技术领域
本发明涉及巴布剂技术领域，具体是一种忧遁草酵素液巴布剂及其制备方法。
背景技术
忧遁草属于爵床科鳄嘴花属，除了忧遁草的别名外，它还有鳄嘴花、扭序花、青箭、沙巴蛇草、柔刺草竹节黄、竹叶青、竹儿王、小接骨、剽黄等的美称。在马来西亚和中国台湾等地作为传统中药，具有抗菌、抗炎、抗病毒的作用，可以用于治疗皮疹、蚊虫叮咬、毒蛇咬伤等。早期的文献中报道了从该植物的茎和叶中分离得到街醇、三菇、黄酮，以及含硫糖昔、脑朴脂和类叶绿素类化合物的研究报告，但是这些研究不能全面表达它的功效。直至2011年马来西亚某淋巴癌末期患者服用忧遁草康复后，其药用价值很快引起了世界各地医药科研工作者的广泛关注，据报道，其中的化学成分大部分已被现代抗肿瘤药理实验研究证实。截止到目前，国内、外学者已从忧遁草中分离、鉴定出了多种化学成分，包括三萜类、碳苷黄酮类、含硫化合物、植物甾醇类、脱镁叶绿素类、脑苷类、氨基酸、微量元素、生物碱以及多种小分子化合物等。最新研究总结了忧遁草的主要药理活性有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等，还有一些作用等待研究者去发现。
经皮给药系统，还可以称为经皮治疗系统，是指皮肤贴敷方式用药，即通过皮肤的贴敷方式使药物以一定的速率通过皮肤经毛细血管吸收进入体循环产生药效的一种给药方式。它与其他给药方式相比具有一定的优点。如可以不经过肝脏的“首过效应”和胃肠道的破坏，提高生物利用度，具有较长的作用时间，也有透皮吸收的优点。它还可以降低药物毒性和副作用，维持稳定、持久的血药浓度，减少给药次数，提高疗效，给药方便，操作简单等等。
经皮给药制剂之一-巴布剂是指药物提取物、药物于适宜的亲水性基质混合后，涂布于背衬材料上的外用剂型。巴布剂具有使用方便、给药准确的优点，而且不会弄脏衣服。同时，因为不经过口服给药，所以不经肝脏和消化道，就避免了药效受胃液的干扰。
目前忧遁草民间用于抗肿消炎若捣碎鲜外敷效果明显，但使用不方便且不易控制用药量，药效不能充分发挥，对原药功效成分利用率低。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种忧遁草酵素液巴布剂及其制备方法，目的在于解决现有技术用药量不易控制、使用不方便且药效发挥不充分的问题。
为了解决上述的技术问题，本发明提出的基本技术方案为：
一种忧遁草酵素液巴布剂，包括忧遁草酵素液、水溶性基质、背衬层以及保护膜，以质量份数计，其中；
所述忧遁草酵素液 40～80份
所述水溶性基质包括以下组分：
以及，一种忧遁草酵素液巴布剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤S01：将处方量的忧遁草酵素液经0.2-0.4微米超滤膜超滤，滤液经截留分子量为300-1000的纳滤膜纳滤，合并纳滤和超滤截留物，用蒸馏水溶解制成与忧遁草酵素液相同体积的忧遁草酵素液处理液；
步骤S02：将处方量的甘油加入真空搅拌器内，再将处方量的聚丙烯酸钠、陶瓷粉、甘羟铝、乙二胺四乙酸加入其中，搅拌5min，得到甘油相，将聚乙烯毗咯烷酮、柠檬酸共同溶于蒸馏水中，得混合物，将混合物与忧遁草酵素液处理液共同一次性加入甘油相中，搅拌12min，得到膏体；
步骤S03：将膏体转移至涂布切割机上，进行涂布切割，得到忧遁草酵素液巴布剂半成品，将忧遁草酵素液巴布剂半成品置于湿度55％、温度30℃条件下，存放18h，再置于湿度75％、温度20℃条件下，存放12h，进行包装，包装后，再置于阴凉处静置96h，即得忧遁草酵素液巴布剂。
本发明的有益效果是：
本发明通过将忧遁草制备成巴布剂，用药量易于控制，使用方便，药效显著稳定，药效大大提高，一方面可以覆盖伤口阻断感染物，另一方面可以加入促透剂皮肤给药，进行跌打肿胀治疗。
