技术领域
本发明涉及一种中药组合物的新用途，特别涉及在治疗感染性疾病的 新用途。
背景技术
炎症反应和免疫功能的紊乱在感染性疾病的发生、发展过程中起着关 键的作用，多重耐药菌感染亦不例外。其与非耐药菌感染在感染后出现的 炎症反应和免疫功能的紊乱是一致的，只是因为针对多重耐药菌的治疗不 如非耐药菌有效，不能及时有效地清除多重耐药菌这一感染因素，也就意 味着不能在短时间内调整其引发的炎症反应和免疫功能的紊乱，从而导致 多重耐药菌感染迁延难愈，预后较差。
多肽阵列技术能用多肽模拟蛋白抗原与自身抗体结合，被认为是后基 因组时代与基因芯片、蛋白芯片相媲美的新型蛋白位点检测技术。现已被 广泛应用于抗体研究、基因表达分析、发现新基因、疾病诊断及药物筛选 等领域，应用前景广阔。目前国内该技术较多用于癌症研究，如肿瘤患者 自身抗体的早期监测，抗体识别抗原表位的研究等，如应用多肽芯片研究 非小细胞肺癌患者血清中的EGFR自身抗体；另有应用抗体芯片来鉴定肾组 织中的异常表达蛋白，进行慢性肾病的早期诊断和治疗监测等。目前在细 菌感染的中医中药干预的基础研究中，尚未检索到相关应用。
目前现有技术没有公开本发明组合物用于治疗多重耐药菌感染所致炎 症反应和免疫功能紊乱。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中药组合物在制备抗感染药、提高免疫功 能药物中的应用。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种中药组合物在制备抗感染药物中应用；
本发明提供一种中药组合物在制备抗感染和/或治疗炎症和/或提高免 疫药物中应用；所述中药组合物由如下原料药制成：
生黄芪 30-120重量份 当归 5-20重量份
金银花 10-25重量份 青蒿 10-30重量份
虎杖 5-20重量份。
上述中药组合物优选由如下原料药制成：
生黄芪 40-110重量份 当归 6-19重量份
金银花 12-23重量份 青蒿 12-28重量份
虎杖 5-20重量份。
上述中药组合物优选由如下原料药制成：
生黄芪 55-95重量份 当归 8-15重量份
金银花 12-22重量份 青蒿 13-25重量份
虎杖 5-20重量份。
上述中药组合物优选由如下原料药制成：
生黄芪 85重量份 当归 15重量份
金银花 18重量份 青蒿 22重量份
虎杖 10重量份。
上述中药组合物优选由如下原料药制成：
生黄芪 55重量份 当归 19重量份
金银花 24重量份 青蒿 15重量份
虎杖 6重量份。
上述中药组合物优选由如下原料药制成：
生黄芪 110重量份 当归 8重量份
金银花 15重量份 青蒿 28重量份
虎杖 18重量份。
上述应用，其中的感染为铜绿假单胞菌所致；
所述铜绿假单胞菌为CGMCC No.5317。
上述中药组合物加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的 水煎剂、胶囊剂、片剂、丸剂、口服液体制剂、注射剂、散剂等各种剂型。
所述常规工艺方法包括水提取或醇提取或先水提取再醇提取或先醇提 取后再水提取；经上述常规提取后还可以过大孔树脂柱进一步富集有效成 分。
为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料， 例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防 腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、 微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧 甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维 素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等； 助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤 维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等； 甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包 括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山 梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000， PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂 型时加入药学可接受的其它辅料(范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版 社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料)。
