技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，涉及一种超小的牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤具有死亡率高、难治疗以及恶化迅速等特点，一直都是危害人类生命的头号杀手。因此，肿瘤的早期诊断和特异性治疗显得尤为重要。目前，肿瘤的检测手段主要有：超声成像、CT成像、核医学PET成像以及核磁共振成像(MRI)。随着核磁共振技术的发展，其扫描时间逐渐缩短，分辨率逐渐提高，对于小病灶的检测也更加准确，这也使得核磁共振成像技术成为近几年发展起来的新型疾病检测手段。为了提高MRI成像诊断的灵敏度和特异性，有必要选择合适的MRI造影剂。磁共振成像造影剂根据氢质子浓度在不同扫描序列条件下所给出的信号强度的差异，主要分为两类：T1成像造影剂，如含Gd3+和Mn2+等顺磁性金属离子配合物及其纳米粒子；T2成像造影剂，如MFe2O4(M＝Zn、Ni、Mn、Fe)。相对于T2成像造影剂而言，T1成像造影剂在软组织检测方面表现出明显的优势。但是，因Mn2+和Gd3+配合物固有的不稳定性，易导致其释放出具有毒副作用的Mn2+和Gd3+离子；其次，由于毒性的原因，使用剂量不高，不能产生足够的信号强度，给疾病(如肿瘤)早期诊断的准确性带来一定程度的困难；第三，由于Mn2+和Gd3+配合物在体内血液循环中的留存时间不足，导致观察时间窗口较短，限制了它的应用；第四，对于Mn2+和Gd3+的纳米粒子而言，由于分解和代谢缓慢，具有潜在的毒副作用，也限制了它们的研究和推广。因此，开发出具有良好生物相容性、易于排出体外、毒性小以及T1成像效果的纳米造影剂是目前亟待解决的重要课题。
按照驰豫率理论以及内、外球弛豫原理，T1成像造影剂也具有T2成像性能，只是T2成像的信号相对较弱；而对于T2成像造影剂，存在Brownian和Nèel两种弛豫影响，在表现T2成像性能的同时，同样也表现出T1成像功能，只是信号较弱而已，这些结论在Fe3O4已有的文献中已经得到了验证。随着纳米粒子尺寸的减小，会导致纳米粒子表面的电子自旋呈现无序，从而表现出顺磁性的磁学性质，因而导致它们呈现出T1成像效果。另外纳米粒径的减小，还可以使其很容易被肾脏清楚，从而降低因为长期滞留生物体内而导致的安全隐患。因此，作为T1成像造影剂的超小的Fe3O4纳米粒子具有非常好的应用前景。
纳米材料应用于生物体内，必须具有生物相容性。牛血清蛋白(BSA)作为一类生物大分子，具有很多独特的优点。第一，BSA包含多个氨基酸残基、二硫键及自由巯基，而-COOH、-OH、-NH和-SH等极性官能团具有极其良好的成键特性，对金属离子的排列与分布能有效控制，进而诱导相关纳米晶成核，合成有序结构的纳米材料。第二、BSA包覆于纳米材料的表层，形成了功能性配体，其本身的活性基团具有良好的化学活性，便于后期的表面改性及应用拓展。第三，BSA制备简单，价格低廉。诸多优点使得BSA可以作为一种有效的表面活性用于制备纳米材料。目前报道的基于BSA的生物材料都是多是通过两步法制备。例如，申请号为201410148692.4的中国发明专利公开的技术方案，首先通过其他表面活性制备的出纳米粒子，然后通过配体交换的方法，将BSA替换到纳米粒子的表面。但是这种两步法容易导致交换前后纳米材料性质发生变化，例如，吸收会发生偏移。因此，直接利用BSA做模板剂，通过一步法制备生物兼容性材料可以克服两步法的缺点。相比于现有技术，本发明则是利用BSA为模板剂，通过BSA和Fe生成的强的配位化合物为前驱体，一步法制备具有T1造影效果的BSA包覆的超小的Fe3O4纳米粒子。
发明内容
本发明的目的利用BSA-Fe配合物对铁源的强束缚力，控制四氧化三铁纳米粒子的过快生长，从而一步制备出具有生物相容性好、易于排出体外、毒性小以及T1成像效果的纳米四氧化三铁造影剂。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂的制备方法，该方法具体包括以下步骤：
