发明领域
本发明提供了唾液酸-结合化合物，其展示免疫调节作用。本文中所述化合物应用于治疗和/或预防一系列疾病，包括由上和/或下呼吸道病原体导致的那些疾病。
发明背景
很多病毒、细菌和真菌病原体依旧是对人类健康的威胁，并且是医疗服务的负担1。特别关注的是流感病毒，而最特别是高致病性H5N1病毒的出现和最近禽源H7N9病毒的引入2。这些病毒展现了获取人可传性的潜能，并且因此具有增加的健康威胁3-5。
虽然疫苗仍然是预防的奠基石，需要大量的时间被来开发针对这些新病原体的有效疫苗。可获得抗微生物药物(包括抗病毒特别是流感病毒神经氨酸苷酶抑制剂和抗生素)，但是它们的有效性可以被病原体突变并变得耐药的能力所折中6,7。显然，需要新的治疗方法。
一个题目为“利用来自霍乱弧菌唾液酸酶的CBM40模块改造多价的唾液酸识别(Engineering Multivalent Sialic Acid Recognition using the CBM40module from Vibrio cholerae Sialidase)”的海报(于2008年5月17日公开：见http://www.biochem.emory.edu/conferences/glycot/Images/GlycoTProgram-Po sters.pdf)描述了通过多价性开发具有增加的对唾液酸的亲和力的试剂。然而，海报没有揭示这样的试剂作为用于治疗病原体所致疾病和/或病况的免疫调节化合物的任何应用。
US20020054880(to Amstrong等人)描述了能够结合末端连接α-唾液酸(2→6)βGal-和/或α-唾液酸(2→3)βGal-基团的肽，以及它们在抑制哺乳动物中免疫应答或细胞相互作用的方法中的用途。没有公开唾液酸结合分子免疫调节的效应。
发明概述
本发明基于这样的研究结果，某些能够结合唾液酸的化合物，可以应用于疾病的治疗和/或预防，特别是具有微生物病原学的疾病，例如呼吸系统疾病。已知，呈现结合唾液酸能力的分子可应用于中和或预防病原体导致的感染，所述病原体利用宿主细胞表面上唾液酸的存在。例如，呼吸道病原体，如隶属于正粘病毒科或副粘病毒科的病毒和某些链球菌利用细胞表面含有唾液酸的受体以结合并进入多种哺乳动物组织中的特定细胞类型中。化合物，例如蛋白和肽(其结合于唾液酸部分和/或包含其的分子(例如细胞表面受体))，可以用于治疗和/或预防病原体所致的或促成的疾病，所述病原体利用细胞表面唾液酸受体作为结合或附着细胞的手段。不希望被理论束缚，唾液酸结合分子可以干预和/或抑制、阻止和/或阻断病原体与细胞表面唾液酸受体之间的相互作用，从而阻止病原体的结合和/或附着。
本发明人现在已经发现，某些唾液酸结合分子除了干预或阻断、阻止和/或抑制病原体和例如，含有唾液酸的细胞表面受体之间的相互作用(或也许作为其结果或与之联合)之外，还具有免疫调节性质。
因此，在第一方面，本发明提供了唾液酸结合分子，其用于调节或启动受试者中的免疫应答。此外，本发明提供唾液酸结合分子，其用于调节或启动受试者中免疫应答的方法。
本发明提供唾液酸结合分子，其用于通过调节和/或启动宿主(例如，具有发展为疾病或感染的风险或患有(或怀疑患有)所述疾病或感染的受试者)免疫应答，治疗和/或预防疾病(由例如细菌、真菌和/或病毒病原体导致)。
本发明可以进一步提供唾液酸结合蛋白，其用于生产药物，所述药物用于调节受试者中的免疫应答。此外，本发明提供了一种调节受试者中免疫应答的方法，该方法包括向需求其的受试者施用免疫调节(或免疫刺激)量或数量的本发明中的唾液酸结合蛋白。
应该注意的是，在整个说明书中，术语“包含(comprise)”和/或“包含(comprising)”用于指代本发明的各个方面和/或实施方案“包含”记录的特征，并且因此，也可以包括其他的特征。然而，本发明的背景下，术语“包含(comprise)”和/或“包含(comprising)”包括其中本发明“基本上由”相关特征“组成”或“由”相关特征“组成”的实施方案。
与本发明的唾液酸结合蛋白–特别是本文中描述的多价的碳水化合物结合模块相关的一个优点(见下文)，是它们启动宿主免疫系统，因此能更好的应对由本文中所述类型的病原体导致的或促成的感染和/或疾病。不希望被任何特定的理论束缚，本发明人建议，本发明的唾液酸结合分子可以用于预防性治疗以保护受试者不仅抵抗目前的感染和/或疾病，还抵抗以后的感染和/或疾病。进一步地或备选的，本发明的唾液酸结合分子可以在感染后施用–例如施用给已经被病原体感染的受试者(这样的受试者可以是无症状的或是有症状的)。本发明人已经表明，甚至在“感染后”给药时，本发明的唾液酸分子可以促进疾病、感染或病原体的解决和/或清除。
术语“调节”或“免疫调节”(或“免疫刺激”)，如用于所观察到的本发明的各种唾液酸结合分子对宿主免疫应答的效果的，包括免疫系统的任意启动和/或免疫系统过程、通路和/或其任意一种或多种成分的表达、功能和/或活性的(免疫)调节(如增加或降低)。如用于免疫应答的术语“启动”，可以包括增加免疫系统对免疫原、抗原、病原体、疾病或感染的容易度和/或应答的现象。不希望被理论束缚，除了与本发明的唾液酸结合分子相关的任何免疫调节性质之外，可以使施用唾液酸结合分子或与唾液酸结合分子接触的受试者更加能够应对感染/疾病的发生。
例如，本发明可以提供的唾液酸结合分子，其增加或增强一种或多种免疫调节化合物的表达、功能和/或活性，所述化合物包括，例如，趋化因子和/或细胞因子分子和/或编码其和/或与其相关的任何基因/转录因子。
因此，本文中描述的唾液酸结合分子可以调节免疫系统的一种或多种细胞因子和/或趋化因子分子的功能、表达和/或活性。具体而言，唾液酸结合分子可以调节与对病原体导致的感染的免疫应答相关的一种或多种细胞因子或趋化因子分子的功能表达和/或活性。所述感染可以由一种或多种病毒、细菌和/或真菌病原体所导致的或促成的，如下文将更详细描述的。
其功能、表达和/或活性受本文中描述的唾液酸结合蛋白调节的细胞因子和/或趋化因子，可以共同称为“感染相关的细胞因子/趋化因子”。术语“感染相关的细胞因子/趋化因子”可以包括正常情况下与免疫应答相关，促进感染的清除和/或解决的那些细胞因子/趋化因子。例如，术语可以包括促炎性、抗病毒和/或前噬菌细胞的细胞因子/趋化因子。因此，本发明的唾液酸结合分子可用作调节一种或多种感染相关细胞因子/趋化因子和/或一种或多种促炎性、抗病毒和/或前噬菌细胞/细胞毒性细胞因子/趋化因子的方法。
本发明人已经注意到，本发明的唾液酸结合分子可诱导，例如，白细胞介素1-β(IL1-β)、白细胞介素8(IL-8：研究表明MIP-2表达的增加，IL-8的鼠同源物)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的增加的表达。技术人员将理解，能够调节，例如增加IL1-β的表达、功能和/或活性的分子，将对例如由该细胞因子(至少部分)调节的炎性反应具有作用。相似的，假定IL-8参与了趋化作用和吞噬作用，该细胞因子的表达、功能和/或活性的任何方面的调节可能调节受试者中的免疫应答。干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α是公知的天然免疫和适应性免疫应答的介质，并且因此调节(例如)增加这些细胞因子表达、功能和/或活性的化合物可被认为是免疫调节化合物。
本发明的唾液酸结合分子可进一步调节(例如诱导或增加)免疫细胞至感染位点的募集、增殖和/或迁移。例如，在施用本发明的唾液酸结合分子的受试者中，免疫细胞的募集、增殖和迁移过程可以加剧至某种程度和/或更快。
鉴于以上，本发明提供了唾液酸结合分子，其用于刺激、增强或增加受试者中一种或多种趋化因子和/或细胞因子的表达功能和/或活性。此外，本发明提供了唾液酸结合分子，其用于刺激、增强或增加受试者中一种或多种趋化因子和/或细胞因子的表达功能和/或活性的方法。
本发明可进一步提供唾液酸结合蛋白用于生产药物的用途，所述药物用于刺激、增强或增加受试者中一种或多种趋化因子和/或细胞因子的表达功能和/或活性。此外，本发明提供刺激、增强或增加受试者中一种或多种趋化因子和/或细胞因子的表达功能和/或活性的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用免疫调节量或数量的本发明的唾液酸结合蛋白。
“受试者”或“需要其的受试者”可以，例如，是任何人或动物(哺乳动物)受试者。因此，本发明的唾液酸结合分子可以应用于调节人和/或动物受试者中的免疫应答。
本发明的免疫调节化合物可以应用于治疗和/或预防疾病或感染–特别是，但是不限于，由病原体导致的或促成的疾病或感染，所述病原体能够结合和/或附着于含有唾液酸的细胞表面受体。术语“病原体”可以包括，例如，病毒、细菌、原生动物和/或真菌病原体，其中的一些可以具有与宿主细胞含唾液酸受体相互作用和/或相关和/或结合于其的能力。因此，本发明可应用于治疗和/或预防由病毒、细菌、原生动物和/或真菌病原体导致的或促成的呼吸道疾病/感染，其中的一些可以利用在上和下呼吸道的表面成层(lining)的上皮细胞表面上含有唾液酸的受体的存在。
因此，“受试者”(不论是动物或人)，可以是有症状的和/或(怀疑)患有感染或疾病，例如呼吸道感染或疾病。备选地，受试者可以是无临床症状的和/或倾向于/易于受到感染或生病，例如呼吸道感染或疾病。在所有情况下，感染或疾病是含有一种微生物的(例如细菌、病毒、原生动物和/或真菌病原)。.