本发明组合物扶正透邪方能降低腹腔感染大鼠的死亡率、调节感染后 大鼠炎症和免疫紊乱的作用。
菌株保藏信息：
本发明所述多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株1643号的保藏单位：中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2011 年10月10日；编号：CGMCC No.5317；分类命名：铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa。
具体实施方式
实验例：
1.材料与仪器
1.1干预药物
1.1.1扶正透邪方提取物：按照实施例1的方法制备。低浓度0.5g/ml、中 浓度0.99g/ml、高浓度1.98g/ml。本实验所设大鼠扶正透邪方小剂量药量相当 于70kg成人用量的2.15倍，中剂量相当于70kg成人用量的6.3倍，大剂量药 量相当于70kg成人用量的12.6倍。
1.1.2注射用头孢他啶：深圳致君制药有限公司产品批号E20100102。
1.1.3注射用头孢哌酮舒巴坦钠：辉瑞制药有限公司产品批号1039098。
1.1.4注射用亚胺培南西司他丁钠：Merck&Co.，Inc.USA产品批号 100231。
1.2实验动物：SD大鼠，雌雄各半，清洁级，体重200～220g，购 自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，合格证号SCXK-(军) 2007-004。
实验菌株：多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株1643号，编号：CGMCC No.5317；分类命名：铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。
1.3主要试剂与仪器
1.3.1M-H琼脂平板：XWO1100301赛默飞世尔生物化学制品(北京) 有限公司。
1.3.2RPMI-1640培养基：Sigma。
1.3.3刀豆蛋白A：Sigma。
1.3.4脂多糖：Sigma。
1.3.5MTT：Sigma。
1.3.6小牛血清：民海生物公司。
1.3.7磷酸盐缓冲液(PBS)粉末：鼎国生物技术有限公司。
1.3.8Tris：上海化学试剂厂。
1.3.9NH4Cl：北京红星化工厂。
1.3.10 0.01NH4Cl-10％SDS：GIBCO。
1.3.11 Rat IL-1βELISA试剂盒：96t ZABFBZAA01上海依科赛生物制 品有限公司。
1.3.12 Rat IL-2ELISA试剂盒：96t ZJBFBZAZ03上海依科赛生物制品 有限公司。
1.3.13 Rat IL-4ELISA试剂盒：96t ZCAABZAA03上海依科赛生物制 品有限公司。
1.3.14 Rat IL-10ELISA试剂盒：96t ZLBGBZAZ02上海依科赛生物制 品有限公司。
1.3.15 Rat IFN-γELISA试剂盒：96t ZCCZBZAA02上海依科赛生物制 品有限公司。
1.3.16 Rat TNF-αELISA试剂盒：96t ZDBZBZAA02上海依科赛生物 制品有限公司。
1.3.17比浊管。
1.3.18微量移液器：GILSON P 0.1-1.0ml。
1.3.19电子称：SCOUT SC6010梅特勒.托利多常州衡器有限公司。
1.3.20电子微量天平：JA3003上海越平科学仪器有限公司。
1.3.21体温计：MC140 OMRON。
1.3.22立式自动电热压力蒸汽灭菌器：AMA440N ATELL。
1.3.23电热恒温培养箱：DNP9162 JINGHONG。
1.3.24涡混合器：VORTEX-2 GENIE。
1.3.25微量搅拌器：75-2型 上海医用分析仪厂。
1.3.26低温高速离心机：Labofuge 400R Kendro。
1.3.27超净工作台：北京碧都。
1.3.28酶标分析仪：DNM-9602 PROLONG。
1.3.29全波长多功能酶标仪：SepctraMR MRW DYNEX
1.3.30全自动血细胞分析仪：LH 750 ANALYZER BECKMAN COULTER。
1.3.31 特种蛋白分析仪：BN ProSpec SIEMENS。
1.3.32 AutoSpot peptide synthesizer；FX-7数字成像分析仪，
1.3.33 PEG修饰纤维素膜，Fmoc-氨基酸，DCM，aminefreeDMF，乙 醇，Acetic anhydride，Acetic anhydride，DIPEA(Diisopropylamine)， DIC(Diisopropylcarbodiimide)，Bromophenolblue，Piperidine等。