附图说明
图1是本发明实施例提供的忧遁草酵素液HPLC色谱图(λ＝280nm)；
图2是本发明实施例提供的忧遁草巴布剂2小时透皮液HPLC色谱图(λ＝280nm)；
图3是本发明实施例提供的忧遁草巴布剂4小时透皮液HPLC色谱图(λ＝280nm)；
图4是本发明实施例提供的忧遁草巴布剂6小时透皮液HPLC色谱图(λ＝280nm)
图5是本发明实施例提供的忧遁草巴布剂8小时透皮液HPLC色谱图(λ＝280nm)；
图6是本发明实施例提供的时间与透过量的线性关系图；
图7是本发明实施例提供的空白基质组致炎前后对比图；
图8是本发明实施例提供的阿 司 匹 林 组致炎前后对比图；
图9是本发明实施例提供的忧 遁 草 巴 布 剂 高 剂 量 组致炎前后对比图；
图10是本发明实施例提供的忧 遁 草 巴 布 剂 中 剂 量 组致炎前后对比图；
图11是本发明实施例提供的忧 遁 草 巴 布 剂 低 剂 量 组致炎前后对比图；
图12是本发明实施例提供的忧遁草巴布剂对鸡蛋清致小鼠足跖肿胀的影响不同时间对比图；
图13是本发明实施例提供的各组大鼠圆形创面修复情况不同时间对比图；
图14是本发明实施例提供的忧遁草酵素的大肠杆菌抑菌圈实验结果图；
图15是本发明实施例提供的忧遁草酵素的金黄色葡萄球菌抑菌圈实验结果图。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，但不应以此来限制本发明的保护范围。
本发明提供了一种忧遁草酵素液巴布剂，包括忧遁草酵素液、水溶性基质、背衬层以及保护膜，以质量份数计，其中；
所述忧遁草酵素液 40～80份
所述水溶性基质包括以下组分：
所述忧遁草酵素液按下述步骤得到：
将6份水、3份忧遁草叶子、1份黑糖在常温下发酵得到所述忧遁草酵素液。
背衬层所使用的背衬材料可以采用棉布、无纺布、纸中的一种；保护膜所使用的盖衬材料可以采用防粘纸、聚乙烯塑料薄膜、铝箔聚乙烯复合膜、硬质纱布中的一种。具体的，本发明实施例中背衬层所使用的背衬材料均采用无纺布，保护膜所使用的盖衬材料均采用聚乙烯塑料薄膜。
本发明还提供了一种上述忧遁草酵素液巴布剂的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤S01：将处方量的忧遁草酵素液经0.2-0.4微米超滤膜超滤，滤液经截留分子量为300-1000的纳滤膜纳滤，合并纳滤和超滤截留物，用蒸馏水溶解制成与忧遁草酵素液相同体积的忧遁草酵素液处理液；
步骤S02：将处方量的甘油加入真空搅拌器内，再将处方量的聚丙烯酸钠、陶瓷粉、甘羟铝、乙二胺四乙酸加入其中，搅拌5min，得到甘油相，将聚乙烯毗咯烷酮、柠檬酸共同溶于蒸馏水中，得混合物，将混合物与忧遁草酵素液处理液共同一次性加入甘油相中，搅拌12min，得到膏体；
步骤S03：将膏体转移至涂布切割机上，进行涂布切割，得到忧遁草酵素液巴布剂半成品，将忧遁草酵素液巴布剂半成品置于湿度55％、温度30℃条件下，存放18h，再置于湿度75％、温度20℃条件下，存放12h，进行包装，包装后，再置于阴凉处静置96h，即得忧遁草酵素液巴布剂。
本发明忧遁草酵素液巴布剂的制备方法，通过选择特定组成和配比的原料，按照特定的顺序加料，得到上述的忧遁草酵素液巴布剂，该方法工艺简单，易操作。
实施例1：
所述忧遁草酵素液巴布剂包括以下组分，按质量份数计：取6份聚丙烯酸钠，0.15份甘羟铝，1.5份聚乙烯毗咯烷酮，35份甘油，0.15份陶瓷粉，0.05份乙二胺四乙酸，0.05份柠檬酸，60份忧遁草酵素液。
按照如下步骤制备忧遁草巴布剂：
将处方量的忧遁草酵素液经0.2-0.4微米超滤膜超滤，滤液经截留分子量为300-1000的纳滤膜纳滤，合并纳滤和超滤截留物，用蒸馏水溶解制成与忧遁草酵素液相同体积的忧遁草酵素液处理液；