(1)将牛血清蛋白溶于二次水A中，超声溶解，制得牛血清蛋白溶液；
(2)将可溶性三价铁盐与可溶性二价铁盐一起加入二次水B中，溶解，制得铁源溶液；
(3)将牛血清蛋白溶液置于惰性氛围中，边加热边搅拌，并向牛血清蛋白溶液中加入铁源溶液，制得BSA-Fe前驱体；
(4)升温至50-100℃，再迅速加入浓氨水，恒温反应5-30min，即制得所述的牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂。
步骤(1)所述的牛血清蛋白与二次水A的质量比为1:200-500。
步骤(2)所述的铁源溶液中的可溶性三价铁盐的质量浓度为0.05-0.08g/mL，可溶性二价铁盐的质量浓度为0.02-0.04g/mL。
步骤(2)所述的可溶性三价铁盐为FeCl3·6H2O，所述的可溶性二价铁盐为FeSO4·7H2O。
所述的二次水A与二次水B的体积之比为20-30:1。
步骤(4)所述的浓氨水的质量浓度为25-28％。
所述的浓氨水与二次水A的体积之比为1:8-12。
采用上述制备方法制成的牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂。
羧基和铁离子具有非常强的络合作用，而BSA本身含有大量的羧基，因此将BSA和铁离子很容易形成配合物(BSA-Fe)，而BSA和铁离子之间强的配位作用，使得BSA对铁离子具有强的束缚作用。当该BSA-Fe配合物遇到氨水以后，其中的铁源会在强碱性条件下共沉淀生成四氧化三铁。由于BSA对铁源的强的束缚力的存在，抑制了四氧化三铁纳米粒子的过快生长，从而可以通过BSA和反应时间来调控四氧化三铁纳米粒子的生长，制备出超小的四氧化铁纳米粒子(<10nm)。而BSA和铁的强配位作用也使得BSA会包覆在制备的四氧化铁表面，使得制备的超小四氧化三铁具有非常好的生物兼容性。本发明制备方法可以一步制备出具有生物相容性好、易于排出体外、毒性小以及T1成像效果的纳米四氧化三铁造影剂。
本发明方法中，首先采用化学共沉淀法合成超小四氧化三铁纳米粒子，并基于该超小的四氧化三铁纳米材料，将增强生物相容性的牛血清蛋白(BSA)通过配体交换的方式包覆到超小的材料表面，构建具有良好生物相容性的Fe3O4@BSA的诊疗平台。
与现有技术相比，本发明方法制备而成的Fe3O4@BSA具有良好的生物相容性，牛血清蛋白包覆于纳米材料的表层，形成了功能性配位，便于后期的表面改性，应用前景非常广阔。本发明制备方法简单，可控性好，所得牛血清蛋白包覆的四氧化三铁纳米粒子具有生物相容性好、易于排出体外、毒性小以及T1成像效果的特点。
附图说明
图1为实施例1制备得到的牛血清蛋白包覆四氧化三铁(BSA@Fe3O4)的不同分辨率的TEM图；
图2为实施例1制备得到的牛血清蛋白包覆四氧化三铁(BSA@Fe3O4)的XRD图；
图3为实施例1制备得到的牛血清蛋白包覆四氧化三铁(BSA@Fe3O4)的FTIR图；
图4为实施例1制备的超小牛血清蛋白包覆四氧化三铁的磁滞回线；
图5为实施例1制备的超小牛血清蛋白包覆四氧化三铁的弛豫率拟合图；
图6为实施例1制备的超小牛血清蛋白包覆四氧化三铁的MRI造影效果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
①称取0.0675g BSA于三口烧瓶，加入25mL二次水超声使其溶解；
②随后边加热边搅拌，并向烧瓶内通氮气除去氧气，并向其中加入铁源溶液(铁源溶液由0.0692g FeCl3·6H2O和0.0351g FeSO4·7H2O混溶于1mL二次水配成)；
③10min后换为氮气球保护，并用2mL乙醇消去通氮气产生的泡沫，使溶液完全澄清。
④待温度升至75℃时，迅速加入2.5mL 28％的浓氨水，维持75℃反应15min后，反应结束。
如图1所示，为本实施例制备所得BSA@Fe3O4的不同分辨率的TEM图，由图分析可知，制备而成的BSA@Fe3O4粒子的分散性较好，无团聚现象。