1.4试剂配制
1.5.1 10％水合氯醛溶液的配制
水合氯醛 10g
加入蒸馏水 100ml
1.5.2 Tris-NH4Cl溶液的配制
Tris溶液(0.17mol/L) 10ml
NH4Cl溶液(0.16mol/L) 90ml
1.6菌悬液的制备
将实验菌株接种于M-H琼脂培养基活化，经37℃恒温培养18～24h 后，用生理盐水洗脱菌落，离心，3000rpm，20min，弃去上清，加入生理 盐水，混匀后吸出0.5ml加入新的无菌试管中，加入适量生理盐水，与比 浊计进行比浊，将菌液稀释成24×108CFU/ml，用酶标仪检测OD值为 0.675±0.005，再将其稀释成0.48×108CFU/ml，作为实验菌悬液。
2实验方法
2.1动物模型
SD大鼠常规饲养一周，室温控制在18℃～22℃之间，自由获取食、水， 采血前禁食过夜。
按照杨钧，张淑文，阴赪宏，等.耐药菌腹腔感染兔动物模型的建立 [J].中华医院感染学杂志，2008，18(9)：1129-1222报道的方法建立多重 耐药铜绿假单胞菌腹腔感染大鼠模型。具体方法如下：常规饲养，将多重 耐药铜绿假单胞菌菌液(以下简称菌液)同2.0％西黄芪胶1∶1混合后， 腹腔注射。注射后自由进食、饮水。对照组：腹腔注射等体积的2.0％西黄 芪胶。
2.2动物分组与处理
2.2.1死亡率保护实验
SD大鼠88只，雌雄各半，随机分对照组、模型组、扶正透邪方小剂 量组、扶正透邪方中剂量组、扶正透邪方大剂量组(即B0、B1、B2、B3、 B4)，共5组，B0组8只，其余4组每组各20只。B0组腹腔注射西黄芪 胶后(8ml/kg)，即给予0.9％生理盐水灌胃2ml，每日一次。B1组腹腔注 射菌液后(8ml/kg)，即给予0.9％生理盐水灌胃2ml，每日一次。B2、B3、 B4组腹腔注射菌液后(8ml/kg)，分别给予扶正透邪方提取物0.5g/ml、 0.99g/ml、1.98g/ml灌胃，每次2ml，每日一次。
以上各组分别于腹腔注射后6小时统计一次死亡率，其后每24小时统 计一次死亡率，第5天为终末观察点。筛选出扶正透邪方最佳给药量为： 9.9g/kg/天。
SD大鼠96只，雌雄各半，随机分模型组、西药对照组、扶正透邪方 最佳剂量组、中西医结合治疗组(即C1、C2、C3、C4)，共4组，每组 各24只。C1组腹腔注射菌液后(8ml/kg)，即给予0.9％生理盐水灌胃2ml， 每日一次。C2组腹腔注射菌液后(8ml/kg)，即给予头孢他啶，肌肉注射， 0.45g/kg/次，每日两次。C3组腹腔注射菌液后(8ml/kg)，即给予扶正透 邪方提取物(0.99g/ml)灌胃，每次2ml，每日一次。C4组腹腔注射菌液 后(8ml/kg)，即给予扶正透邪方提取物(0.99g/ml)灌胃，每次2ml，每 日一次，同时予头孢他啶，肌肉注射，0.45g/kg/次，每日两次。
以上各组分别于腹腔注射后6小时统计一次死亡率，其后每24小时统 计一次死亡率，第5天为终末观察点。
2.2.2指标检测实验
SD大鼠200只，雌雄各半，随机分为空白组、模型组、西药对照组、 扶正透邪方最佳剂量组、中西医结合治疗组(即D1、D2、D3、D4)，共 5组，每组各40只。对照组腹腔注射等体积的2.0％西黄芪胶后(5ml/kg)， 即给予0.9％生理盐水灌胃，每次2ml，每日一次。D1、D2、D3、D4组腹 腔注射菌液均为5ml/kg，其余处理方法与死亡率观察实验相同。以上各组 按时间点又分为腹腔注射后3h、8h、1d、3d和5d组，每组各8只，各组 按分组所示相应时间点，留取血及组织标本。1d、3d和5d组于留取血及 组织标本前测量肛温。
雄性SD大鼠36只，随机分为空白组、模型组、扶正透邪方最佳剂量 组，共3组，每组各12只。模型组腹腔注射腹腔注射菌液后(5ml/kg)， 即给予0.9％生理盐水灌胃，每次2ml，每日一次。扶正透邪方最佳剂量组 腹腔注射菌液后(5ml/kg)，即给予扶正透邪方提取物(0.99g/ml)灌胃， 每次2ml，每日一次。7d后留取以上各组大鼠血清标本，-20℃保存，供多 肽阵列检测使用。
2.3标本的采集与处理
2.3.1血标本
予腹腔注射10％水合氯醛溶液，4g/kg，麻醉后，常规消毒大鼠腹部皮 肤，打开腹腔，分离腹主动脉，予一次性无菌采血针分别接2ml EDTA-K3 采血管和5ml空白采血管，进行取血。采血完毕后，EDTA-K3采血管送检 血常规，空白采血管室温放置1h后，再4℃放置1h，离心，2500rpm，20min， 分离血清，分装后-70℃保存。
2.3.2组织标本
无菌留取肺、小肠组织放入4％甲醛固定液，进行切片、组织形态学观 察。
2.4检测指标与方法
2.4.1大鼠血清IL-1β的ELISA检测
1.准备工作：