将处方量的甘油加入真空搅拌器内，再将处方量的聚丙烯酸钠、陶瓷粉、甘羟铝、乙二胺四乙酸加入其中，搅拌5min，得到甘油相，将聚乙烯毗咯烷酮、柠檬酸共同溶于蒸馏水中，得混合物，将混合物与忧遁草酵素液处理液共同一次性加入甘油相中，搅拌12min，得到膏体；
将膏体转移至涂布切割机上，进行涂布切割，得到忧遁草酵素液巴布剂半成品，将忧遁草酵素液巴布剂半成品置于湿度55％、温度30℃条件下，存放18h，再置于湿度75％、温度20℃条件下，存放12h，覆盖上保护膜，再置于阴凉处静置96h，即得忧遁草酵素液巴布剂。
综合感官评价、质量评价、体外经皮渗透实验、药效动物实验、急性毒性实验以及长期毒性实验
一、综合感官评价
对上述实施例1制备的忧遁草酵素液巴布剂按照表2巴布剂综合感官评价指标进行评价，巴布剂综合感官评价指标是根据膏体外观性状、贴于皮肤上的舒适性、剥离强度、皮肤黏附性、反复揭贴性等主观指标，采用评分法，总指标满分为5分，评分方式如表1所示。
表1 忧遁草巴布剂综合感官评价指标
上述实施例1制备的忧遁草酵素液巴布剂评价结果为4.6分。
二、质量评价
2.1质量评价方法
根据《中国药典》2010版规定，制备三批上述实施例1制备的忧遁草酵素液巴布剂，进行质量评价试验，包括含膏量试验、赋型性试验、初黏力试验、持黏力试验、高温试验、高湿试验。
2.1.1含膏量试验
分别取三批上述实施例1制备的忧遁草酵素液巴布剂各2片(6cm×9cm)，除去保护膜，精密称定，置烧杯中，加适量水，加热煮沸至背衬无残留膏体，晾干，在105℃干燥30min，移置干燥器中，冷却30min，精密称定，减失重量即为膏量，按标示面积换算成100cm2的膏体。
2.1.2赋型性试验
分别取三批上述实施例1制备的忧遁草酵素液巴布剂各2片，置于37℃，相对湿度64％的恒温恒湿箱中30min后取出，用夹子将供试品固定在一平整钢板上，钢板与水平面的倾斜角为60°，放置24小时，膏面应无流淌现象。
2.1.3初黏力试验
采用斜坡滚球测定，取一块巴布剂除去防黏层，置于与水平面成15°倾斜扳中央，膏面向上，斜面上部10cm及下部15cm用0.025mm厚的涤纶薄膜覆盖，中间留出5cm膏面，将不同规格的钢球，自斜面顶端自由滚下，记录可以粘住的钢球号。
2.1.4持黏力试验
实验前将试验板和加载板用无水乙醇擦洗干净后，将上述实施例1制备的忧遁草酵素液巴布剂粘性面粘贴于实验板表面，垂直放置，沿供试品的长度方向悬挂一300g的砝码，记录供试品从垂直放置到滑移至脱落所需时间。
2.1.5高温试验
将同一批号的忧遁草酵素液巴布剂置恒温恒湿箱中，在温度为60°相对湿度为65％条件下放置20天，对其性状、含膏量、初黏力、持黏力进行检测，于0、10、20天取样检测。
2.1.6高湿试验
将同一批号的忧遁草酵素液巴布剂置恒温恒湿箱中在温度为25°，相对湿度为90％条件下放置20天，对其性状，含膏量，初粘力，持粘力，吸湿增重进行检测，于0，10，20天取样检测。
2.2质量评价结果
2.2.1含膏量的测定
含膏量的测定结果见表2
表2 含膏量测定结果
2.2.2赋形型的测定
赋形性的测定结果表明，三批巴布剂赋形性良好，均无任何流淌现象。
2.2.3初黏力测定
初黏力的测定结果见表3和表4。
表3 测试钢球的直径与体积
表4 粘着力测定结果
测定结果表明该忧遁草酵素液巴布剂能粘住7号钢球，钢球重为11.269g。
测定结果表明该忧遁草巴布剂持黏力的时间为72S。
2.2.4高温试验
高温试验的测定结果见表5。
表5 高温试验检测结果
结果发现基质变色严重，膏体变硬，根据高温试验稳定性考察指导原则，改为在40℃
2.2.5高湿试验
高湿试验的测定结果见表6。