例如，受试者的免疫应答可以通过本发明的免疫调节(唾液酸结合)化合物调节，从而启动该受试者的免疫系统(通过诱导或刺激一种或多种趋化因子和/或细胞因子的表达、功能和/或功能)，从而更加能够应对本文中描述的类型的病原体导致的或促成的感染和/或疾病。
呼吸系统疾病和/或感染可以由呼吸系统病原体导致或促成，例如属于正粘病毒科或副粘病毒科的病毒和某些链球菌，其利用细胞表面含有唾液酸的受体结合和/或进入特定细胞类型中。例如，呼吸系统疾病可以由病毒呼吸道病原体，如例如流感病毒和/或副流感病毒和细菌病原体，如流感嗜血杆菌(haemophilussp)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)所导致或促成。因此，本发明提供了唾液酸结合分子，其可以用于调节(增强、刺激和/或增加)免疫应答，所述免疫应答促进具有病毒、细菌、原生动物和/或真菌病因的呼吸系统疾病的清除和/或解决。例如，可以利用本发明，从而刺激、增强和/或增加免疫应答，其有利于和/或促进治疗和/或预防由，例如，属于正粘病毒科或副粘病毒科的病毒和某些嗜血杆菌属和/或链球菌导致或促成的疾病和/或病状。这些疾病和/或病状可以包括，但不限于，流感以及病毒和/或细菌性呼吸系统疾病，如哮吼、肺炎和支气管炎。
如所述的，本发明不应被认为限于治疗和/或预防由呼吸系统病原体所导致或促成的感染和/或疾病，而是，本发明提供调节免疫应答的化合物，从而它们更加能够应对由多种的不同的病原体所导致的或促成的疾病和/或感染。例如，本发明可以应用于治疗和/或预防疾病和/或由微生物病原体所导致或促成的感染，该病原体不是必须利用细胞表面唾液酸部分的存在-但是其仍可以导致宿主中的感染和/或疾病。例如，本发明人已经发现本发明的唾液酸结合分子可以用于调节(增强、刺激或提高)免疫应答，其促进疱疹病毒科(Herpesviridae)的病毒的清除和/或由此导致或促成的疾病的解决。例如，本发明可以应用于治疗和/或预防由，例如γ疱疹病毒(gammaherpesvirina)导致或促进的感染或疾病。
此外，本发明人已经发现除了启动免疫系统以针对感染后临床重大疾病的发展提供防护，一定程度的病原体(例如病毒)复制仍在宿主内发生。病原体复制的该“基线”水平可以保证在施用本发明的唾液酸结合蛋白(该施用调节宿主免疫应答)之后，宿主仍然可以增强免疫应答，其可以针对未来的病原体暴露提供防护。的确，数据显示在病毒感染的情况下，在感染前施用唾液酸结合分子不仅可以阻止后续的感染(通过启动和/或调节免疫系统以有利于宿主)，仍然存在可检测的病毒滴度和由宿主产生对病原体特异的抗体，该抗体针对后续感染提供防护。
因此，当在任何感染发生前施用给受试者，本发明的免疫调节化合物可以通过调节免疫同和免疫系统的启动，促进病原体载量的降低，其相应帮助清理感染并减少临床症状。
在本文中使用的术语“唾液酸”包括所有形式的N-或O-取代的神经氨酸，并包括其所有合成的、天然存在的和/或修饰的形式。发现唾液酸可以为细胞表面分子、糖蛋白和糖脂的成分。最常见的，唾液酸存在于糖链的末端(末端区域)，该糖链连接于细胞膜和/或蛋白。唾液酸家族包括很多(大概50种)的衍生物，其可以来源于乙酰化作用、糖基化作用、内酯化和在C4、C5、C7、C8和C9的甲基化。所有这些衍生物都可以由术语“唾液酸”包括。
此外，发现唾液酸α(2,3)或α(2,6)连接于于Gal和GalNAc或α(2,8)或α(2,9)连接于另一个唾液酸。因此，重要的是认识到当术语“唾液酸”在本说明书至始至终使用时，其包括其所有衍生物、类似物或变体(或是天然存在的或合成产生的)，以及包含其的单体、二聚体、三聚体、寡聚体、多聚体或多联体。
本发明的唾液酸结合分子对唾液酸呈现亲和力，所述唾液酸包括所有形式的上述的唾液酸，并且特别是哺乳细胞表面存在的唾液酸。例如，本发明的分子可以对包含唾液酸的细胞膜受体呈现亲和力。这种类型的细胞受体可以存在于上皮细胞的表面-包括粘膜和呼吸道的上皮细胞。很多病原体，包括病毒和/或细菌病原体可以表达对唾液酸呈现亲和力的分子。这种类型的病原体进化为利用细胞表面唾液酸部分作为结合宿主细胞的方法。一旦通过例如宿主细胞表面结合的唾液酸部分结合到细胞，病原体可以聚集(colonise)到细胞表面和/或感染/进入细胞。
本发明的唾液酸结合分子可以对α-2,6-连接的唾液酸受体呈现亲和力，所述受体主要存在于人上呼吸道的细胞上。此外或备选地，唾液酸结合受体可以对上和下呼吸道的细胞上存在的α-2,3-连接的唾液酸受体呈现亲和力。
应该理解的是，那些对唾液酸呈现亲和力的分子，能够结合唾液酸部分或者否则偶联于唾液酸部分或与唾液酸部分关联。因此，术语“唾液酸结合分子”可以包括任何保留有结合唾液酸部分或者否则偶联于唾液酸部分或与唾液酸部分关联的能力的片段。
本发明的唾液酸结合分子可包括能够结合唾液酸(例如单体或单价分子)的单一分子或者，备选地，两个或更多的唾液酸结合分子(例如其可以全部相同或不同-聚合的或多价的分子)。
本发明的唾液酸结合分子可以包括一种或多种被称为“碳水化合物结合模块”(CBMs)的分子。合适的CBMs可以对唾液酸呈现亲和力。用于本发明的典型的碳水化合物结合模块可以包括霍乱弧菌NanH唾液酸酶的唾液酸结合结构域(VcCBM)和/或肺炎链球菌NanA唾液酸酶中的相当的(或同源的)结构域(SpCBM)。当然，存在于其他生物中的相似的或同源的唾液酸结合分子包括在术语“CBM”的范围内。
示例性的霍乱弧菌NanH唾液酸酶氨基酸序列以登录号A5F7A4储存，并以SEQ ID NO:1(781个氨基酸)在下文再现。
SEQ ID NO:1的CBM区域来自氨基酸残基25至216–这个序列可以是SEQ ID NO:2。
示例性的肺炎链球菌NanA唾液酸酶氨基酸序列以登陆号P62575储存，并以SEQ ID NO:3(1035个氨基酸)在下文再现。
SEQ ID NO:3的CBM区域来自氨基酸残基121至305–该序列可以是SEQ ID NO:4。
一个合适的CBM可以包含由霍乱弧菌的nanH基因(编码唾液酸酶)的唾液酸结合结构域编码的蛋白质结构部分，或另一种生物中存在的相当或同源基因例如肺炎链球菌(S.pneumonia)的相当/同源nanA唾液酸酶基因)。例如，本发明的唾液酸结合分子可以包括霍乱弧菌唾液酸酶的从大约残基1、5、10、15、25或30(即，从1-30或从其之间的任意氨基酸残基)至大约残基150、175、200、210、216、220-781(至从150至781的任一残基，包括其间的任意残基)。唾液酸结合结构域可以包括从大约残基25至大约残基216。
进一步的合适的CBM可以包括由肺炎链球菌nanA基因(编码唾液酸酶)的唾液酸结合结构域编码的蛋白部分。例如，本发明的唾液酸结合分子可包含肺炎链球菌(S.pneumonia)唾液酸酶的从大约残基80、90、100、110、120、121至130(例如，从大约残基80-130的任一个，包括其间的任一残基)至大约残基250、275、300、305、310、320-1035(即，至从大约残基250-1035的任一残基，包括至其间的约任一残基)。唾液酸结合结构域可以包括从大约残基121至大约残基305。
本发明的唾液酸结合分子可以包括一个或多个CBM。例如合适的唾液酸结合分子可以包括单个CBM–例如，单个VcCBM或单个SpCBM。备选地，唾液酸结合分子可以包括多数或多个(即两个或多个)CBM。含有多个CBM的唾液酸结合分子可以称为“多价的唾液酸结合分子”或“多价的CBMs”。多价的CBM可以，例如，包括两个或多个VcCBM或两个或多个SpCBMs。多价的CBM可以包括不同CBM的混合物，例如一个或多个VcCBMs连同一个或多个SpCBMs。
本发明的多价的唾液酸结合分子可以进一步包括寡聚化结构域。合适的寡聚化结构域可以呈现自我关联以形成多聚体结构，例如三聚体的能力。例如一个或多个(例如两个)唾液酸结合分子(例如CBM)可以结合、偶联或融合于寡聚化结构域。寡聚化结构域可以包括任何具有上述性质的分子或其功能性片段。
合适的寡聚化结构域可以来源于，例如，铜绿假单胞菌伪唾液酸酶。示例性的铜绿假单胞菌伪唾液酸酶氨基酸序列以登陆号PAO579保存，并以SEQ ID NO:5(438个氨基酸)在下文重现。
SEQ ID NO:5的三聚化结构域从氨基酸残基333至438–该序列可以是SEQ ID NO:6。
应用于本发明的寡聚化结构域可以包括铜绿假单胞菌伪唾液酸酶三聚化结构域(PaTD)的从大约残基250、275、300、310、320、333、340至350(即，从大约残基250至大约残基350，包括从其中的大约任一残基)至大约残基400、410、420、430或438(即，至约从大约残基400至残基438的任一残基，包括至其中的约任一残基)。合适的三聚化结构域可以包括SEQ ID NO:6的残基333至438。
根据上述内容，术语“唾液酸结合分子”或者“碳水化合物结合模块”包括如图1d所示的每一个多价的分子。
不希望被理论所束缚，本发明人已经发现，尽管单独的唾液酸结合蛋白可能呈现低的唾液酸亲和力，而含有两个或者多个唾液酸结合分子(例如两个或者多个CBM)的多价的分子通过亲合力呈现出提升的亲和力。
因此，本发明提供了多价的唾液酸结合分子，其包含，例如，一个或者多个VcCBM或者SpCBM，其用于调节受试者中的免疫应答(的方法)。本发明可利用一个或者多个图1所描述的多价的唾液酸结合蛋白。
例如，多价的唾液酸结合分子可包括两个或者多个VcCBMs，其任选地融合、结合或者缀合于寡聚化结构域(如，PaTD或者其片段)，用于调节受试者中的免疫应答(的方法)。用于调节受试者的免疫应答(的方法)的多价的唾液酸分子可以包括两个融合的(或者结合的)VcCBM，由两个融合的(或者结合的)VcCBM组成或者主要由两个融合的(或者结合的)VcCBM组成，所述VcCBM相应融合于寡聚化结构域(见，例如，图1所示的分子Vc2CBMTD)。
本发明可进一步提供多价的唾液酸分子，其包括两个或者多个任选地融合、结合或者缀合于寡聚化结构域(如，PaTD或者其片段)的SpCBM，用于在受试者中调节免疫应答的方法。用于调节免疫系统的多价的唾液酸分子可包括两个融合的(或者结合的)SpCBM、由两个融合的(或者结合的)SpCBM组成，或者主要由两个融合的(或者结合的)SpCBM组成，所述SpCBM相应融合于寡聚化结构域(见，例如，图1所示的分子Sp2CBMTD)。
应该理解的是，多种的多价的CBMs(包括如图1中所示的Vc2CBMTD和Sp2CBMTD)可以应用于调节受试者中免疫应答的方法中，所述方法包括施用免疫调节量的多价的CBM。
本发明人已经注意到，甚至当以小的剂量施用受试者时，本发明的唾液酸结合分子诱导针对呼吸道(例如病毒和/或细菌)病原体后续攻毒的感染的保护。保护的时长可以持续约1到约21天之间的任意时间–实际的时长可取决于唾液酸结合分子的形式和/或施用(或要施用)的分子的剂量。“保护时长”可以定义为向受试者施用本发明的唾液酸结合蛋白后的时长，在这期间，受试者在感染后不发展疾病或者实际上没有其临床症状。保护时长可以持续大约14天，或者大约7天。保护的时长可以持续约1天至约2、3、4、5或者6天。
本发明提供组合物，例如药物的组合物，其包含本文中描述的任何的唾液酸结合分子。组合物可以作为药物应用于调节免疫应答或者应用于调节本文中描述的免疫应答的方法。
本发明的唾液酸结合蛋白可以配制成和/或制备用于，例如，口服的、肠胃外的、局部的和/或粘膜的/吸入给药。例如,本发明的唾液酸结合蛋白可以配制为适合于施用给受试者的无菌的药物组合物。这样的制剂可以包括药用赋形剂、载体或者稀释剂，其包括，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油,乙醇、离子交换剂、铝土、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白，例如血清白蛋白、缓冲物质，如磷酸盐,甘氨酸,山梨酸,山梨酸钾,饱和植物脂肪酸的部分甘油酯的混合物、水盐或者电解液,如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素系物质、聚乙烯糖基、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂等，或其组合。
配制用于局部给药的组合物可以以软膏、溶液或者水或者非水液体中的悬浮液，或者以水包油的液体乳状液提供。
用于肠胃外给药(例如，通过皮下的、皮内的、肌肉内的和/或静脉内的注射)的配制的或制备的组合物，可以包括水溶或者油悬浮液，其根据已知的工艺，采用合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂配制。在这一点上，技术人员将理解，可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂可以包括1,3-丁二醇、水、林格溶液，和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、非挥发性油常规用作溶剂或者悬浮介质。为此，可以使用任何无添加的非挥发性油，包括合成的甘油单酯或者甘油二酯。此外，脂肪酸，如油酸，可以应用于根据本发明的可注射组合物的制备。