(1)提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。(2)将浓缩 洗涤液用双蒸水稀释(1∶20)。(3)标准品：加入试剂稀释液0.5ml至冻干 标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为2000pg/ml)。 然后根据2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/ml浓度进行稀释。 (4)生物素化抗体工作液：使用前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩生物素化 抗体(1∶100)配置成生物素化抗体工作液。(5)酶结合物工作液：使用 前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩酶结合物(1∶100)配置成酶结合物工作液， 室温避光放置。
2.洗涤方法：用自动洗板机，注入350μl洗涤液，注入与吸出间隔20-30 秒。洗板4次。
3.操作步骤：
(1)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条。(2)留空白孔。 (3)先按标准品稀释方法加好标准品(100μl/孔)，0pg/ml孔加试剂稀释 液(Assay Diluent)100μl；在每个样本孔中加入50μl试剂稀释液(Assay Diluent)和50μl样本(此时样本已做了1∶2倍稀释，计算结果时样本含量要 乘以2)；随后在样本和标准孔中加入50μl生物素化抗体工作液，用封板胶 纸封住反应孔。(4)室温(20-25℃)，使用微量振荡仪(最低频率，100rpm)， 孵育120分钟。(5)洗板5次。(6)除空白孔外，加入酶结合物工作液(100μl/ 孔)，用封板胶封住反应孔。(7)室温(20-25℃)，使用微量振荡仪(最 低频率，100rpm)，孵育60分钟。(8)洗板5次。(9)加入显色底物(包 括空白孔)100μl/孔，室温(22-25℃)，避光孵育10分钟。(10)加入终 止液(包括空白孔)100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(10分钟内)。
4.结果判断：
(1)每个标准品和标本的OD值减去零孔的OD值。(2)手工绘制标 准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品 的坐标点。通过标本的OD值在标准曲线上查出其浓度。(3)若标本OD值 高于标准曲线上限，应当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
2.4.2大鼠血清IL-10的ELISA检测
1.准备工作：
(1)提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。(2)将浓缩 洗涤液用双蒸水稀释(1∶20)。(3)标准品：加入试剂稀释液0.5ml至冻干 标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为4000pg/ml)。 然后根据4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0pg/ml浓度进行稀释。 (4)生物素化抗体工作液：使用前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩生物素化 抗体(1∶100)配置成生物素化抗体工作液。(5)酶结合物工作液：使用 前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩酶结合物(1∶100)配置成酶结合物工作液， 室温避光放置。
2.洗涤方法：用自动洗板机，注入350μl洗涤液，注入与吸出间隔20-30 秒。洗板4次。
3.操作步骤：
(1)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条。(2)留空白孔。 (3)分别将标本或不同浓度标准品(0pg/ml孔加试剂稀释液)加入相应孔 中(100μl/孔)，用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟。(4)洗板5 次。(5)除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用封板胶 封住反应孔，37℃孵箱孵育60分钟。(6)洗板5次。(7)除空白孔外，加 入酶结合物工作液(100μl/孔)。用封板胶封住反应孔，37℃孵箱，避光孵 育30分钟。(8)洗板5次。(9)加入显色底物(包括空白孔)100μl/孔， 37℃孵箱，避光孵育15分钟。(10)加入终止液(包括空白孔)100μl/孔， 混匀后即刻测量OD450值(10分钟内)。
4.结果判断：同大鼠血清IL-1β的ELISA检测。
2.4.3ConA诱导的脾脏T细胞增殖能力测定：采用MH法。