表6 高湿试验检测结果
结果显示在温度为25℃、相对湿度为90％状态下，巴布剂各检查项目均无明显改变，吸湿在2％以下，各项指标相对稳定。建议产品密封包装。
三、体外经皮渗透实验
3.1材料
3.1.1实验动物
昆明种小鼠，体重18-22g，
3.1.2药物：上述实施例1制备的忧遁草酵素液巴布剂
3.2方法
3.2.1离体小鼠皮肤的制备与处理
取雄性昆明小鼠，实验前给其注射0.3微升的戊巴比妥钠将其麻醉，用电动剃毛刀除去腹部鼠毛，再以溶液涂布腹部皮肤，后以温水反复洗净干净，禁食不禁水。实验时颈椎脱臼处死，用眼科剪分离腹部皮肤，并将其平铺于干净的玻璃板上，角质层朝下，用棉签小心擦除皮下组织和脂肪。选取没有破损的完整皮肤用无菌生理盐水冲洗数次，直至皮肤白色为止，用铝箔包裹，于-20℃低温冰箱中保存，24h内用完。实验前自然恢复至室温，并检查鼠皮的完整性，不能有任何破损。
3.2.2试用巴布剂的制备
按照1％氮酮、2％丙二醇作为促透剂，制备成巴布剂，放置恒温恒湿箱中至成型，作为供试巴布剂。
3.2.3体外经皮渗透实验
采用实验室改良的扩散池，上层为供给室，下层为接收室，接收室的一侧用于取样，补充药液和排除气泡用。
将制备好的离体皮肤从冰箱中取出，浸泡于生理盐水中解冻，用滤纸吸干表面水分后，将优盾草巴布剂贴在皮肤的角质层面，然后将处理好的皮肤固定于扩散池的供给室与接受室之间，角质层面向供给室，接受池中加入空白接受液(乙醇∶水＝3∶7)30ml，排净气泡。磁力搅拌速度约为200r/min，水浴温度士30℃。以开启磁力搅拌器时计时，分别于2h、4h、6h、8h取样，每次取样1ml，同时补加1ml空白接受液。样品溶液用水滤膜滤过，用HPLC测定其中含量。
色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)
流动相：乙睛为30％一水为70％进行等度洗脱
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样量：10μL
检测波长：λ＝280nm
3.3.实验结果
3.3.1供试品溶液的制备
从接受池中取出全部接受液，水浴上蒸至有成分析出，残液过水滤膜，即得。
3.3.2药液原液与透皮液液相色谱研究结果如图1至图6所示，
表7 时间与透过量的线性测定结果
本实验采用归一法对峰面积进行计算，实验结果表明，透皮时间与透皮量呈良好的线性关系，即透皮时间越长，透皮量越多表明药效越好。
忧遁草酵素原液的一部分可以透过皮肤，其余可能是大分子物质，推测这部分为超滤截留物，虽然不能透过皮肤，但是可能有促进伤口愈合的功效。巴布剂将超滤及纳滤截留物合并，具有抗肿消炎及促进伤口愈合两种功效。
四、药效动物实验
4.1材料：
4.1.1实验动物
昆明种小鼠310只，体重18-22g，
4.1.2仪器及试剂
打孔器 电子分析天平 一次性注射器 手术刀
角叉菜胶 二甲苯 鲜鸡蛋
4.1.3药物：为上述实施例1制备的忧遁草酵素液巴布剂
4.2方法
4.2.1抗肿消炎
A：小鼠耳廓肿胀实验
取健康昆明种小白鼠50只，雌雄各半，体重18-22g，随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组(仅含基质巴布剂组)，阿司匹林组(阳性对照组)，忧遁草酵素液巴布剂高、中、低剂量组，按忧遁草生叶子重量计，高剂量组为生药800mg/kg，中剂量组为400mg/kg，低剂量组为200mg/kg。阿司匹林组给予阿司匹林粉末灌胃(400mg/kg)，每日一次，空白基质组及忧遁草酵素液巴布剂组分别在小鼠左耳敷贴。每12小时更换一次，连续用药6次。末次给药1h后在每组小鼠左耳前后两面涂0.02ml二甲苯，15min后将小鼠脱臼处死，沿耳廓基线剪下双耳，用8mm打孔器在相同部位打下等面积双耳，用电子分析天平称重，左右耳作对照。计算每只小鼠左耳的肿胀度和该组的肿胀抑制率。