适合(或者配制)用于粘膜给药的组合物可以包括要鼻内给药的组合物。这样的组合物可以包括要给药的唾液酸结合分子的溶液和/或用于气溶胶分散，或者分散在饮用水中的颗粒(包含所述唾液酸结合分子)。当分散的这样的组合物应当希望具有10至200微米的范围内的颗粒直径以使得能停留在，例如，鼻腔中时；这可以通过酌情采用合适的颗粒大小的粉末或者合适的阀的选择实现。其他的适合的组合物包括具有范围在20至500微米的颗粒直径的粗粉，用于经过鼻道从一个置于接近于子的容器快速吸入，和包含水或者油溶液或者悬浮液中0.2到5％w/v的活性化合物的滴鼻剂给药。
技术人员将理解，本发明的唾液酸结合蛋白–特别是基于CBM的(本发明的单/多价分子)，可以以用于引入细胞或在细胞中表达的载体的形式提供。
本发明的组合物(即，包含唾液酸结合蛋白的组合物)可以进一步包含一个或多个额外的化合物–如，例如其他的治疗部分，疫苗成分、佐剂(即任何增强或提高免疫的宿主的免疫应答的试剂)等。
本发明的组合物可以以单个或多个剂量的有效剂量给药。例如，两个或者多个剂量可以经预定的时期给药。
以举例的方式说明，可以施用起始剂量，在起始剂量后以1、2、3、4、5、6、7、8、9和/或10周的间隔接着一个或多个“加强”剂量(第二剂量)。
本发明的唾液酸结合分子可以施用给需要其的受试者(例如，施用于粘膜的组织和/或鼻内或者通过气溶胶施用入肺)，以一个或多个剂量施用给健康受试者。健康的受试者是未患有由微生物病原体，如,例如微生物呼吸道病原体导致的或促成的疾病或者病况的受试者。显示在感染前施用多至约10天，例如1、2、3、4、5、6和/或7天的唾液酸分子，提供针对后续病原体的攻毒的防护。
各种唾液酸结合蛋白，本发明的CBM和/或Sp2CBMTD可以以约0.1、1、10、和100μg/受试者/天的剂量给药。唾液酸结合蛋白，本发明的CBM和/或Sp2CBMTD可以在感染前或者可能感染前向健康者给药一次或多次。本发明的唾液酸结合蛋白，CBM和/或Sp2CBMTD可以肠胃外、口服给药和/或鼻内给药。
如所述的，本发明人已经注意，到当鼻内给药时，单一的1μg剂量的本发明的多价的唾液酸结合蛋白–特别是如图1中所描述的Sp2CBMTD分子，可以启动(或者刺激)免疫系统以提供多至大约多至约7、14或者21天的针对病原体，如呼吸系统病原体的攻毒的保护。此外，在流感H7N9感染前施用的0.1ug/受试者/天的剂量的Sp2CBMTD足以提供针对疾病和后续感染的完全保护。
本发明提供唾液酸结合分子，其用于调节受试者中的免疫应答，其中唾液酸结合分子施用到粘膜组织和/或鼻内。
此外，本发明提供唾液酸结合分子，其用于调节受试者中免疫应答的方法，其中所述方法包括将免疫调节剂量的唾液酸结合分子施用到粘膜的组织和/或鼻内。
根据以上内容，本发明可以提供疫苗组合物，其包含一个或多个本文中描述的唾液酸结合分子。本发明的疫苗组合物可以配制用于肠胃外的、粘膜的(喷雾的/鼻内的)和/或口服给药。本发明的唾液酸结合分子可以与疫苗分开或同时给药。当分开给药时，唾液酸结合分子可以在疫苗前和/或后施用给受试者。因此，本发明提供免疫接种受试者的方法，其中疫苗连同本发明的唾液酸结合分子一同(同时或分开)施用给受试者。本发明可以进一步涉及唾液酸结合分子，其用于通过免疫接种保护受试者免于疾病，其中所述唾液酸结合蛋白(要)与疫苗一起(同时或者分开)给药。
本发明的组合物(即，包含唾液酸结合蛋白的组合物)可以进一步包含一个或多个额外的成分–如，例如其他的治疗部分、疫苗组分、佐剂(即任何增强或者提高免疫的宿主的免疫应答的试剂)等。
在进一步的方面，本发明提供了编码本发明的任何唾液酸结合分子的核酸，包括，例如本文中描述的CBM或者唾液酸结合CBM片段。此外，本发明提供寡核苷酸和/或启动子序列，其与编码本发明的唾液酸结合分子的基因序列的部分互补。技术人员将理解，这种类型的寡核苷酸和/或启动子可用于本发明中的唾液酸结合分子的重组生产。
此外，本发明提供包含编码唾液酸结合分子的序列的核酸。该序列可以包含DNA和/或RNA。本发明的核酸序列可以采用载体或质粒的形式，例如适合用于重组技术的表达载体。本发明的核酸序列可以可操作地与转录调节因子连接和/或融合(直接地或者间接地)于编码标签部分的序列。本发明的核酸可以进一步包含编码寡聚化结构域的序列。
本领域技术人员将理解，本发明的任一唾液酸结合分子可以采用重组技术制备，其中，例如，宿主细胞用包含编码唾液酸结合分子的核酸序列的载体转化。重组产生的唾液酸结合分子可以包含“标签”或“标记”，其可以被用于亲和纯化技术以实现从源蛋白群体中和其他材料中纯化和/或分离唾液酸结合分子。
根据以上内容，本发明提供宿主细胞，其转化有本发明的核酸和/或载体。宿主细胞可以是微生物(例如，细菌宿主细胞)或者哺乳动物细胞。
因此，本发明提供了融合蛋白，其包含本发明的唾液酸结合分子，所述唾液酸结合分子融合、连接、结合或者缀合于异源蛋白，例如可检测的(或许是可光学检测的)部分和/或亲和纯化部分(例如His或者GST标签)。本发明的融合蛋白可以包含CBM(或者其唾液酸结合片段)和与其结合、缀合、连接或者融合的寡聚化结构域。这种类型的融合蛋白可以应用于多价的唾液酸结合分子(例如，多价的CBM)的产生。
在进一步的方面，本发明可以提供本发明的任一唾液酸结合蛋白，其用于治疗或者预防由以上提到的病原体中的任一种，包括，例如,本文中公开的的利用唾液酸的病毒、细菌、原生动物和/或真菌病原体导致的或促成的疾病和/或感染。例如，本发明的任何唾液酸分子可以用于药物。此外，图1中公开的CBM分子可以用作药物或者组合物，用于治疗或者预防呼吸系统疾病或者治疗呼吸系统疾病的方法。
本发明进一步提供如本申请的说明书和附图中描述的任何唾液酸结合分子。例如，本发明提供图1中所述一个或多个唾液酸结合分子。
本发明还提供了本发明的任意唾液酸结合蛋白，包括，例如,Sp2CBMTD，用于治疗流感，包括H7N9流感。还公开的是，本发明的唾液酸结合蛋白的应用，包括例如,Sp2CBMTD用于制造治疗流感，包括H7N9流感的药物的用途。本发明还提供了治疗流感，包括H7N9流感的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的本发明的唾液酸结合蛋白和/或Sp2CBMTD。不希望被理论所束缚,发明人已经注意到，施用Sp2CBMTD不影响到在攻毒后抗-HA抗体的产生，并且免疫应答的水平足以针对H7N9病毒的再次感染提供保护-包括用更高剂量的病毒再次感染。
详细说明
现在将参考以下发明描述本发明，其显示：
图1.多价的CBM形式的构建单元和它们对唾液酸的亲和力。a，VcCBM，具有如球形画出的α-2,3-唾液酸乳糖的霍乱弧菌唾液酸酶(PDB:1w0p)的残基25-216。b,SpCBM，具有α-2,3-唾液酸乳糖(PDB:4c1w)的肺炎链球菌(S.pneumoniae)NanA唾液酸酶的残基121-305。c,TD，三聚化结构域，彩色的铜绿假单胞菌唾液酸酶(PDB:2w38)的残基333-438；其他两个单体为单一颜色。d,多价形式：它们的分子量、化合价和对α2,3-唾液酸乳糖的结合亲和力(通过在25℃表面等离子共振(SPR)确定)(VcCBM、Vc2CBM和Vc3CBM的KD值已经在之前报道8)。串联重复CBM和融合于TD的寡聚CBM通过5-氨基接头连接(在完整方法中详述)。
图2.在以A/WSN/1933(H1N1)流感病毒致命性的攻毒后BALB/c小鼠的重量改变和肺病毒滴度。a，小鼠(n＝4)在单次鼻内施用500μg的Vc4CBM或者BSA(对照)后，在病毒攻毒前即刻的重量改变。b,感染后七天确定的小鼠中的肺病毒滴度。c,小鼠(n＝4)在单次鼻内施用三聚的(VcCBMTD,SpCBMTD,400μg)后或者六聚(Vc2CBMTD,Sp2CBMTD,100μg)生物制剂，或PBS(对照)后，在病毒攻毒前即刻的重量改变。d,小鼠感染后七天确定的小鼠中的肺病毒滴度。虚线指示的是病毒检测的极限。线条代表对于每个治疗组和对照组的平均值±s.d.。*p<0.05,**p<0.001,***p<0.0001。
图3.在用小鼠适应的A/California/04/2009(H1N1)流感病毒给予致死性攻毒的BALB/c小鼠中预防性施用mCBM的效果。a，在病毒攻毒前-1天给予单次鼻内剂量(50、250或500μg)的Vc4CBM或者(10、50或者250μg)的Vc2CBMTD或Sp2CBMTD的小鼠(n＝5)的存活和重量变化。b在病毒攻毒前，立即在第0天给予相同单次鼻内剂量的三种生物制剂的小鼠(n＝5)的存活和重量变化。对于每个给药日，存活曲线在顶端的图中显示，相应的重量减轻曲线在底端的图中，其中每个值表示5只小鼠的平均体重±s.d.。
图4.在用小鼠适应的A/California/04/2009(H1N1)流感病毒致死性攻毒前，施用以Sp2CBMTD的BALB/c小鼠的存活和重量变化。a第0天病毒攻毒前的第-7、-3或者-1天，给予BALB/c小鼠(n＝5)单一的、双倍的或者三倍的鼻内剂量的Sp2CBMTD(50μg)。还单独给予小鼠三倍的鼻内剂量的Sp2CBMTD以确定生物制剂的毒性(重量变化以蓝色显示，最后的图中)。b,在病毒攻毒前第-7,-3或者-1天给予单一鼻内剂量的Sp2CBMTD(10、1或者0.1μg)后小鼠(n＝5)的存活和重量变化。对于每个给药日，存活曲线在顶端的图中显示，相应的重量减轻曲线在底端的图中。在所有的情况中，感染对照动物但未治疗。每个值表示5只小鼠的平均体重±s.d.。
图5.对于SpCBM的聚糖阵列筛选，显示其对末端唾液酸聚糖的特异性和混杂性。GFP-融合的SpCBM的聚糖结合(使用由511个聚糖组成的聚糖阵列v4.2(Consortium for Functional Glycomics))，表达为相对荧光单位(RFU)。前40个命中的全部是sialosides，其中仅前29个聚糖以RFU降低的顺序列出。误差线显示了4次独立重复的信号的平均值的标准误差(SEM)。置信值，％CV＝100x StDev/平均RFU。
图6.采用和未采用唾液酸酶预处理的Sp2CBMTD和Vc2CBMTD的细胞结合。在与Sp2CBMTD和Vc2CBMTD孵育前，将哺乳动物A549和MDCK细胞用或不用肺炎链球菌NanA唾液酸酶的催化结构域处理，随后与兔抗-SpCBM和抗-VcCBM的抗体分别孵育，然后与Alexa Fluor 488-标记的抗-兔IgG抗体孵育。a,A549和MDCK细胞的实时成像，显示mCBM结合(绿色)细胞表面受体(左图)(与用唾液酸酶预处理的细胞(右侧的图)相比)。核采用DAPI(蓝色)染色。b,用或不用唾液酸酶处理时，mCBM结合细胞的相对荧光单位(RFU)。线条代表对于每个处理的和未处理的组的平均值±s.d.。
图7.在用小鼠适应的A/California/04/2009(H1N1)流感病毒攻毒后24小时施用以mCBM的BALB/c小鼠的存活。BALB/c小鼠(n＝5)在病毒攻毒后一天鼻内施用单一剂量的Vc4CBM(a)、Vc2CBMTD(b)或者Sp2CBMTD(c)，并监控其存活。图表代表了不同剂量的每种mCBM的存活曲线。
图8.在施用以Vc4CBM、Vc2CBMTD或者Sp2CBMTD后，采用小鼠适应的A/California/04/2009(H1N1)流感病毒接种的BALB/c小鼠中的血清抗体反应。a,在第-1天和第0天给予时，以单次施用Vc4CBM(50、250或者500μg，左图)、Vc2CBMTD(10、50或者250μg，中图)和Sp2CBMTD(10、50或者250μg，右图)后的抗-HA滴度。b,在第-7,-3或者-1天一次、两次或者三次给予Sp2CBMTD(50μg)给药后的抗-HA滴度。c,在第-7,-3或者-1天给予单次的Sp2CBMTD(1或者10μg)给药后的抗-HA滴度。线条代表每一个治疗组的平均倒数的HI滴度(log2)±s.d.。
图9.表明在人群体中缺少对VcCBM或者SpCBM已存在的免疫力。采用ELISA分析人血清中抗-CBM抗体存在。样品(n＝50)从男性和女性的混合年龄群体中获得(Seralab,UK)。Ad87和Ad88是对于腺病毒抗体的阳性对照。误差线代表s.d.，如针对缓冲液封闭(无血清)测量的*p<0.001。
图10.在小鼠中治疗后检测针对Sp2CBMTD的血清IgA、IgG和IgM抗体。在第-7,-3或者-1天为小鼠鼻内施用10或者1μg(50μl)的Sp2CBMTD，之后在第0天用小鼠适应的A/California/04/2009(H1N1)流感病毒攻毒。在第+21天获取血清，通过ELISA分析抗-Sp2CBMTD抗体，如完整方法中所描述。线条分别指示对于来自每组中三只小鼠的IgG(a)、IgA(b)和IgM(c)的平均吸光度值变化±s.d.。虚线分别指示对于IgG(A450-620nm 0.074)、IgA(0.115)和IgM(0.047)的测定的检查极限。