无菌摘取大鼠脾脏(操作在冰浴中进行)，常规制备脾细胞悬液，计 数脾细胞，再用含10％小牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度至 5×106/mL，加至96板中，100μL/孔。分别加入含ConA完全RPMI1640溶 液100μL/孔(ConA终浓度为5μg/mL)，每组设5个复孔，并设无ConA 细胞对照。将96孔板置37℃，5％CO2培养箱孵育68h，取出，每孔弃上 清100μL，加入5mg/mL的MTT10μL(终浓度0.5mg/mL)，继续孵育4h， 加入0.01N HCl-10％SDS 100μL/孔，振荡摇匀，37℃过夜，酶标仪570nm 下测定各孔A值。
2.4.4LPS诱导的脾脏B淋巴细胞增殖能力的测定：采用MTT法。
无菌摘取大鼠脾脏(操作在冰浴中进行)，常规制备脾细胞悬液，计 数脾细胞，再用含10％小牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度至 5×106/mL，加至96板中，100μL/孔。分别加入含LPS完全RPMI1640溶 液100μL/孔(LPS终浓度为5μg/mL)，每组设5个复孔，并设无LPS细 胞对照。将96孔板置37℃，5％CO2培养箱孵育68h，取出，每孔弃上清 100μL，加入5mg/mL的MTT10μL(终浓度0.5mg/mL)，继续孵育4h， 加入0.01N HCl-10％SDS100μL/孔，振荡摇匀，37℃过夜，酶标仪570nm 下测定各孔A值。
2.4.5大鼠血清IFN-γ的ELISA检测
1.准备工作：
(1)提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。(2)将浓缩 洗涤液用双蒸水稀释(1∶20)。(3)标准品：加入试剂稀释液1.0ml至冻干 标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为2000pg/ml)。 然后根据2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/ml浓度进行稀释。 (4)生物素化抗体工作液：使用前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩生物素化 抗体(1∶100)配置成生物素化抗体工作液。(5)酶结合物工作液：使用 前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩酶结合物(1∶100)配置成酶结合物工作液， 室温避光放置。
2.洗涤方法：用自动洗板机，注入350μl洗涤液，注入与吸出间隔20-30 秒。洗板4次。
3.操作步骤：
(1)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条。(2)留空白孔。 (3)先按标准品稀释方法加好标准品(100μl/孔)，0pg/ml孔加试剂稀释 液(Assay Diluent)100μl；在每个样本孔中加入50μl试剂稀释液(Assay Diluent)和50μl样本(此时样本已做了1∶2倍稀释，计算结果时样本含量要 乘以2)；随后在样本和标准孔中加入50μl生物素化抗体工作液，用封板胶 纸封住反应孔。(4)室温(20-25℃)，使用微量振荡仪(最低频率，100rpm)， 孵育120分钟。(5)洗板5次。(6)除空白孔外，加入酶结合物工作液(100μl/ 孔)，用封板胶封住反应孔。(7)室温(20-25℃)，使用微量振荡仪(最 低频率，100rpm)，孵育60分钟。(8)洗板5次。(9)加入显色底物(包 括空白孔)100μl/孔，室温(22-25℃)，避光孵育10分钟。(10)加入终 止液(包括空白孔)100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(10分钟内)。
4.结果判断：同大鼠血清IL-1β的ELISA检测。
2.4.6大鼠血清IL-4的ELISA检测
1.准备工作：
(1)提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。(2)将浓缩 洗涤液用双蒸水稀释(1∶20)。(3)标准品：加入试剂稀释液1.0ml至冻干 标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为2000pg/ml)。 然后根据2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/ml浓度进行稀释。 (4)生物素化抗体工作液：使用前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩生物素化 抗体(1∶100)配置成生物素化抗体工作液。(5)酶结合物工作液：使用 前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩酶结合物(1∶100)配置成酶结合物工作液， 室温避光放置。