肿胀度＝致炎侧耳片重量-非致炎侧耳片重量
肿胀率(％)＝(致炎侧耳片-非致炎侧耳片重量)/非致炎侧耳片重量×100％
肿胀抑制率(％)＝(对照组平均肿胀率-给药组平均肿胀率)/对照组平均肿胀率×100％)
B：鸡蛋清致小鼠足趾肿胀实验
取健康昆明种小白鼠50只，雌雄各半，体重18-22g，随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组(仅含基质巴布剂组)，阿司匹林组(阳性对照组)，忧遁草酵素液巴布剂高、中、低剂量组。阿～匹林组给予阿司匹林粉末灌胃(400mg/kg)，空白基质组及忧遁草酵素液巴布剂组分别在小鼠右后足跖敷贴。每12小时更换一次，连续用药10次。末次给药1h后用排水法测定每组小鼠右后肢正常足跖容积后，立即将小鼠后肢拉直，先自小鼠右后足跖中部皮下向上一部分10％新鲜鸡蛋清(25℃)，然后调转针头向下注射完(0.2ml/只)致炎，分别于致炎后1，2，4h用排水法测小鼠足跖容积，计算得到各剂量组的肿胀抑制率以及不同时间的抗炎效应数据。按下式计算
肿胀率(％)＝(致炎后足趾容积值-致炎前足趾容积值)/致炎前足趾容积值×100％
肿胀抑制率(％)＝(对照组平均肿胀率-给药组平均肿胀率)/对照组平均肿胀率×100％
C：角叉菜胶致小鼠足跖肿胀实验
取健康昆明种小白鼠50只，雌雄各半，体重18-22g，随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组(仅含基质巴布剂组)，阿司匹林组(阳性对照组)，忧遁草酵素液巴布剂高、中、低剂量组。阿司匹林组给予阿司匹林粉末灌胃(400mg/kg)，空白基质组及忧遁草酵素液巴布剂组分别在小鼠右后足跖敷贴。每12小时更换一次，连续用药10次。末次给药1h后用排水法测定每组小鼠右后肢正常足跖容积后，立即将小鼠后肢拉直，先自小鼠右后足跖中部皮下向上一部分1％角叉菜胶混悬液，然后调转针头向下注射完(0.1ml/只)致炎，分别于致炎后1，2，4，6h用排水法测小鼠足跖容积，计算得到各剂量组的肿胀抑制率以及不同时间的抗炎效应数据。计算公式同上。
4.2.2促伤口愈合
A：大鼠“十字”物理创伤实验
选用SD大鼠50只，雌雄各半，SPF级，随机分为5组，分别为空白对照(仅含基质巴布剂)组，阳性对照(云南白药粉末)组，忧遁草巴布剂高、中、低剂量组，首先用戊巴比妥钠10mg/kg给予大鼠腹腔注射麻醉，在其背部用消毒手术刀划上直径约3cm的十字伤口，深及筋膜肌肉。阳性对照组给予小鼠创伤部位涂抹云南白药粉末；空白对照组及忧遁草巴布剂组给予小鼠创伤部位敷贴忧遁草巴布剂，每24小时更换一次。观察各组小鼠在不同时间3，6，9，15d伤口的愈合情况。
B：小鼠“圆形”物理创伤实验
选用昆明种小鼠60只，雌雄各半，SPF级，随机分为6组，分别为空白对照(仅含基质巴布剂)组，阳性对照(云南白药粉末)组，阳性对照(林可霉素利多卡因凝胶剂)组，忧遁草酵素液巴布剂高、中、低剂量组，首先用戊巴比妥钠40μg/g给予小鼠腹腔注射麻醉，在背部切取直径为1.5cm大小的皮肤，深及筋膜肌肉。阳性对照组给予小鼠创伤部位涂抹云南白药粉末，空白对照组及忧遁草酵素液巴布剂组给予小鼠创伤部位敷贴忧遁草酵素液巴布剂，每24小时更换一次，采用数码照相的方法记录1，3，6，9，12，15，20d的伤口面积，使用图像软件分析创面面积。计算创面皮肤愈合率，开始结痂、脱痂天数和愈合天数作为结果评价受试药物的作用。末次用药后次日监测大鼠血样，然后脱颈处死，剪取创伤部位皮肤，固定于10％甲醛溶液中，石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察比较各组小鼠割伤皮肤的表皮修复、真皮胶原纤维束修复、真皮毛囊增生、真皮及皮下组织炎症细胞浸润的愈合程度。