图11.mCBM对趋化因子和细胞因子的肺表达的影响。使用在鼻内施用Vc2CBMTD(100μg)、Sp2CBMTD(100μg)、A/WSN/1933(H1N1)流感病毒(5x103PFU)或者PBS(对照)后的第2天和第4天的BALB/c小鼠中获得的肺匀浆，通过ELISA方法检测炎症介质MIP-2、TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、GM-CSF和IL-2。除了GM-CSF和IL-2，其他所有在肺匀浆中被检测到。线条指示从来自5只小鼠的平均浓度(pg/ml)±s.d.。与对照组(未感染的、未处理的)的结果相比*p<0.05。
图12:在用小鼠γ疱疹病毒MHV-68(4x105PFU)或者PBS(对照)攻毒前以三倍剂量(50ug,第-7,-3,-1天)施用时，BALB/c小鼠中六聚体mCBM对肺病毒载量(a)和细胞因子水平(b)的影响，。线条指示来自5只小鼠的平均浓度(pg/ml)±s.d.。Mann Whitney试验*p<0.05,**P<0.01
图13:SDS-PAGE以检测Sp2CBMTD蛋白稳定性。凝胶包含10μl/道，以浓度5.25-0.66μg/道的溶解于PBS，在还原条件下在12％SDS-PAGE中(BioRad实验室,Hercules,CA)。
图14:单次施用Sp2CBMTD(在病毒攻毒之前)对用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒致死性攻毒的BALB/c小鼠的存活和重量变化的影响。
图15:单次施用Sp2CBMTD(在病毒攻毒之后)对用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒致死性攻毒的BALB/c小鼠的存活和重量变化的影响。
图16重复施用Sp2CBMTD(在病毒攻毒之前)对用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒致死性攻毒的BALB/c小鼠的存活和重量变化的影响。
图17.单次和重复施用Sp2CBMTD对用致死剂量的A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒感染的小鼠的存活的效果。用异氟醚轻度的麻醉BALB/c小鼠(n＝5)，并且用Sp2CBMTD以单一剂量(0.1、1、10、或者100μg/小鼠)在H7N9病毒接种前第7、3、或者1天(A)或之后6或24小时(B)鼻内给药。双倍或三倍剂量的Sp2CBMTD分别在H7N9病毒接种前第3和1天或者第7、3和1天给药(C)。小鼠鼻内接种5MLD50的A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒并且每日监控其存活和重量损失。未处理的对照动物在第7、3和1天接受无菌PBS。
图18.Sp2CBMTD对小鼠肺部中H7N9流感病毒NP–阳性细胞数量的影响。BALB/c小鼠以在H7N9接种前第7或3天单次给药或者双倍的(第3和1天)或者三倍的(第7、3和1天)给药给予Sp2CBMTD(10μg/小鼠)。每个实验组三只小鼠在感染后第3、6和9天处死。摘除小鼠肺，用10％中性缓冲的福尔马林固定，并用抗-流感A核蛋白质(NP)抗体染色用于免疫组化染色。对于，包括每只小鼠的所有肺叶的载玻片用于评估。采用ImageScope检查软件在感染后第3天(A)、第6天(B)、和第9天(C)定量分析NP-阳性细胞的数量。特异染色的细胞在细胞核和细胞浆中具有深棕色。对照动物(D,F,H)的肺组织的图像显示，在感染后第3天和第6天在细支气管的和呼吸道上皮细胞中有H7N9流感抗原-阳性染色(D,F)，相比之下，在感染后第9天有少量的抗原-阳性细胞(H)。代表性的Sp2CBMTD-处理组(在H7N9接种前第7、3、和1天三倍施用)的图像显示在感染后第3和6天的小鼠肺中的抗原-阳性细胞与对照相比的显著下降(E,G)，而在感染后第9天有少量的阳性细胞(I)。虚线显示在病毒感染的PBS处理的动物中确定的H7N9流感抗原-阳性细胞，并被认为是100％。放大率×20.与研究的感染后每天对照组结果相比较，*P<0.01,**P<0.05；双因素ANOVA。
图19.用Sp2CBMTD治疗并感染有5MLD50的A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒的小鼠肺内的组织学的变化。按照图18图例中所描述的施用Sp2CBMTD。将小鼠肺在10％中性福尔马林中固定，并用苏木精和曙红染色。H7N9感染的PBS处理的小鼠的肺在感染后第3天有支气管中上皮细胞的坏死(A)，以及在感染后第6天的肺泡萎陷和炎症细胞的浸润、水肿和病毒性急性肺炎(B)。在感染后第9天观察到水肿和炎症细胞的浸润(C)，但是损伤限于一些区域。在感染后第3天在施用3个剂量Sp2CBMTD的小鼠肺中未观察到明显的病理变化(D)，并且在感染后第6和9天存在最少的上皮的坏死和炎症细胞的肺泡浸润(E,F)。放大率,×20。实心的箭头指示上皮的坏死，空心的箭头指示水肿，并且实心的箭头指示巨噬细胞和中性粒细胞的细支气管周肺泡浸润。
图20.Sp2CBMTD给药对细胞因子和趋化因子的肺表达的影响。按照图18图例所描述施用Sp2CBMTD。在H7N9病毒感染前第0天的BALB/c小鼠的肺匀浆中采用MYCTOMAG-70K-PMX预混合试剂盒评估IFN-γ(A)、IL-1β(B)、Il-6(C)、TNF-α(D)、RANTES(E)、MIP-1α(F)、MCP-1(G)、和IP-10(H)的浓度。线条指示从来自3只小鼠中获取的平均浓度(pg/mL)±SD。黑色线条代表接种的H7N9病毒，PBS处理的小鼠(对照)。灰色线条代表用Sp2CBMTD治疗的小鼠。与对照组的结果相比，*P<0.05；**P<0.05，未配对的Student t-检验。
图21.施用Sp2CBMTD后的小鼠肺组织的中性粒细胞浸润。按照18图例所描述施用Sp2CBMTD。在感染后第0天获取小鼠肺，固定于10％中性福尔马林中，并且用髓过氧物酶(MPO)染色，其是中性粒细胞特异的标记。MPO-着色的部分对于病理评估为盲法的。抗原的存在通过采用Aperio ScanScope XT载玻片扫描仪(Aperio Technologies)捕获全肺切片的数字图像来定量，然后手动描绘整体区域连同明显的降低或缺失MPO染色的区域。通过采用Aperio’s ImageScope软件计算具有降低的染色覆盖的肺野的百分数，并表达为相对病毒感染的PBS处理的(对照)动物的相对值(A)。在H7N9病毒感染前，对照动物(B)和施用单剂量(C)、双倍剂量的(D)、或者三倍剂量(E)Sp2CBMTD的动物的代表性MPO-染色的代表性肺部图像。放大率,×20。实心箭头指示中性粒细胞。与对照组的结果相比，*P<0.0001；单因素ANOVA。
实施例1:采用新的改造的蛋白，通过靶向宿主受体预防流感
方法
病毒。对于体外研究，采用以下流感病毒：A/WSN/1933(H1N1)、A/Puerto Rico/8/1934(A/PR/8/1934,H1N1)、A/Udorn/1972(H3N2)和B/Hong Kong/1973在Madin-Darby犬肾细胞(MDCK,American Type Culture Collection,Manassas,VA)中增殖。病毒在MDCK细胞中的感染性采用斑块检测法确定，并以log10PFU/ml表示。对于体内研究，使用两个毒株：在MDCK细胞增殖的小鼠-适应的A/WSN/1933(H1N1)毒株，和在含胚的鸡蛋中生长的小鼠-适应的A/California/04/2009(H1N1)病毒30。为了确定A/California/04/2009(H1N1)的50％小鼠致死剂量(MLD50)，四个雌性6周龄BALB/c小鼠(Jackson实验室,Bar Harbor,ME)用异氟烷轻度麻醉，并且鼻内接种50μL的在PBS中10-倍系列稀释的病毒。在21天的观察期后确定MLD50值。
mCBM的产生。串联重复多价的蛋白,Vc4CBM(基于编码来自霍乱弧菌的唾液酸酶的nanH基因的家族4031唾液酸结合结构域(CBM)),采用前述的基于PCRd克隆技术产生8。来自霍乱弧菌nanH唾液酸酶和肺炎链球菌nanA唾液酸酶的CBM结构域的寡聚化，采用来自铜绿假单胞菌伪唾液酸酶蛋白的三聚化结构域如下改造：分别编码霍乱弧菌唾液酸酶残基25-216的CBM和肺炎链球菌nanA唾液酸酶残基121-305的CBM的DNA片段，通过采用引物对(表3)PCR扩增在5′和3′末端表修饰，以结合入不同的限制性位点以连接串联的一个或者两个拷贝的CBM单位，用于接着连接于编码来自铜绿假单胞菌伪唾液酸酶残基333-438(PaTD)的三聚化结构域的基因。将获得的片段克隆入适当消化的pEHISTEV载体(用于VcCBM片段)或者pEGFP-HISTEV载体(适于SpCBM片段)以产生分别称为VcCBMTD、Vc2CBMTD、SpCBMTD和Sp2CBMTD的构建体(图1)。也使用pEGFP-HISTEV载体产生GFP-SpCBM，用于聚糖阵列研究。所有的构建体均在大肠杆菌DH5a细胞中增殖，并且通过DNA测序验证构建体，之后转化表达宿主大肠杆菌BL21Gold(DE3)用于蛋白生产。
mCBM表达、纯化和表征。改造的mCBM的表达按照之前8所述的进行，并具有一些修饰。简而言之，将包含有His-标签标记的VcCBMs或者GFP-His-标签标记的SpCBMs之一的大肠杆菌细胞，在含有PBS、0.3M NaCl和10mM咪唑，以及DNA酶(20μg/ml)和蛋白酶(除去EDTA)抑制剂片(Roche)的缓冲液中裂解。将澄清的裂解物施加于用镍预加载的HisTrap HP柱(GE Healthcare)上，然后采用含有0.3M NaCl和250mM咪唑的PBS洗脱组氨酸-标签标记的CBM。除非另作说明，标签的去除通过采用TEV蛋白酶原位消化过夜，之后再将材料施加于镍柱进行。所有mCBM蛋白进一步用PBS中的HiPrep 16/60Sephacryl S200HR柱(GE Healthcare)，用尺寸排阻层析法，然后采用Vivapure S Maxi H(VcCBMs)或者Q Maxi H(SpCBMs)柱(Sartorius)纯化，以去除内毒素。GFP-标签标记的蛋白也可以如上文所述进行亲和层析和尺寸排阻层析。蛋白产量计算为15-70mg/l之间，这取决于mCBM。当保存于-80℃时，蛋白保持稳定数月。蛋白纯度和大小通过12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱法验证。纯化的mCBM结合于唾液酸通过表面等离子共振(Biacore T-100,Edinburgh大学)，采用固定有多价的、生物素化的α-2,3-唾液乳糖-PAA的链霉亲和素-包被的生物传感器芯片(Glycotech)验证(表1)。
聚糖微阵列。GFP-SpCBM的聚糖结合特异性采用聚糖载玻片阵列v4.2(功能糖组学协会(Corsortium for Functional Glycomics))分析。用于分析的GFP-SpCBM(200μg/ml)的制备，正如之前8描述，但有一些修正以允许采用抗-GFP抗体以增强结合的信号荧光。
细胞保护测定。对于细胞保护试验，汇合的MDCK单层(在DMEM,0.5％FCS中)在37℃用mCBMs(10mg/ml，适当稀释在无血清(SF)DMEM中)孵育1个小时。将单层用SF-DMEM冲洗，之后在37℃用～100-200PFU的流感病毒(A/WSN/1933(H1N1)、A/PR/8/1934(H1N1)、A/Udorn/1972(H3N2)和B/Hong Kong/1973)接种1小时，然后清洗。细胞用，补充有2μg/ml N-乙酰化的胰蛋白酶的DMEM中的10mM HEPES(pH7.4)中的1.2％(w/v)Avicel(FMC Biopolymer)覆盖。将平板在37℃孵育2-3天。斑块通过在4％甲醛中固定单层，并且用0.1％结晶紫染色可视化。从剂量-反应曲线对于每个mCBM计算保护50％的细胞抵抗病毒的mCBM的EC50值。
病毒复制抑制测定。汇合的MDCK细胞(96-孔形式)用于评估mCBM对甲型流感病毒复制的抑制。将细胞与不同mCBM在37℃孵育1个小时，之后清洗并添加甲型流感病毒(A/WSN/1933(H1N1)、A/PR/8/1934(H1N1)、A/Udorn/1972(H3N2)、MOI 0.01PFU/细胞)于单层达1个小时。去除病毒接种物并且将含有N-乙酰化的胰蛋白酶(2.5μg/ml)的SF DMEM被加入到细胞，并进一步孵育16-24小时。将细胞用4％甲醛固定，用含有0.5％Triton-X100和20mM甘氨酸的PBS(PBS-T)透化30分钟，之后用含有1％BSA、0.02％叠氮化钠的PBS(BB)封闭2-3小时。冲洗细胞，之后在22℃加入羊抗-甲型流感(在BB中1:500稀释，Santa Cruz)1-2小时。清洗平板，之后加入驴抗-羊IgG HRP偶联抗体(1:500稀释,Santa Cruz)。为了显色，将平板与TMB(HRP底物,Sigma)孵育。通过添加1M HCl终止反应。在450nm波长测量吸光值(620nm作为参考)。EC50值从剂量-反应曲线计算，以确定相较于对照孔(未处理、感染的)抑制50％病毒复制的mCBM的浓度。