2.洗涤方法：用自动洗板机，注入350μl洗涤液，注入与吸出间隔20-30 秒。洗板4次。
3.操作步骤：
(1)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条。(2)留空白孔。 (3)分别将标本或不同浓度标准品(0pg/ml孔加试剂稀释液)加入相应孔 中(100μl/孔)，用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟。(4)洗板5 次。(5)除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用封板胶 封住反应孔，37℃孵箱孵育60分钟。(6)洗板5次。(7)除空白孔外，加 入酶结合物工作液(100μl/孔)。用封板胶封住反应孔，37℃孵箱，避光孵 育30分钟。(8)洗板5次。(9)加入显色底物(包括空白孔)100μl/孔， 37℃孵箱，避光孵育15分钟。(10)加入终止液(包括空白孔)100μl/孔， 混匀后即刻测量OD450值(10分钟内)。
4.结果判断：同大鼠血清IL-1β的ELISA检测。
2.4.7多肽阵列检测耐药蛋白抗体
1.根据铜绿假单胞菌耐药蛋白序列，选择超广谱内酰胺酶 (TEMs/ESBLs)TEM(ABB76656)，用多肽阵列技术制作了9张多肽阵列。 每种蛋白有3张重复多肽阵列每张TEM(ABB76656)蛋白多肽阵列上排列 93条多肽，配置0.3M Fmoc-氨基酸溶液，封闭液I：2％(v/v)aceticanhydride in DMF，封闭液II：2％(v/v)acetic anhydride+2％(v/v)DIPEAin DMF，去 保护溶液(20％(v/v)piperidine in DMF)。把活化的PEG-纤维素膜放置在 Autospotter上，根据程序自动移液30μl的Fmoc-氨基酸溶液到活化的PEG- 纤维素膜上的特定位置与膜进行反应2x20分钟，然后把PEG-纤维素膜按 序浸入封闭液I中(反应5分钟)和封闭液II中(反应20分钟)，进行侧 链封闭，然后用DMF清洗4次，每次30秒。然后加入去保护溶液中(2 次，每次5分钟)，用于移除氨基端的Fmoc保护基团；去保护之后，用 DMF清洗3次，每次30秒钟，而后再用乙醇干燥。如果用于下一次的氨 基酸合成，重复以上步骤，直至各个多肽全部合成。全部合成后，先用 TFAcocktail去除侧链保护基团，再用CH2Cl2清洗4次，而后用乙醇干燥， -20℃保存用于下一步免疫反应实验。根据实验设计，多肽自动合成仪合成 多肽阵列，每张多肽阵列横向为12个多肽点，纵向为8个多肽点。(见附 图1)
2.封闭：4％skim milk+5％sucrose in TBST buffer，室温4小时。
3.一抗孵育：大鼠血清1∶200稀释；与多肽阵列反应，4℃下过夜。
4.洗膜：用TBST buffer漂洗，10分钟×3次。
5.二抗孵育：二抗(羊抗鼠)IgG-HRP，用封闭液1∶1000或1∶2000 稀释，室温下2小时。
6.洗膜：用TBST buffer漂洗，10分钟×3次。
7.显色：加入ECL发光试剂，数字成像。
3统计学处理方法
采用SPSS 17.0统计软件包，参数计量资料进行t检验、方差分析，计 数资料使用χ2检验进行统计学处理。各计量资料用平均数±标准差来表示，检验水准为α＝0.05。
4结果
4.1不同剂量扶正透邪方治疗对腹腔感染大鼠死亡率保护的影响
腹腔注射菌液后，6h统计一次死亡率，其后每24h统计一次死亡率。 对照组5天内全部存活，模型组与扶正透邪方各剂量组大鼠在6h后开始出 现死亡，随着时间的延长，死亡率逐渐升高。6h后各时间点扶正透邪方各 剂量组大鼠的死亡率较模型组均有不同程度的降低。χ2检验显示，各剂量 组相应时间点组间比较，无显著差异(见表1)。
表1不同剂量扶正透邪方治疗对腹腔感染大鼠死亡率保护的影响
注：与相同时间点模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
4.2不同治疗方法对腹腔感染大鼠死亡率保护的影响
腹腔注射菌液后，6h统计一次死亡率，其后每24h统计一次死亡率。 各组大鼠在6h后开始出现死亡，随着时间的延长，死亡率逐渐升高。6h 后各时间点各治疗组大鼠的死亡率较模型组均有不同程度的降低。X2检验 显示，48h、72h、120h，中西医结合治疗组大鼠的死亡率较模型组降低， 差异显著(P＜0.05)，各治疗组间比较，无显著差异(见表2)。
表2不同治疗方法对腹腔感染大鼠死亡率保护的影响(n＝24)
注：与相同时间点模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