如图2所示，为本实施例制备所得BSA@Fe3O4的XRD图。
如图3所示，为本实施例制备所得BSA@Fe3O4的FTIR图，将BSA-Fe的红外光谱和纯的BSA相比较可知，BSA-Fe的红外吸收光谱，不仅仅体现了BSA的特征吸收(～1643、～1522cm-1等)，呈现了四氧化三铁的特征吸收(～600cm-1)。因此可以证明合成的四氧化三铁表面具有BSA的存在，即成功的制备了牛血清蛋白成功包覆四氧化三铁纳米粒子。
如图4所示，为本实施例制备的超小牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂的磁滞回线，具有超顺磁的特性，饱和磁化率也达到了32emu/g，高于文献报道的17emu/g(Adv.Funct.Mater.2012,22,2387)。
如图5所示，为本实施例制备的超小牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂的弛豫率拟合图，T1弛豫率高达44.1mM-1s-1，远高于文献报道的8.3mM-1s-1(Adv.Funct.Mater.2012,22,2387)。
如图6所示，为本实施例制备的超小牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂的T1加权的MRI造影效果图，从图上可以清楚的看出，该方法制备的超小四氧化铁纳米粒子，具有非常好的T1造影效果。
实施例2：
①称取0.0833g BSA于三口烧瓶，加入25mL二次水超声使其溶解；
②随后边加热边搅拌，并向烧瓶内通氮气除去氧气，并向其中加入铁源溶液(铁源溶液由0.0692g FeCl3·6H2O和0.0351g FeSO4·7H2O混溶于1mL二次水配成)；
③10min后换为氮气球保护，并用2mL乙醇消去通氮气产生的泡沫，使溶液完全澄清。
④待温度升至75℃时，迅速加入2.5mL 28％的浓氨水，维持75℃反应15min后，反应结束。
实施例3：
①称取0.125g BSA于三口烧瓶，加入25mL二次水超声使其溶解；
②随后边加热边搅拌，并向烧瓶内通氮气除去氧气，并向其中加入铁源溶液(铁源溶液由0.0692g FeCl3·6H2O和0.0351g FeSO4·7H2O混溶于1mL二次水配成)；
③10min后换为氮气球保护，并用2mL乙醇消去通氮气产生的泡沫，使溶液完全澄清。
④待温度升至75℃时，迅速加入2.5mL 28％的浓氨水，维持75℃反应15min后，反应结束。
实施例4：
①称取0.0675g BSA于三口烧瓶，加入25mL二次水超声使其溶解；
②随后边加热边搅拌，并向烧瓶内通氮气除去氧气，并向其中加入铁源溶液(铁源溶液由0.0692g FeCl3·6H2O和0.0351g FeSO4·7H2O混溶于1mL二次水配成)；
③10min后换为氮气球保护，并用2mL乙醇消去通氮气产生的泡沫，使溶液完全澄清。
④待温度升至75℃时，迅速加入5mL 28％的浓氨水，维持75℃反应15min后，反应结束。
实施例5：
①称取0.0675g BSA于三口烧瓶，加入25mL二次水超声使其溶解；
②随后边加热边搅拌，并向烧瓶内通氮气除去氧气，并向其中加入铁源溶液(铁源溶液由0.0692g FeCl3·6H2O和0.0351g FeSO4·7H2O混溶于1mL二次水配成)；
③20min后换为氮气球保护，并用2mL乙醇消去通氮气产生的泡沫，使溶液完全澄清。
④待温度升至75℃时，迅速加入2.5mL 28％的浓氨水，维持75℃反应15min后，反应结束。
实施例6：
①称取0.0675g BSA于三口烧瓶，加入25mL二次水超声使其溶解；
②随后边加热边搅拌，并向烧瓶内通氮气除去氧气，并向其中加入铁源溶液(铁源溶液由0.0692g FeCl3·6H2O和0.0351g FeSO4·7H2O混溶于1mL二次水配成)；
③10min后换为氮气球保护，并用2mL乙醇消去通氮气产生的泡沫，使溶液完全澄清。