细胞毒性试验。在24小时期间mCBM对于哺乳动物上皮细胞(MDCK)的存活力的影响采用如生产商(Life Technologies,Invitrogen)所描述的PrestoBlue细胞存活力测定评估。将mCBM(5mg/ml储存浓度的稀释液)加入到汇合的细胞单层中，并在37℃孵育24小时，同时还有对照(仅有DMEM，未处理的对照，和20％(w/v)叠氮化钠作为阳性对照)。将PrestoBlue试剂加入到细胞，并孵育1个小时，之后在570nm波长检测吸光度(620nm作为参考)。处理的细胞的相对吸光度表达为相对mCBM浓度绘制的未处理细胞的百分比。以50％(CC50)降低细胞存活力所需的mCBM的浓度由剂量-反应曲线采用与可变斜率匹配的非线性回归曲线确定。
成像研究。将MDCK和人肺癌(A549)细胞在补充有10％FCS的DMEM中稀释至3x 105细胞/ml，之后将100μl添加于96-孔黑色平底的平板(Costar)的每孔中并将1.5ml添加于WillCo-盘(35x 10mm玻璃底的,WillCo Wells B.V.)。将细胞孵育过夜达到90-100％汇合度。将细胞用温热的无菌PBS冲洗三次，然后将肺炎链球菌NanA唾液酸酶32的催化结构域(残基319–822)以在SF-DMEM中150μg/ml的浓度加入到细胞，并在37℃,5％CO2.孵育1个小时。将细胞用PBS彻底冲洗，之后加入mCBM(Vc2CBMTD 0.05mg/ml或者Sp2CBMTD 0.1mg/ml，于SF-DMEM中)并进一步在37℃,5％CO2孵育1个小时。清洗细胞，之后加入兔多克隆抗-mCBM抗体(Eurogentec,Belgium)(1:1000于DMEM-3％FCS中)并在370C,5％CO2孵育1个小时。接着加入置于DMEM-3％FCS中的2μg/ml羊抗兔Alexa Fluor 488IgG(Life Technologies)，并在37℃,5％CO2进一步孵育1小时。然后，加入DAPI达30分钟，之后最后用PBS清洗细胞。平板在TECAN Infinite Pro荧光平盘读数器(采用488nm和518nm激发和发射波长)上读数。活细胞采用DeltaVision去卷积显微镜(Applied Precision)，分别利用485nm和531nm的激发和发射波长成像。
小鼠感染研究。体内研究在Roslin Institute,Edinburgh,UK和St Jude Children’s Hospital,Memphis,TN,USA进行。雌性的BALB/c小鼠购买于Harlan UK Ltd(5-6周龄)或者Jackson实验室(6-8周龄),Bar Harbor,ME,USA。在英国，试验在用于流感研究的位于爱丁堡的感染疾病中心的动物检测设备进行，并且依据动物(科学的程序)法案1986在英国家庭办公执照(UK Home Office)下执行。采用氟烷(halothane)(Rhone Merieux Ltd,Harlow,Essex,UK)麻醉小鼠，然后，在用40μl PBS中的5x103或4x104PFU的流感A/WSN/33(H1N1)病毒致死病毒攻毒前24小时或当天，在鼻内施用变化量的mCBM(100-500μg于PBS中)。小鼠每日称重，并且评估临床疾病的可视迹象。将重量减轻其原始体重的25％的动物用CO2窒息安乐死。在感染后第4和7天，除非另有声明，摘除肺，在PBS中均浆，并通过离心澄清。感染病毒滴度通过在MDCK细胞上的标准斑块试验确定。
采用小鼠-适应的A/California/04/2009(H1N1)流感病毒的实验在美国农业部批准使用的动物安全等级2+(ABSL 2+)防护中进行。所有的研究均在适用法律和指导原则下，并且在经St.Jude儿童研究医院的动物保护和使用委员会的批准进行。除非另有规定，将BALB/c小鼠(n＝5)的组鼻内给予50μl的以单、双倍或者三倍剂量的0.1至500μg/小鼠之间的mCBM。用mCBM蛋白治疗在病毒攻毒的第-7天至第+1天之间的不同时间点开始。将动物用A/California/04/2009(H1N1)流感病毒以10MLD50/小鼠的剂量接种。对照(感染的，未处理的)小鼠在病毒接种前1个小时鼻内接受50μl无菌的PBS。还检测mCBM毒性对照(未感染的，治疗的)。在感染后每天观察小鼠的感染的临床征兆和存活达21天，并且整个感染期间记录体重。病毒肺滴度在额外的小鼠(n＝3)组通过MDCK细胞中的组织培养感染剂量试验(TCID50)在感染后第3、6和9天确定。
细胞因子分析。澄清的小鼠肺匀浆的细胞因子分析使用Quantikine ELISA试剂盒根据生产商(RD Biosystems,UK)的说明进行。
抗体分析。测试在感染后21天从存活的小鼠收集的免疫血清的抗-病毒HA抗体和抗-mCBM抗体的存在。HI测定采用0.5％包装的鸡红血细胞在用受体-破坏酶(RDE II,1:10稀释；Denka Seiken Co.,Japan)预处理并在56℃热-灭活30分钟的血清上进行。采用固定在96-孔板(Corning)上的制备的抗原(1μg/well)，进行标准的ELISA以测量来自感染的小鼠血清样品的抗-CBM抗体。将血清(在BB中1:1000稀释)加入到孔中，随后加入羊抗-鼠IgG、IgA或者IgM HRP-缀合抗体(1:2500稀释)，然后采用上述的TMB检测抗体的存在。为了检测人群中已经存在的唾液酸结合CBM的免疫性，使用从男性和女性混合年龄人群获得的人血清样本(n＝50)(Seralab,UK)中。1:1000稀释血清，之后用羊抗人IgG-缀合的HRP(1:2500)应用标准ELISA检测抗-VcCBM和抗-SpCBM抗体。
统计学分析。对于存活研究，Kaplan-Meier方法用于估计未治疗组和治疗组的存活可能性。除非另有说明，用误差线绘制的数据表达为平均值±s.d.。两个组之间的统计学统计显著性(p<0.05)采用非参数Mann-Whitney U检验确定。GraphPad Prism 5.0package(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA)用于所有的分析。
总结、结果和讨论
流感病毒通过其表面血凝素(HA)糖蛋白结合于存在于呼吸道上皮上的唾液酸受体，是引发病毒的内吞作用的事件12。人流感病毒，如2009流行的H1N1病毒识别存在于上呼吸道中的α-2,6-连接的唾液酸受体，而禽流感病毒，如H5N1主要识别α-2,3-连接的唾液酸受体，尽管这样的受体也存在于人下呼吸道中13,14。最近出现的人H7N9病毒识别两种类型的受体是不常见的，并且因此具有持续的人到人的传播和大流行的可能15,16。我们假设，用特异的蛋白遮蔽呼吸道中的这样的受体可能提供预防感染的新的治疗途径。很多唾液酸结合蛋白是已知的，但是大多数对唾液酸具有低亲和力，如对于其受体具有～2.5mM亲和力的HA单体，但是通过称为三聚体并通过在病毒表面以高拷贝数存在以获得亲和力17。模拟自然状态，我们采用来自霍乱弧菌NanH唾液酸酶18(VcCBM,图1a)的唾液酸结合结构域或者来自肺炎链球菌NanA唾液酸酶(SpCBM,图1b)的同源结构域改造多价形式。多价通过串联重复8或者通过将一个或者两个串联连接的CBM结构域融合于源自铜绿假单胞菌唾液酸酶19(图1c)的寡聚化结构域(TD)(其是自关联形成三聚体)获得。表，VcCBM和SpCBM的多价形式通过具有如经表面等离子共振(SPR)测量的具有<1nM的解离常数的亲合力获得亲和力(图1d,表1)。聚糖阵列筛选显示VcCBM8和SpCBM(图5)识别唾液酸连接的α-2,3或者α-2,6,并且在采用唾液乳糖的研究中，晶体学分析表明，两个结构域仅识别末端的唾液酸18。
多价的CBMs(mCBM)阻断病毒感染的能力首先在体内(表2)检测。采用Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞和三种不同的甲型流感病毒[A/WSN/1933(H1N1)、A/PR/8/1934(H1N1),A/Udorn/1972(H3N2)]和一种流感B病毒(B/Hong Kong/1973)的细胞保护和病毒复制抑制试验显示，对于化合价在3至6之间的mCBM，mCBMs以范围从0.39μM至4.1μM的EC50值阻断病毒附着，与之相比，当使用单价相当物时，为～300μM(数据未显示)。mCBMs抑制病毒复制并在最大可行浓度表不显示细胞毒性(表2)。mCBM的荧光成像显示它们结合在细胞表面，并且在细胞用随便的唾液酸酶预处理以去除唾液酸后，结合大部分消除(图6)。
接下来，我们探索在BALB/c小鼠中Vc4CBM阻断A/WSN/33(H1N1)病毒的致死性感染的能力。在病毒攻毒之前，即刻以单一剂量的Vc4CBM(500μg)鼻内施用。与未治疗的小鼠相比，在感染后7天，Vc4CBM治疗的鼠存活并在起始的小幅的重量减轻后重新增重，同时具有肺病毒滴度两个对数的降低(图2a,b)。这个初始的有希望的结果指引我们探索在用A/WSN/33(H1N1)病毒致死性攻毒前一天鼻内给药的三聚(VcCBMTD,SpCBMTD,400μg)和六聚(Vc2CBMTD,Sp2CBMTD,100μg)形式的保护作用(图2c,d)。在四个mCBM中，在感染后7天，六聚形式显示在肺中几乎检测不到的病毒，同时，Sp2CBMTD-治疗的小鼠显示可忽略的重量减轻(图2c)。
我们接下来评估了在BALB/c小鼠中抵抗用小鼠-适应的A/California/04/2009(H1N1)流行的流感病毒的致死性攻毒的生物制剂，探索病毒攻毒日前第-1、0或者+1天；第0天给予的Vc4CBM、Vc2CBMTD或者Sp2CBMTD的单一的鼻内剂量(10、50、250或者500μg)，存活研究持续到第+21天。在病毒攻毒后24小时给予时，mCBM均不保护小鼠(图7)。在第-1天给药时，Vc4CBM(500μg)仅给出40％存活。当在第0天给药时，Vc4CBM(500μg)给出100％存活，和A/WSN/33(H1N1)病毒攻毒一致，但是在较低剂量仅给出40％存活。相反，在第-1或者0天给药时，六聚形式给出提高的保护。在10或者50μg的较低剂量时Vc2CBMTD给出80％的存活。Sp2CBMTD提供最好的保护，在第-1天给药的所有剂量，所有小鼠均存活，并且在第0天施用50或者250μg剂量后，所有小鼠存活，施用10μg剂量，60％存活。所有经病毒攻毒存活的动物均体重减轻，但是最获益的结果是当在第0天施用250μg剂量的Sp2CBMTD获得的(图3b)。
我们接下来探索在感染前进一步施用的Sp2CBMTD的重复剂量给药的效果。在第0天，用A/California/04/2009(H1N1)病毒致死性攻毒前，向BALB/c小鼠鼻内施用单一的50μg剂量的Sp2CBMTD一次、两次或者三次至一周。对于所有剂量的样本(数据没有显示)存在100％存活，并且显著的是，当给药两个或者三个剂量时，很少或者没有重量损失(图4a)。之后探索Sp2CBMTD的最低有效剂量。在第0天用A/California/04/2009(H1N1)病毒致死性攻毒之前第-7,-3或者-1天给药单一的10、1或者0.1μg剂量的Sp2CBMTD。在10和1μg计量方案中所有小鼠存活，并且显著地，甚至在第-7天的单一的1μg剂量在感染后第8天仅给出最大8％的体重减轻，并很快恢复(图4b)，小鼠持续的健康成长并无不良的临床征兆，直到+21天。相反，在0.1μg剂量，当分别在第-1、-3或者-7天给药时，有80％,20％或者0％的小鼠存活(图4b)。在感染后第3、6和9天的肺病毒滴度显示，对于50和10μg剂量，病毒在第9天前从肺清除，而对于1和0.1μg剂量，病毒滴度与对照(感染的，未治疗的)小鼠相类似(结果未显示)。显著地，在使用所有剂量方案治疗后存在高滴度的血清抗-HA抗体，表明没有足够的病毒复制以诱导免疫应答(图8)。
使用病原体来源的生物制剂的一个忧虑是免疫原性的可能性，其可以降低重复给药的有效性。SpCBM和VcCBM选自人病原体，其可以随宿主进化免疫耐受性，并且我们发现在人群中没有对于任意一个单一CBM结构域的预先存在的免疫性(图9)。然而，在小鼠中鼻内施用Sp2CBMTD的确诱导了血清IgG、IgM和IgA抗体，但是以剂量依赖的方式，1μg Sp2CBMTD剂量诱导可忽略水平的血清IgA和IgM(图10)。mCBM的免疫原性可以是重复使用的一个问题，然而如果有需要可以利用改造使得蛋白免疫原性较低20。
唾液酸广泛地表达在所有脊椎动物的所有细胞表面，并且参与调解多个细胞功能，包括免疫力的发展21。已知内在和外在的唾液酸识别蛋白(其自身经常是多价的)介导和调解细胞的相互作用22。生物设计的最初假设是遮蔽唾液酸受体，然而，感染前7天施用单一低剂量的Sp2CBMTD的显著保护能力提升了生物制剂可以另外启动免疫系统至抗病毒状态的可能性。因此，我们探索了通过在小鼠鼻内施用Vc2CBMTD或者Sp2CBMTD诱导有限组的炎症细胞因子/趋化因子，并且发现两个生物制剂之间存在显著的不同，与Vc2CBMTD或者PBS相比，Sp2CBMTD刺激更高水平的IL-1β、MIP-2(IL-8的鼠同源物)、IFN-γ和TNF-α(图11)。肺炎链球菌CBM形成了NanA唾液酸酶的较大区域的一部分，尽管NanA的其他部分可能造成这种活性，之前报道所述NanA唾液酸酶刺激在人和小鼠脑细胞中某些细胞因子23。可能我们的生物制剂调解细胞过程，包括细胞因子的诱导，其可能促进Sp2CBMTD的保护能力，该发现还需要进一步的深入的探索。