4.2.3抗菌活性
菌悬培养液法
(1)牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-20g、水1000ml、pH 7.4-7.6(7.0-18.0)
操作方法：
按培养基配方所指示的比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨和氯化钠放入烧杯中。牛肉膏用玻棒挑取，放在培养基单面中称量，用热水溶化后倒入烧杯。我查到蛋白胨很易吸潮，所以快速准确的称取蛋白胨。在上述烧杯中可先加入少于1000ml的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再继续加热溶化，在琼脂溶化的过程中，不断搅拌，最后补足所失的水分。
在未调pH前，先用玻璃棒蘸取培养液放到pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6左右。培养基制作完毕后，在大三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。将培养基以121.3℃，20分钟用高压蒸汽锅灭菌。灭菌一次时间大约2小时。裁取大约直径6mm的滤纸片，放入干燥的培养皿上，进行121.3℃灭菌20分钟，随后可浸入各个液体中1小时，在无菌操作台中操作。将配置好的培养基分装到多个已高温消毒的小三角烧杯中。
(2)菌液注入
用0.1ml无菌移液枪吸取0.01mL已充分混匀的大肠杆菌及0.01ml金黄葡萄球菌菌悬液，注射入分装好的小三角烧瓶的未凝固的培养基中振荡，使菌液充分混匀，倒平板常温放置，备用。
滤纸片扩散法抑菌：
将蘸有各种浓度的药液的滤纸片贴到上述两种方法冷却凝固后的培养基上。放置恒温培养箱中37℃培养，每隔4小时观察效果。
抗菌时间测定：在培养期间，每隔4小时观察一次，记录抑菌圈变化，找到抑菌圈最大直径时间。
4.3实验结果
4.3.1忧遁草酵素液巴布剂对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
结果见表8及图7至图11。由表8可知，与空白基质组相比较，阿司匹林(阳性对照)组及忧遁草酵素液巴布剂高、中、低剂量组均能使小鼠耳廓的肿胀度降低，即使其肿胀得到一定的抑制。由表中数据显示，其中忧遁草酵素液巴布剂高剂量组(800mg/kg)在各小组中肿胀抑制率最高(70.12％)，远超过了阿司匹林组(阳性对照)400mg/kg剂量的肿胀抑制作用(43.53％)，忧遁草酵素液巴布剂中剂量组(400mg/kg)的肿胀抑制作用则与阿司匹林组的几乎相当，忧遁草酵素液巴布剂低剂量组(200mg/kg)也有较好的肿胀抑制作用，这表明，忧遁草酵素液巴布剂对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有显著的抑制作用，且呈现一定的剂量依赖性。
表8 忧遁草酵素液巴布剂对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(n＝10)
与空白基质组比较*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001
4.3.2忧遁草酵素液巴布剂对鸡蛋清致小鼠足跖肿胀的影响