④待温度升至75℃时，迅速加入2.5mL 28％的浓氨水，维持50℃反应15min后，反应结束。
实施例7：
①称取0.0675g BSA于三口烧瓶，加入25mL二次水超声使其溶解；
②随后边加热边搅拌，并向烧瓶内通氮气除去氧气，并向其中加入铁源溶液(铁源溶液由0.0692g FeCl3·6H2O和0.0351g FeSO4·7H2O混溶于1mL二次水配成)；
③10min后换为氮气球保护，并用2mL乙醇消去通氮气产生的泡沫，使溶液完全澄清。
④待温度升至75℃时，迅速加入2.5mL 28％的浓氨水，维持100℃反应15min后，反应结束。
实施例8：
本实施例牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将牛血清蛋白溶于二次水A中，超声溶解，制得牛血清蛋白溶液；
(2)将可溶性三价铁盐与可溶性二价铁盐一起加入二次水B中，溶解，制得前驱体溶液；
(3)将牛血清蛋白溶液置于惰性氛围中，边加热边搅拌，并向牛血清蛋白溶液中加入前驱体溶液；
(4)升温至100℃，再迅速加入浓氨水，恒温反应5min，即制得牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂。
步骤(1)中，牛血清蛋白与二次水A的质量比为1:200。
步骤(2)中，前驱体溶液中的可溶性三价铁盐的质量浓度为0.08g/mL，可溶性二价铁盐的质量浓度为0.04g/mL。其中，可溶性三价铁盐为FeCl3·6H2O，可溶性二价铁盐为FeSO4·7H2O。
步骤(4)中，浓氨水的质量浓度为28％。
本实施例中，二次水A与二次水B的体积之比为20:1。浓氨水与二次水A的体积之比为1:12。
实施例9：
本实施例牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将牛血清蛋白溶于二次水A中，超声溶解，制得牛血清蛋白溶液；
(2)将可溶性三价铁盐与可溶性二价铁盐一起加入二次水B中，溶解，制得前驱体溶液；
(3)将牛血清蛋白溶液置于惰性氛围中，边加热边搅拌，并向牛血清蛋白溶液中加入前驱体溶液；
(4)升温至50℃，再迅速加入浓氨水，恒温反应30min，即制得牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂。
步骤(1)中，牛血清蛋白与二次水A的质量比为1:500。
步骤(2)中，前驱体溶液中的可溶性三价铁盐的质量浓度为0.05g/mL，可溶性二价铁盐的质量浓度为0.02g/mL。其中，可溶性三价铁盐为FeCl3·6H2O，可溶性二价铁盐为FeSO4·7H2O。
步骤(4)中，浓氨水的质量浓度为25％。
本实施例中，二次水A与二次水B的体积之比为30:1。浓氨水与二次水A的体积之比为1:8。
实施例10：
本实施例牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将牛血清蛋白溶于二次水A中，超声溶解，制得牛血清蛋白溶液；
(2)将可溶性三价铁盐与可溶性二价铁盐一起加入二次水B中，溶解，制得前驱体溶液；
(3)将牛血清蛋白溶液置于惰性氛围中，边加热边搅拌，并向牛血清蛋白溶液中加入前驱体溶液；
(4)升温至80℃，再迅速加入浓氨水，恒温反应10min，即制得牛血清蛋白包覆四氧化三铁纳米粒子T1-MRI造影剂。
步骤(1)中，牛血清蛋白与二次水A的质量比为1:400。
步骤(2)中，前驱体溶液中的可溶性三价铁盐的质量浓度为0.07g/mL，可溶性二价铁盐的质量浓度为0.035g/mL。其中，可溶性三价铁盐为FeCl3·6H2O，可溶性二价铁盐为FeSO4·7H2O。
步骤(4)中，浓氨水的质量浓度为27％。
本实施例中，二次水A与二次水B的体积之比为25:1。浓氨水与二次水A的体积之比为1:10。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。