对于控制流感存在对于新型治疗方法的急迫需求。很多的努力正进入研发针对流感新的疫苗24,25，病毒靶点的新的抑制剂26和靶向宿主因子的新策略27,28。我们已经表明，靶向哺乳动物宿主的生物制剂具有某些优势，值得进一步的探索。我们的生物制剂具有结合并遮蔽在上和下呼吸道上发现的不同的唾液酸受体的能力，并且因此如果采用了合适的递送系统，可以保护整个人气道。在所有治疗的小鼠中观察到的血清抗HA抗体的产生提示，除了提供保护，在暴露于病毒时，生物制剂允许“免疫接种”发生，可能针对未来的暴露提供保护。将这些生物制剂带入临床，前方存在许多挑战，但是我们相信这种新的类型的疗法类别是具有成为用于控制流感的有力的选择的潜力。生物制剂在阻断其他发病机理中利用唾液酸的呼吸道病原体方面具有可能更加广泛的应用，所述呼吸道病原体包括肺炎链球菌，其是与流感相关的继发性细菌感染和造成发病率和死亡率增加的主要原因29。
表1:不同的mCBM与多价的α-2,3-唾液酸乳糖相互作用的动力学参数。代表结合(‘on’)速率常数，表达为三次重复的平均值±s.d.。代表解离(‘off’)速率常数，表达为三次重复的平均值±s.d.。§KD代表在三种不同温度下，每一个mCBM与α-2,3-唾液酸乳糖之间相互作用的解离常数，如通过全局拟合模型确定的(假设的朗格缪尔(Langmuir)结合),其源自ka/kd的比例。
表2:体外细胞保护，mCBM的病毒抑制和细胞存活力。*EC50是提供50％细胞保护的mCBM浓度，表达为三次独立检测的平均值±s.d.。如完整方法中的描述的，通过PrestoBlue细胞存活力试验确定的值，用>符号表示使用最大可行浓度的值。治疗指数从CC50/*EC50比例计算。§EC50值通过抑制50％病毒复制的mCBM浓度确定，表达为三次独立测定的平均值±s.d.。
表3:用于改造mCBM的引物。如完整方法中所描述，采用pEHISTEV-GFP载体，*SpCBM基因在框架内融合于GFP基因。引物中的限制性的酶切位点用粗体高亮。
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实施例2:改造的蛋白Vc2CBMTD和Sp2CBMTD对用鼠γ疱疹病毒68(MHV-68)感染的小鼠的预防性效果。
前言
鼠γ疱疹病毒68(MHV-68)是天然存在的啮齿动物呼吸系统病原体1，其与卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)和感染人的埃-巴(Epstein-Barr)病毒(EBV)2紧密相关。γ疱疹病毒在它们的包膜上展示很多表面蛋白，糖蛋白H(gH)和糖蛋白L(gL)以及糖蛋白150(gp150)，其参与病毒的细胞至细胞传播。如EBV、MHV-68与恶淋巴增生性疾病相关3，其可以在感染后很多月后发生。然而，不同于EBV和许多其他的γ疱疹病毒，MHV-68在体外在上皮细胞中复制，并感染小鼠的实验室品系，并因此提供了研究γ疱疹病毒的良好模型4。对于治疗，通常提示抗病毒剂用于治疗大多数疱疹病毒感染。
在小鼠中鼻内施用MHV-68导致肺泡上皮细胞的急性增殖性感染，以及在B淋巴细胞中持续的潜伏性感染,脾脏是潜伏病毒的主要储库(reservoir)5,6。在感染后10-13天也可以从BALB/c小鼠的肺回收感染性病毒5。用MHV-68鼻内感染C57BL/6J小鼠后对来自BLA液体MHV-68的炎症细胞因子应答的分析，显示高水平的IL-6和IFN-γ，以及较低水平的IL-2和IL-10，峰在感染后约10天的细胞因子产生，这与从肺的病毒清除相关，尽管早在病毒施用后3天就观察到显著的水平。相反，几乎没有检测到IL-4或者IL-5的水平。此外，在用MHV-68体外再刺激后，纯化的免疫T细胞也产生IL-6、IL-10和IFN-γ，这提示病毒诱导获得性和天然宿主应答的组分1。
我们实验室采用改造的唾液酸结合蛋白作为针对呼吸系统病原体的生物制剂的近来的证据已经显示，当提前在小鼠中使用单一低剂量(1μg)鼻内施用至7天时，观察到针对致死性流感A/California/04/2009(H1N1)病毒攻毒的完全保护(未公开数据)。生物制剂是基于从霍乱弧菌(Vc)和肺炎链球菌(Sp)唾液酸酶分离的碳水化合物结合模块，并采用串联重复或者寡聚化结构域方法改造为多价的实体(mCBM)。由于这些改造的蛋白已显示在提前以低剂量给予数天时保护宿主，因此认为这些蛋白不仅阻断流感病毒结合细胞表面的唾液酸的附着，而且还可能潜在地“启动”免疫系统，以通过免疫调节作用允许针对病毒的抗病毒反应。早期在BALB/c小鼠中使用mCBMs的研究显示，在无感染的情况下鼻内施用单一剂量时，观察到免疫调节作用，这表明在2天后增强有限组的细胞因子/趋化因子，如MIP-2、TNF-α、IL-6和IL-1β的产生的能力(未公开数据)。
这里我们显示了改造的mCBMs在MHV-68感染的BALB/c小鼠中对病毒滴度和细胞因子水平的影响的初步数据。感染的小鼠中病毒滴度和特定的细胞因子水平的下降表明，mCBMs具有影响由其他呼吸系统病原体导致的感染过程的潜力，所述病原体在哺乳动物中不依赖唾液酸的结合以起始感染。
方法
体内研究。小鼠研究在用于流感研究的位于爱丁堡的感染疾病中心的动物检测设备进行，并且依据动物(科学程序)法案1986在英国家庭办公执照下执行。采用氟烷(Rhone Merieux Ltd,Harlow,Essex,UK)麻醉小鼠，然后在用40μl PBS中的4x105MHV68攻毒前第-7、-3和-1天三次鼻内施用50μg的或者是Vc2CBMTD或者Sp2CBMTD。在感染后的第5天，挑选小鼠，并且在处死后获取它们的肺，用于病毒滴度检测和细胞因子分析。
病毒滴度。感染性病毒滴度通过在MDCK细胞上的标准斑块试验确定。小鼠中的肺病毒滴度在感染后第5天确定。
细胞因子。来自澄清的小鼠肺匀浆的MIP-2、TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、GM-CSF和IL-2的细胞因子分析采用Quantikine ELISA试剂盒根据生产商(RD Biosystems,UK)的说明进行。
统计分析。利用误差线绘制的数据表达为平均值±s.d.，除非另有说明。两组之间的统计显著性(p<0.05)采用非参数Mann-Whitney U检验确定。GraphPad Prism 5.0package(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA)用于所有的分析。
结果和讨论
我们探索了当用非唾液酸结合的呼吸系统病原体MHV-68病毒攻毒时，六聚的mCBM、Vc2CBMTD和Sp2CBMTD对BALB/c小鼠中肺病毒载量方面和免疫应答的影响。在病毒攻毒前，生物制剂经鼻内以三倍剂量(50ug,第-7,-3,-1天)给药。与未处理的、感染的小鼠相比，所有的处理的小鼠在感染后第5天表现出肺病毒滴度的对数降低(图12a)。进一步采用ELISA分析小鼠肺匀浆以监测炎症介质IL-1β、MIP-2(IL-8的鼠同源物)、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-6和IL-2，表明治疗的和未治疗的感染小鼠的不同。与未治疗的、感染的小鼠相比，两种生物制剂显示了显著的较低水平的IL-6、MIP-2和IFN-γ,然而TNF-α、IL-2和IL-1β的水平仅与感染的小鼠相似(图12b)。这个数据提示，mCBM的提前的预防性治疗可以使宿主通过调节免疫应答准备好应对感染，如通过由MHV-68感染刺激的特定炎症介质，如IL-6和IFN-γ的水平的减少所观察到的。有可能，mCBM诱导起始的炎症的过程以增强对MHV-68病毒攻毒的免疫应答，同时潜在地阻止损伤性的趋化因子的表达。需要进一步的工作以理解在动物模型中给药时的mCBM的免疫应答特性(profiles)的类型。
实施例2的参考文献
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实施例3:针对H7N9流感病毒感染的碳水化合物结合模块：临床前研究中的效力。针对A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒感染的碳水化合物结合模块的六聚形式(Sp2CBMTD)在BALB/c小鼠中的效果。
材料和方法
病毒。流感A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒通过世界卫生组织监测网络(World Health Organization surveillance network)获得。A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒通过在10日龄含胚鸡蛋(鸡蛋)的尿囊腔中培养临床样本从患者中分离，并且用于实验的病毒存储在鸡蛋中制备(传代历史:E2/E2)。杀死50％动物的小鼠致死剂量(MLD50)在21天后在6周龄雌性BALB/c小鼠(重量,18-20g；Jackson实验室,Bar Harbor,Maine)中确定。将显示严重疾病并且损失>25％起始体重的动物安乐死。利用人H7N9流感病毒的实验在由美国农业部批准的动物生物安全等级3+防护设备中进行。所有的研究均在相应的法律和指导原则下，并且在经过St.Jude儿童研究医院的动物保护和使用委员会(St.Jude Children’s Research Hospital animal care and use committee)的批准进行。
组合物。六聚形式的碳水化合物结合模块(Sp2CBMTD)由Helen Connaris博士(生物分子科学中心,St.Andrews大学,UK)以10.5mg/ml的浓度在PBS中提供。6CBM(Sp2CBMTD)蛋白保存于-80℃，直到使用。为了在小鼠模型中评估6CBM(Sp2CBMTD)蛋白的效力，将蛋白样品以13K rpm离心5分钟，转移到新的小瓶中，并且溶解在无菌的PBS中至希望的浓度。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。蛋白稳定性通过在还原条件在12％SDS-PAGE中检测Sp2CBMTD蛋白(10μl/道，浓度5.25-0.66μg/道溶解于PBS中)的电泳迁移率来确认(Biorad实验室,Hercules,CA)。在～50kDa鉴定出主蛋白条带，并且还有一些额外的次要条带(图13)。在21kDa未检测到条带。因此，Sp2CBMTD蛋白没有解离。
Sp2CBMTD对用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒在小鼠中致死性感染的效力。将雌性6到8周龄的BALB/c小鼠(重18至20g；Jackson实验室,Bar Harbor,ME)通过用吸入异氟烷轻度的麻醉，并用50μl的传染性的H7N9病毒鼻内接种。总共32组的BALB/c小鼠(5只小鼠每组)用于这个实验(表1a)。在不同的方案中，给BALB/c小鼠鼻内施用50μl的Sp2CBMTD。在H7N9病毒攻毒前7天(第-7天：组1-4)，或者在H7N9病毒攻毒前3天(第-3天：组5-8)，或者在H7N9病毒攻毒前1天(第-1天：组9-12)，或者在H7N9病毒攻毒后6小时(+6hr：组13-16)，或者在H7N9病毒攻毒后24小时(第+1天：组17-20)施用单一剂量(0.1、1、10和100μg/小鼠/日)的Sp2CBMTD蛋白。在H7N9病毒攻毒前第3天和第1天(第-3,-1天：组21-24)以二个剂量给药进行Sp2CBMTD蛋白的重复施用，或者在病毒攻毒前第7、3和1天(第-7,-3,-1天：组25-28)以三个剂量给药进行Sp2CBMTD蛋白的重复施用。作为毒性对照，Sp2CBMTD蛋白以100μg/小鼠/日的剂量以三个方案给药(毒性：组29-31)。将动物用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒以5MLD50每只小鼠的剂量接种。对照(感染的未治疗的)小鼠在病毒接种前1小时鼻内接受50μl的无菌PBS。感染后每日观察BALB/c小鼠的感染的临床症状和存活至21天。至死亡的平均天数通过对数风险比例(log-hazard scale)计算。小鼠在感染后第0、2、4、6、8、10、12、14、19和21天称重，并且对于每只小鼠计算重量的减轻或增加为在病毒接种前第0天其重量的百分比。
抗HA抗体反应。在感染后21天从存活的小鼠收集血清样本，在37℃用1:10稀释的受体破坏酶(Denka Seiken Co.,日本)处理过夜，56℃热灭活30分钟，用无菌PBS 1:10稀释，并通过采用0.5％包装的鸡红血细胞(CRBC)的血细胞凝集抑制(HI)试验检测。