结果见表9及图12。10％新鲜鸡蛋清注射小鼠足跖后，阿司匹林(阳性对照)组及忧遁草酵素液巴布剂高、中、低剂量组在给药后，均能较大程度降低小鼠足跖肿胀率，持续与模型组比较，有显著差异(P＜0.001)；从肿胀抑制率的数据显示，1h后与其他组相比较得出，忧遁草酵素液巴布剂高剂量组的肿胀抑制率65.05％最高，远高于阿司匹林组肿胀抑制率46.87％。再查看2h、4h的肿胀抑制率，也是忧遁草酵素液巴布剂高剂量组的肿胀抑制率最高，忧遁草酵素液巴布剂中剂量组的肿胀抑制率与阿司匹林组的抑制效果几乎相当，而忧遁草酵素液巴布剂低剂量组的肿胀抑制率相对而言较差些。综合来看，可以得出忧遁草酵素液巴布剂对新鲜鸡蛋清所致小鼠足跖肿胀有显著的抑制作用，从各剂量的结果表明，忧遁草酵素液巴布剂对抑制鸡蛋清致小鼠足跖肿胀有一定的剂量依赖性。
表9 忧遁草酵素液巴布剂对鸡蛋清致小鼠足跖肿胀的影响(±s，n＝10)
(1)
(2)
4.3.3忧遁草酵素液巴布剂对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响结果见表10
表10 忧遁草酵素液巴布剂对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响(n＝10)
(1)
(2)
4.3.4忧遁草酵素液巴布剂对小鼠背部“圆形”创面的促愈合作用，见表11及图13，
表11 忧遁草酵素液巴布剂对小鼠背部“圆形”创面的促愈合作用
(1)
(2)
数据处理：
应用SPSS19.0统计软件进行数据处理，实验数据以±s表示，小鼠耳廊肿胀试验数据组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，小鼠足址肿胀试验数据组间比较采用多因素方差分析(Two-way ANOVA)，P＜0.05或P＜0.01时，组间差异判断为具有统计学意义。
4.3.5抗菌活性
菌悬培养液法
(1)忧遁草酵素萃取液的抗菌活性
忧遁草酵素的大肠杆菌抑菌圈实验结果如图14所示，
忧遁草酵素对大肠杆菌抑菌圈实验结果如图14所示，滤纸片上方是纳滤液的大肠杆菌抑菌圈，左下方是忧遁草酵素10倍浓缩液，右下方是酵素5倍浓缩液。
表12 忧遁草酵素对大肠杆菌的抗菌活性
忧遁草酵素对金黄色葡萄球菌抑菌圈实验结果如图15所示，滤纸片上方是纳滤液，下方左边的是忧遁草原液的10倍浓缩液，右边的是忧遁草原液5倍浓缩液。
表13 忧遁草酵素对金黄色葡萄球菌的抗菌活性
从表12和表13可以看出，忧遁草酵素纳滤液的抑菌圈直径最大，5倍浓缩液抑菌圈很小，10倍浓缩液抑菌圈近乎没有。我们得出结论，忧遁草酵素乙酸乙酯提取液具有强抗菌活性，但是在高温浓缩后，抗菌活性很低，则高温环境会破坏忧遁草酵素的抗菌活性。
五、急性毒性实验
5.1材料
5.1.1实验动物：昆明种小鼠24只，体重18-22g，
5.1.2药物：为上述实施例1制备的忧遁草酵素液巴布剂
5.2方法
将健康的昆明系清洁级小鼠24只，随机分为A、B、C、D、E、F6组，雌雄数目相近，四个实验组为完整皮肤高、低剂量组A、B，和破损皮肤高、低剂量组C、D，另外两个对照组为完整皮肤对照组E和破损皮肤对照组F。高剂量忧遁草酵素液巴布剂为40ml的含药量，低剂量忧遁草酵素液巴布剂为20ml的含药量，破损皮肤组用消毒后的针头划痕，以渗血为度。实验前24h用蒸馏水配置1％的戊巴比妥钠溶液，每只小鼠腹腔注射约0.3ml，待小鼠麻醉后，用脱毛膏将其脊柱两侧毛脱净，去毛区约为小鼠体表面积的15％，去毛后12h检查去毛区的皮肤是否遭到损伤，确保完整皮肤组的准确度。
两个对照组贴上巴布剂基质，高剂量的两个组贴上含药量为40ml的忧遁草酵素液巴布剂，低剂量的两个组贴上20ml含药量的忧遁草酵素液巴布剂，所有小鼠背上的巴布剂都用长宽合适的纱布缠绕固定，小鼠分笼饲养。受试24h后去除巴布剂，并用棉签蘸取温水将小鼠皮肤上的残留物洗净。主要观察指标为受试后小鼠的体重、皮肤、毛发、眼黏膜、四肢活动、呼吸、中枢神经系统，观察时间为去除受试物后1h、24h、48h、72h。
