)基线测量，
2)产品的施用，
3)在应力前的第0天至第21天和应力后的第21天的测量。
为了分析结果，我们观察了获得TEWL测量曲线坪的时间。该时间对应于皮肤恢复(即在热应力后恢复为基线状态)所花费的时间。我们称该时间为“恢复时间”。然后我们统计学比较用实施例1的提取物处理的区域和用安慰剂处理的区域的恢复时间。
在应力后，每2分钟取TEWL测量值。
结果：
我们注意到用卤虫提取物处理的区域比用安慰剂处理的区域更快地达到曲线坪。
用卤虫提取物处理的区域的恢复时间比用安慰剂处理的区域显著快27％。
结论：
与安慰剂相比，在用实施例1的卤虫提取物处理的区域上，在冷-热热应力后的TEWL值更快地恢复至正常。该结果表明卤虫提取物有助于皮肤在热/冷热应力后更快地恢复。
实施例 5 ：组合物的制备
1. 保护性乳膏剂
制备方法
1.将A相在主槽中均质化。
2.喷洒在B相上，并均质化10分钟，然后开始加热至50℃，并充分混合30分钟。
3.降低温度并加入C相。充分混合以均质化。
4.在放置在一边的烧杯中制备D相，加热至55-60℃直至均质化，并降低温度。
5.向主槽中逐个加入E相的成分，在各次加入之间充分混合。
6.向主容器中加入D相(在环境温度下)，并混合直至均质化。
7.在25°下，加入F相，并充分混合。
8.预混合G相，然后将其加入主槽中。
9.逐个加入H相的成分，在各次加入之间充分混合。
10.在25℃下停止。
2. 用于男性的保湿乳膏剂
制备方法
1.将A相在主槽中均质化。
2.喷洒在B相上，并均质化10分钟，直至均匀。
3.在放置在一边的烧杯中制备C相，均质化直至均匀。喷洒D相,并充分混合，直至均匀。
4.在25℃下，向主容器中加入C+D相，并混合直至均匀。
5.在25℃下，向主容器中加入E相，并混合直至均匀。
6.在25℃下，向主容器中加入C相，并混合直至均匀。
7.在25℃下停止。
3. 眼霜
制备方法
1.向主槽中加入水，并开始加热至80℃。
2.在60℃下喷洒在B相中，并充分混合，直至均匀。
3.在80℃下加入C相，充分混合并加入D相。
4.向放置在一边的烧杯中加入E相的成分，并加热至75-80℃。
5.在80℃下，向主槽中加入E相，并充分混合。乳液应为均匀的。
6.开始冷却。
7.在65°下，加入F相，并充分混合。
8.冷却至30℃，并加入G相，然后加入H相，在各相间充分混合，直至均匀。
9.在25℃下停止。