利用更高H7N9病毒剂量的再感染。将利用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒致死性感染存活的所有动物在感染后第21天用25MLD50的病毒再感染。每日观察小鼠的感染临床症状和存活，并且在指定日监控体重变化。
结果
Sp2CBMTD蛋白对用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒致死性攻毒的BALB/c小鼠的存活的效力。我们评估了单次或者重复施用Sp2CBMTD蛋白对用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒致死性攻毒的小鼠的存活和临床征兆的影响(表2a)。当以单剂量,2x和3x剂量(100μg/小鼠/日)施用时，Sp2CBMTD没有导致未感染小鼠的任何体重变化和死亡。我们得出结论，Sp2CBMTD在这些实验中以最高剂量对小鼠没有毒性。
未治疗的H7N9病毒接种的对照小鼠呈现进行性的重量损失，平均至死亡天数为7.8±1.1(表2a和图14-16)。我们观察到Sp2CBMTD针对H7N9病毒攻毒对小鼠的保护的剂量依赖性的效果，并且在100μg/小鼠/日的较高剂量具有益的保护效果(图14)。当在第-7、-3、-1天施用时，100μg/小鼠/日的剂量提供100％保护。当在所有的测试方案中以单次施用时，0.1μg/小鼠/天的剂量是最低有效剂量。
为了评估当在用A/Anhui/1/2013(H7N9)致死性攻毒后施用时，单一Sp2CBMTD剂量的效果，我们在病毒接种后6小时或者24小时启动了治疗(图15)。如果在+6小时施用，在这些实验中使用的最高剂量(100μg/小鼠/日)提供100％存活，而如果+24小时(第+1天)给药，仅40％动物存活。
为了评估用Sp2CBMTD重复剂量给药针对用A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒的致死性攻毒小鼠的效力，两个剂量的蛋白在第-3天、第-1天给药，并且三个剂量在第-7、-3、1天给药(图16)。当2x和3x施用Sp2CBMTD时，对于所有剂量方案存在100％存活。
Sp2CBMTD蛋白对用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒致死性攻毒的BALB/c小鼠的重量变化的效力。当100μg/小鼠/天的最高剂量Sp2CBMTD施用于动物时，重量变化很少或者没有。另一方面，0.1μg/小鼠/天的剂量提供了对重量损失的最小效果，并且用该剂量处理的动物经历最明显的重量损失(表3a)。Sp2CBMTD的给药时机对于对存活和重量损失提供最有益效果是重要的。当在病毒接种后24小时起始利用Sp2CBMTD蛋白的治疗时，动物显示了最明显的重量变化。总之，观察到的重量变化与在H7N9感染后观察到的存活结果相关。
为了从血清学确认感染有A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒感染小鼠的，并且为了比较Sp2CBMTD蛋白方案对抗HA抗体产生的影响，我们收集了感染后21天的血清用于HI试验。在所有存活小鼠中观察到对同源A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒的抗HA抗体，倒数HI滴度在40-80的范围之间(表4a)。
用更高剂量的H7N9病毒再感染存活小鼠。动物完全被保护免于25MLD50的H7N9病毒再感染的；它们不显示疾病征兆并且没有死亡(表5a)。
结论
·在用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒致死性攻毒前，重复施用Sp2CBMTD提供了最有益的结果并导致甚至在使用的最低剂量(0.1μg/小鼠/天)时100％的BALB/c小鼠存活。这提表明使用剂量降低的可能性。
·给药的时机与在致死性小鼠模型中Sp2CBMTD蛋白治疗效力相关：当蛋白在A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒接种前给药时，获得完全保护(100％存活率)。
·在H7N9致死小鼠模型中观察到Sp2CBMTD剂量依赖性效果，因此提示这种蛋白针对流感病毒的特异性。
·Sp2CBMTD的使用不影响抗HA抗体的产生，并且免疫应答的水平足以保护免于H7N9病毒再感染。
表1a.设计研究以评估在BALB/c小鼠中Sp2CBMTD针对A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒感染的效果
表2a.Sp2CBMTD蛋白对用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒致死性攻毒的BALB/c小鼠的存活的效力。
表3a.Sp2CBMTD蛋白对用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒致死性攻毒的BALB/c小鼠的重量变化的效力
a对于每只小鼠，重量的损失或增加计算为A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒接种前第0天的重量的百分比。N/A–由于小鼠死亡没有可用的数据。
表4a.用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒致死性攻毒并用Sp2CBMTD蛋白治疗的BALB/c小鼠中的血清抗体应答
a血清样本在感染后21天从所有存活动物收集。滴度用0.5％CRBC针对同源的A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒确定，表示为倒数值(如,640相对1:640)。N/A–由于小鼠死亡没有可用的数据。
表5a.Sp2CBMTD蛋白对用25MLD50的A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒再感染的BALB/c小鼠的存活的效力
注意:毒性组用5MLD50的A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒感染。在用H7N9病毒致死性攻毒前～27天接受SP2CBMTD的毒性组未从感染中存活。这是对于毒性组的早期感染。所有其他组用25MLD50的A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒再感染，但是之前它们用5MLD50的A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒感染。
表6a.用25MLD50的A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒再感染的BALB/c小鼠中的血清抗体应答
a血清样本从起始感染后42天或者用A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒再感染后21天的所有存活的动物获取。滴度用0.5％CRBC针对同源的A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒确定，并且表示为倒数值(如,640相对1:640)。N/A–由于小鼠死亡没有可用的数据。
实施例4–关于唾液酸结合蛋白Sp2CBMTD保护小鼠抵抗出现的A(H7N9)流感病毒的致死性攻毒的进一步研究
概述
正如实施例3所提供的数据所示，靶向对于流感病毒复制关键的细胞因子的化合物代表了引人注目的抗病毒治疗方法。Sp2CBMTD是基因改造的多价蛋白，其遮蔽呼吸道上皮上的含唾液酸的细胞的受体，所述受体被流感病毒识别。Sp2CBMTD针对出现的人A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒对鼠的致死性感染的抗病毒潜力进行了研究，正如其体内活性的机制基础。在H7N9病毒接种前(第7,3,或者1天)或者后(6或者24小时)，以单一或者重复剂量(0.1、1、10、或者100μg)为小鼠鼻内施用Sp2CBMTD。当在H7N9致死性攻毒前7天施用时，单一Sp2CBMTD剂量(10或者100μg)保护80％至100％的小鼠。重复Sp2CBMTD施用赋予最高的保护，甚至在最低检测剂量(0.1μg)导致100％的小鼠存活。在H7N9病毒感染前施用Sp2CBMTD诱导肺表达前炎症介质(IL-6、RANTES、MCP-1、Il-1β、TNFα、MIP-1α、IP-10)并募集中性粒细胞至呼吸道,这导致不太明显的炎症和快速从小鼠肺部清除病毒。Sp2CBMTD给药不影响病毒特异性的适应性免疫应答,其足以保护更高剂量的同源H7N9病毒或者异源H5N1病毒的再感染。因此，Sp2CBMTD在致死性小鼠模型中预防H7N9感染方面是有效的，并有希望作为针对动物传染的流感病毒的预防选择。
材料和方法
病毒、细胞和生物制剂
流感A/Anhui/1/2013(H7N9)和A/Turkey/15/2006(H5N1)病毒从世界卫生组织监测网络获得，并且在35℃在含胚鸡蛋中增殖48小时。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞从美国典型培养保藏中心(American Type Culture Collection)获得，并按照之前描述的维持(22)。Sp2CBMTD由基于PCR的克隆技术产生，采用编码来自肺炎链球菌NanA唾液酸酶的碳水化合物结合模块40(CBM40)和来自铜绿假单胞菌伪唾液酸酶的三聚化结构域的基因(21)。利用H7N9和H5N1流感病毒的实验在经美国农业部批准的动物生物安全等级3+防护设备中进行。
小鼠中Sp2CBMTD的效力。
六周龄雌性BALB/c小鼠(重量，18–20g；Jackson实验室，Bar Harbor,ME)通过异氟醚吸入轻度麻醉，并鼻内接种五个50％小鼠致死剂量(MLD50)的50μL PBS中的A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒。对于第一次研究，在接种前第7、3天,或者1天,或者在H7N9病毒接种后6或者24小时，每组的5只BALB/c小鼠鼻内给予单剂量的Sp2CBMTD(0.1、1、10或者100μg/小鼠)。在H7N9接种前，Sp2CBMTD的重复剂量施用以双倍(第3和1天)或者是三倍(第7、3和1天)给予。感染后(p.i.)每日监控小鼠的存活达21天；处死显示有严重疾病征兆和25％重量损失的动物。对照小鼠在第7、3和1天接受无菌PBS。
对于第二次研究，评估10μg剂量的Sp2CBMTD。在A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒接种前，每组10只BALB/c小鼠给予单一的(第7或者3天)，双倍的(第3和1天),或者三倍的(第7,3和1天)剂量的Sp2CBMTD。对于每只小鼠，重量的减轻或增加计算为病毒接种前其重量的百分比。在感染后第3、6和9天，处死来自于每一组的3只小鼠用于确定肺匀浆中的肺病毒滴度和细胞因子/趋化因子应答的水平。处死每组中另外的3只小鼠用于肺的组织病理检查。移除肺，用无菌的PBS彻底清洗，均浆，并悬浮在1mL冰冷的PBS中。通过在2000g离心10分钟去除细胞碎片，之后上清用于MDCK细胞中的50％组织培养感染剂量(TCID50)试验。感染后每日监测小鼠的存活达21天。所有的研究均在适用法律和指导原则下进行，并且经St.Jude儿童研究医院的动物保护和使用委员会批准。
用H7N9和H5N1病毒再感染。
用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒接种后三周，存活的小鼠用25MLD50的同源病毒再感染。3个星期后，其他的存活于起始Sp2CBMTD治疗和H7N9病毒接种的小鼠，接受第二次Sp2CBMTD给药，并且然后用20MLD50的A/Turkey/15/2006(H5N1)病毒感染。
肺细胞因子和趋化因子分析。
4种细胞因子的[γ干扰素(IFN-γ),白细胞介素-6(IL-6),在激活时调节的、正常T细胞表达和分泌的(RANTES),单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)]和4种趋化因子[白细胞介素-1β(Il-1β),肿瘤坏死因子α(TNF-α)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)、可诱导蛋白(IP-10)]的浓度，根据生产商说明，采用小鼠MYCTOMAG-70K-PMX预混试剂盒(Millipore)测量。对于每个细胞因子，标准曲线范围从3.2至10,000pg/mL。在感染后0、3、6和9天在25μL肺匀浆样本中测量细胞因子。采用xPonent数据获取和分析软件，在Luminex 100/200分析器上读取多重板(multiplex plate)。
组织病理学和免疫组织化学。