5.3实验结果
6组小鼠的体重变化如下，结果见表14、表15、表16：
表14 完整皮肤高低剂量组各小鼠的体重变化
表15 破损皮肤高低剂量组各小鼠的体重变化
表16 对照组各小鼠的体重变化
由以上三表可以看出，完整皮肤组及破损皮肤组小鼠在高剂量和低剂量巴布剂的作用下，体重未发生明显变化，作为对照的E、F两组各小鼠的体重也变化不明显，处于一个正常的状态，因此可以得出，忧遁草酵素液巴布剂在高低剂量下，对小鼠的体重不会产生影响。
在观察时间内，各组小鼠的毛发、眼黏膜未见异常，四肢活动正常，能够行走攀爬，呼吸平稳，与实验前无异，综合以上观察数据，可以看出小鼠受试后并未出现任何的中毒表现，因此，忧遁草酵素液巴布剂对小鼠没有毒性。
六、长期毒性实验
6.1材料
6.1.1实验动物：昆明种小鼠40只，体重18-22g，
6.1.2药物：为上述实施例1制备的忧遁草酵素液巴布剂
6.2方法
将健康的昆明系清洁级小鼠40只，重量20g左右，随机分为4组，雌雄数目相近，其中两个实验组为完整皮肤组A、破损皮肤组B，另外两个对照组为完整皮肤组C、破损皮肤组D，每组10只，每只小鼠分笼饲养。实验前24h用蒸馏水配置1％的戊巴比妥钠溶液，每只小鼠腹腔注射约0.3ml，待小鼠麻醉后，用脱毛膏将其脊柱两侧毛脱净，去毛后12h检查去毛区的皮肤是否遭到损伤，破损皮肤组用消毒后的针头划痕，以皮肤破损渗血为度。
实验组受试忧遁草酵素液巴布剂，对照组受试空白基质，每只小鼠的受试部位用洁净纱布缠绕固定巴布剂。每天用药一次，每次持续8h，每天观察用药处小鼠皮肤的变化情况，同时观察其毛发、四肢活动、精神状态等，每周脱毛一次、称重一次。连续用药8周后，每组均处死5只小鼠，剩余小鼠在停药1周内继续观察，一周后处死。
每只小鼠在处死后，快速打开胸腔暴露心脏，持10ml注射器经左心室插入抽取5-8ml血液标本，测定血液生化指标，即天门冬氨基转移酶(AST)、两氣酸转移酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHOL)并比较组间差异，取心、肺、肝、脾、肾称重，计算脏器指数，并与对照组比较。
6.3实验结果
6.3.1一般变化
表17 给药期间实验动物一般情况观察
表18 停药期间实验动物一般情况观察
由表17及表18可以看出，用药组和对照组在8周内及停药1周期间，外观均无明显变化，毛发未见不正常脱落，色泽正常，四肢活动正常，无腹泻不进食等变化。
6.3.2体重变化
表19 忧遁草巴布剂对小鼠体重的影响(x±s)
从表19可以看出，实验组的小鼠体重处于正常增长状态，且每周的体重变化波动不大，与对照组无较大差异，表明忧遁草巴布剂不会影响到小鼠的体重变化。
6.3.3生化指标变化
表20 给药8周后对小鼠生化指标的影响(x±s)
表21 停药1周后对小鼠生化指标的影响(x±s)
由表20表21可以看出，长期外用忧遁草酵素液巴布剂的各组小鼠血液生化指标与对照组相比并无明显差异。
6.3.4脏器系数变化
表22 给药8周后对小鼠脏器系数的影响(x±s)
表23 停药1周后对小鼠脏器系数的影响(x±s)
小鼠解剖未发现实验组小鼠的心、肝、脾、肺、肾有明显异常，且由表22表23可以看出，实验组小鼠的脏器系数与对照组无明显差异。
6.4分析
实验结果表明，长期外用忧遁草酵素液巴布剂的小鼠皮肤毛发、四肢活动、饮食等皆正常，体重变化与对照组小鼠几乎无异，血液生化指标也处于正常状态，解剖发现内脏均无病变，因此可以得出，长期使用忧遁草酵素液巴布剂对小鼠不会有毒性作用。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。