在全体灌注10％中性缓冲的福尔马林(NBF)后，收集第二次研究的每个实验组中的小鼠肺(n＝3)。通过气管灌注，小鼠肺膨胀并保持在10％NBF中至少7天，然后包埋、切片并用苏木精和伊红染色用于常规组织病理学或者用免疫组织化学(IHC)染色用于甲型流感病毒[核蛋白质(NP)；US Biological]和中性粒细胞[髓过氧物酶(MPO)；Thermo Shandon)。甲型流感病毒NP-和MPO-染色的切片对于病理评估是盲法的。抗原的存在通过全肺切片的捕获数字成像，采用Aperio ScanScope XT切片扫描仪(Aperio Technologies)来定量，然后手动描绘整体区域，连同明显降低或缺失的NP和MPO染色区域。采用Aperio’s ImageScope软件计算具有降低的染色覆盖率的肺野的百分数。
血清学。
在H7N9或者H5N1病毒感染后21天获得血清样本，用受体破坏酶(Denka Seiken Co.)处理，在56℃热灭活1个小时，并且通过采用0.5％火鸡红血细胞(Rockland Immunochemicals)的HA抑制试验检测抗血凝素(HA)抗体的存在。在ELISA中，采用固定在96-孔平板(Corning)上的纯化的蛋白(1μg/孔)(21)检测血清样本中抗SpCBM抗体的存在。
统计分析
肺病毒滴度，细胞因子和趋化因子的浓度和抗SpCBM抗体滴度通过未配对的Student t检验分析。通过采用GraphPad Prism 5.0软件，通过方差分析(ANOVA)比较NP-和MPO-染色的肺细胞数量。通过Kaplan–Meier对数排列(log-rank)试验计算累计存活率。
结果
Sp2CBMTD对用H7N9流感病毒致死性攻毒的小鼠的存活的效力。为了确定Sp2CBMTD是否改善用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒致死性攻毒的小鼠的存活，生物制剂在病毒攻毒前第7、3或者1天以0.1、1、10或者100μg的剂量施用一次。病毒接种的、PBS处理的对照动物呈现进行性的重量损失并且在感染后第8-10天之间全部死亡(图17)。在H7N9病毒攻毒前，单次鼻内施用Sp2CBMTD导致对小鼠的剂量依赖性的保护。最高单剂量的Sp2CBMTD(100μg)提供最大的保护，并且当在病毒接种前第7、3或者1天施用生物制剂时，100％的小鼠从感染中存活(图17A)。当在病毒接种前第1天，或者第7或者3天施用时，10μg单一剂量分别保护100％、80％和80％的小鼠。然而，当病毒攻毒前第3或1天施用1μg剂量时，仅60％和40％的小鼠存活(图17A)。检测的最低剂量(0.1μg)是最小效力的，并且仅有20％的小鼠受到保护。
接下来，评估用Sp2CBMTD早期暴露后治疗对小鼠的存活的影响。H7N9病毒攻毒后6小时施用Sp2CBMTD，以10和100μg剂量保护100％的小鼠，并且1μg剂量保护40％小鼠(图17B)。当治疗的起始延后24小时，保护的效力下降；用100μg治疗的小鼠的仅40％存活于H7N9接种；0.1或者1μg没有提供存活益处。
在用A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒感染致死性攻毒小鼠前，以双倍或者三倍方案重复施用Sp2CBMTD，在检测的生物制剂的所有剂量下均提供完全的保护(图17C)。这些结果提示，在H7N9病毒接种前重复施用Sp2CBMTD对小鼠的存活和体重损失的最小化是最有效的(表1b)。
Sp2CBMTD对小鼠肺中H7N9流感病毒复制的效果。在第二个实验中，在10μg剂量下检查Sp2CBMTD的抗病毒活性的机制基础，在该剂量，保护在第一个实验中赋予。在感染的小鼠肺中确定H7N9病毒载量的动力学。用测试的所有生物制剂方案治疗的小鼠的肺中的病毒滴度与感染后第3或者6天的对照没有差异(表1b)。显著的是，在感染后第9天，双倍和三倍施用Sp2CBMTD明显降低感染的小鼠的肺中的病毒载量(P<0.005)，但是测试的两个单一的剂量方案没有降低病毒滴度(表1b)。
为了比较在给予PBS(对照)或者不同生物制剂方案的感染的小鼠下呼吸道中A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒复制，在感染后第3、6和9天定量肺切片中的病毒阳性细胞(图18)。在对照动物中，在整个全肺切片中检测到NP-阳性细胞(流感感染细胞的测量)，特别是在感染后第3和6天的支气管、细支气管和细支气管周的肺泡的上皮细胞(图18D,F)，抗原阳性细胞的数量在感染后第9天降低(图18H)。与对照动物相比，在感染后第3、6或者9天，单一施用Sp2CBMTD不显著改变小鼠肺中NP-阳性细胞的数量。相反，双倍或者三倍施用生物制剂导致NP-阳性细胞数量的显著降低(分别为P<0.01和P<0.05)，其中细胞数量从感染后第3天的80％降低至70％(图18A)，并且在感染后第9天降低至50％(图18C)。
这些发现表明，Sp2CBMTD给药控制感染的小鼠肺中H7N9病毒复制。观察到的感染病毒滴度的差异和在感染的小鼠肺中病毒阳性细胞数量的差异可能是因为在肺切片实验仅能检测细胞内病毒，但是TCID50试验能够检测细胞内和细胞外的病毒。
Sp2CBMTD对肺组织的组织学改变的影响。为了检测肺变化程度，对在感染后第3、6和9天从不同Sp2CBMTD方案组获得的组织进行了组织学检测(图19)。H7N9感染的PBS处理的小鼠的肺在感染后第3天显示支气管上皮的细胞的坏死(图19A)并且在感染后第6天显示炎症细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)的肺泡萎陷浸润、水肿和在病毒性肺炎(图19B)。在感染后第9天水肿和炎症细胞浸润继续，但是损害限于少量区域(图19C)。在接受三倍剂量方案的Sp2CBMTD治疗的小鼠中，在感染后第3天没有明显的病理变化并且上皮的坏死和炎症细胞的肺泡浸润最少(图19D)。在感染后第6天观察到炎症细胞在肺实质中的积累和病毒扩散的进展，并且在感染后第9天解决(图19E,F)。这些发现支持了Sp2CBMTD施用降低肺组织损伤，其与致死性H7N9病毒感染相关。
Sp2CBMTD对肺的细胞因子和趋化因子产生的影响。为了确定与Sp2CBMTD的施用相关炎症和天然免疫应答，研究了Sp2CBMTD对细胞因子和趋化因子的肺表达的影响。在H7N9病毒接种前，Sp2CBMTD刺激前炎症反应，并且特定的前炎症介质的水平，如细胞因子(IL-6、RANTES、MCP-1)和趋化因子(Il-1β、TNFα、MIP-1α、IP-10)增加，且在感染后第0天在Sp2CBMTD治疗的和对照动物之间观察到显著的差异(P<0.01或者P<0.05)，特别是重复剂量给药的(图20)。这些效果可能是由于肺中激活的肺泡巨噬细胞导致。在感染后第3、6和9天，细胞因子和趋化因子的肺表达在实验组之间变化，并且没有清晰的表达模式(数据未显示)。这些结果提示，Sp2CBMTD可能通过“启动”宿主调节免疫应答以更好地与即将到来的流感病毒感染抵抗。
Sp2CBMTD对中性粒细胞募集的效果。为了确定在病毒接种前确定的提升的细胞因子水平与肺中免疫细胞群体的增加相关，确定中性粒细胞的数量(图21)。在感染后第0天，在来自Sp2CBMTD治疗的小鼠的样品中的中性粒细胞计数显著高于对照(P<0.0001)，在从给予重复的Sp2CBMTD剂量给药的小鼠获得的样本中观察到最大的增加(图21)。我们的结果表明，通过Sp2CBMTD施用引起募集免疫细胞至病毒复制位点，促进从致死性H7N9病毒感染快速恢复和存活。
用H7N9流感病毒再感染小鼠。为了检测Sp2CBMTD治疗是否干预适应性免疫的诱发，检测针对A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒的血清抗HA抗体的滴度。无论使用哪种方案，所有的存活小鼠均具有中度的抗HA抗体滴度(1:40至1:160)(表2b)。抗HA抗体滴度足以保护100％的存活动物抵抗25MLD50剂量的同源的H7N9病毒感染(数据没有显示)。
在重复给药和用H5N1流感病毒再感染后的抗SpCBM抗体的诱导。当重复使用生物制剂时，抗生物制剂抗体的产生可能潜在地使保护作用丧失。我们评估了两次使用生物制剂后的小鼠血清中抗SpCBM抗体的水平(表2b)。与空白(naive)小鼠相比，在首次使用Sp2CBMTD后观测到IgM的最显著增加，其代表了急性抗体的集合(pool)，并且对于IgA显示最少增长。在第二次使用Sp2CBMTD后，在所有治疗的组中IgG和IgM的水平分别增长1.3-1.7和1.4-4.4倍(表2b)。为了解决是否重复使用Sp2CBMTD可以影响针对流感病毒感染的保护的问题，我们用高致病性的H5N1病毒再感染小鼠。重要的是，接受两次生物制剂的组中的动物对于H5N1病毒的致死性攻毒完全保护(数据没有显示)。
讨论。在之前开发的流感H7N9病毒诱导的急性呼吸窘迫综合征的致死性小鼠模型(23)中，我们证实了新的宿主靶向的生物制剂Sp2CBMTD在阻止新出现的人病原体的致死性感染方面的高效力。尽管在病毒攻毒后20％–100％的动物用单一剂量的Sp2CBMTD即得到保护，取决于时机和剂量，最高的效力和100％小鼠保护通过在H7N9病毒攻毒前重复施用Sp2CBMTD获得。重复施用Sp2CBMTD在H7N9病毒感染前诱导一些关键的前炎症细胞因子，并募集免疫细胞至肺上皮，这导致较不显著炎症和从小鼠肺快速清除病毒。
禽流感病毒导致的人感染引发了关于控制动物传染病感染的最佳疗法的关注，并强调对开发新的抗流感药物的需要。对于新药的靶点在近些年来已经有所扩展，不仅仅聚焦在流感病毒特异的蛋白，而且还有对于病毒复制关键的宿主因子。宿主靶向的药物的主要优点是它们针对不同流感病毒亚型的广谱的活性和效力，以及出现药物抗性变体的低风险(24)。用于药物开发的引人注目的策略是抑制流感病毒进入宿主细胞。因此，Sp2CBMTD(其设计用于遮蔽含有SA的宿主细胞受体)是有希望的候选者。不同于研究性的抗病毒生物制剂DAS181,Sp2CBMTD不会移除细胞受体，而是遮蔽它们并防止病毒附着(21)。聚糖阵列筛选显示，SpCBM识别含有末端α2,3–或者α2,6–连接的SA的聚糖(20)，强调可以结合人上和下呼吸道中的受体的生物制剂的可行性。通过多化合价获得的Sp2CBMTD的高亲和力容许其阻断SA受体达延长的时期。在小鼠肺中检测到Sp2CBMTD直到单一给药后8天(21)，其容许其在病毒感染前给药，因此使之成为预防措施的有价值组分。相反，近来对于DAS181在H7N9感染的小鼠中的抗病毒活性研究显示，在感染的初始需要每日给药以降低重量损失和完全保护小鼠免于致死性(25)。尽管对于两种药物靶点(细胞表面唾液酸糖缀合物(sialoglyconjugates))相同，但方案是不同的。
我们的数据提示，Sp2CBMTD的抗病毒作用的机制是复杂的，并且由2个主要因素驱动：1)阻止病毒结合含有SA的细胞受体(21)和2)调节宿主免疫应答。在针对流感病毒感染的保护方面Sp2CBMTD的多功能作用通过刺激天然免疫应答和募集免疫细胞至流感病毒感染位点来证明，因此降低了由H7N9病毒所诱导的免疫病理的严重性。可能的是，除SA外，Sp2CBMTD结合于还未知的一种或多种受体，因此获得调节免疫应答的能力。
重要的是，从H7N9病毒感染存活的、Sp2CBMTD治疗的小鼠收集的血清对于特异性抗HA抗体阳性，并因此发生适应性免疫应答的发展。免疫应答的水平足以针对用更高剂量的同源病毒的H7N9病毒再感染提供保护。
关于长期使用这种新疗法的主要忧虑是产生针对其的特异性抗体。我们的结果表明，尽管在第一次给药后三周第二次施用Sp2CBMTD后，IgG、IgM和IgA抗SpCBM抗体的血清水平增加，保护并没有受到影响，并且所有动物存活于高致病性的H5N1流感病毒的异源性攻毒。新出现的H7N9流感病毒和高致病性的H5N1的所有内部基因片段均相似，并且与来自禽H9N2病毒的紧密相关(16,26)。因此，通过起始的H7N9病毒感染建立的交叉反应性CD4+T和CD8+细胞毒性T淋巴细胞免疫应答可以促进针对H5N1再感染的保护。需要进一步的研究以确定Sp2CBMTD针对高致病性的H5N1流感病毒的不同HA进化枝的效力。我们的结果证实，甚至在很短的时间内重复使用Sp2CBMTD是可能的。如果Sp2CBMTD给药之间的时期较长，抗SpCBM抗体可以消除，并且它们对保护水平的可能效果可能降低。为了降低免疫原性的可能忧虑，生物制剂的人源化是可能的。
Sp2CBMTD代表一种针对流感感染的新的宿主导向类别的疗法，其显示了预防由可能流行的流感株导致疾病的希望。以前的研究提示，该生物制剂针对流行的H1N1pdm09病毒有效(21)。综上，这些数据支持这样的观点：Sp2CBMTD是针对出现的流感病毒的有希望的预防选择。其他的呼吸系统病原体，如副流感病毒、一些冠状病毒和肺炎链球菌也采用SA受体作为发病机理，这可以使得Sp2CBMTD在以后进行更广泛的应用。我们在小鼠中的发现确认重复的低剂量的方案导致最高的存活率和最小的小鼠肺组织损伤。Sp2CBMTD的免疫调节性质需要进一步的研究，但是本研究的结果倡议这种方法在预防由不采用SA受体的病原体导致的呼吸系统疾病方面的更广泛的应用。
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