4.3不同治疗方法对腹腔感染大鼠血清IL-1β水平的影响
模型组和各治疗组大鼠血清IL-1β水平在感染后3h已经开始升高。各 治疗组大鼠血清IL-1β高峰较模型组延迟出现，72h后模型组大鼠血清IL-1β 维持在高于正常水平，而各治疗组大鼠大鼠血清IL-1β则接近正常水平。
模型组大鼠血清IL-1β水平在各时间点均较空白组明显升高，差异显 著；各治疗组大鼠血清IL-1β水平在3h、8h、24h较空白组明显升高，差 异显著；各治疗组大鼠血清IL-1β水平在72h、5d较空白组无显著差异； 西药对照组大鼠血清IL-1β水平在72h、5d较模型组降低，差异显著；扶 正透邪方组大鼠血清IL-1β水平在24h较模型组升高，在5d较模型组降低， 差异均显著；中西医结合组大鼠血清IL-1β水平在24h较模型组升高，在 72h、5d较模型组降低，差异均显著(见表3)。
表3各组大鼠各时间点血清IL-1β水平的变化(n＝8)
注：与模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01
与空白组相比较，△P＜0.05，△△P＜0.01
4.4不同治疗方法对腹腔感染大鼠淋巴细胞增殖水平的影响
感染后3h，模型组大鼠脾脏中T淋巴细胞增殖水平升高，较空白组差 异非常显著(P＜0.01)；西药对照组大鼠脾脏中T淋巴细胞增殖水平降低， 较空白组差异显著(P＜0.05)；扶正透邪方最佳剂量组和中西医结合治疗 组大鼠脾脏中T淋巴细胞增殖水平较空白组无显著差异。西药对照组、扶 正透邪方最佳剂量组和中西医结合治疗组大鼠脾脏中T淋巴细胞增殖水平 均较模型组降低，差异非常显著(P＜0.01)(见表4)。
表4感染后3h各组大鼠T淋巴细胞增殖的变化(n＝6)
注：与模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01
与空白组相比较，△P＜0.05，△△P＜0.01
感染后3h，模型组大鼠脾脏中B淋巴细胞增殖水平升高，较空白组差 异显著(P＜0.05)；西药对照组大鼠脾脏中B淋巴细胞增殖水平降低，较 空白组差异非常显著(P＜0.01)；扶正透邪方最佳剂量组和中西医结合治 疗组大鼠脾脏中B淋巴细胞增殖水平较空白组无显著差异。西药对照组和 中西医结合治疗组大鼠脾脏中B淋巴细胞增殖水平均较模型组降低，差异 非常显著(P＜0.01)；扶正透邪方最佳剂量组大鼠脾脏中B淋巴细胞增殖 水平均较模型组降低，差异显著(P＜0.05)(见表5)。
表5感染后3h各组大鼠B淋巴细胞增殖的变化(n＝6)
注：与模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01
与空白组相比较，△P＜0.05，△△P＜0.01
4.5不同治疗方法对腹腔感染大鼠血清Th1/Th2水平的影响
模型组和各治疗组大鼠血清Th1/Th2水平在感染后3h开始出现升高， 8h达到高峰，随后开始下降，72h后模型组大鼠血清Th1/Th2维持在高于 正常水平，而各治疗组大鼠血清Th1/Th2则接近正常水平。
模型组大鼠血清Th1/Th2水平在8h、24h、72h、5d较空白组升高，差 异均显著；西药对照组大鼠血清Th1/Th2水平在8h、24h较空白组升高， 差异均显著；扶正透邪方组和中西医结合组大鼠血清Th1/Th2水平在8h较 空白组升高，差异均显著；西药对照组和中西医结合组大鼠血清Th1/Th2 水平在72h、5d较模型组下降，差异均显著；扶正透邪方组大鼠血清Th1/Th2 水平在24h、72h、5d较模型组下降，差异均显著；另外，扶正透邪方大鼠 血清Th1/Th2水平在24h较西药对照组下降，差异显著(P＝0.040)；中西 医结合组大鼠血清Th1/Th2水平在5d较西药对照组和扶正透邪方组下降， 差异均显著(P＝0.003，P＝0.005)(见表6)。
表6各组大鼠各时间点血清Th1/Th2水平的变化(n＝8)
注：与模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01
与空白组相比较，△P＜0.05，△△P＜0.01
4.6扶正透邪方治疗后腹腔感染大鼠血清对TEM-1蛋白的影响
从TEM-1耐药蛋白的多肽阵列与大鼠血清的反应谱来看，发现三个组 别中，抗体针对的阳性表位数目没有存在明显的差异。但是，扶正透邪方 组别中，针对19-21和52-55表位的抗体反应强于感染组和阴性对照组， 中药治疗有可能增加了淋巴细胞对这些抗原表位的免疫反应。
4.7腹腔感染大鼠器官组织形态学变化及扶正透邪方治疗的影响
腹腔感染8h，模型组多数大鼠均出现肺及小肠不同程度的病理性损伤， 肺泡间隔内毛细血管扩张充血，肺泡腔内有较多浆液渗出及少量红细胞、 中性粒细胞和巨噬细胞；肠粘膜充血、水肿及炎细胞浸润明显，腺体部分 消失。扶正透邪方治疗组与模型组相比，肺泡间隔内毛细血管轻度扩张充 血，炎细胞浸润较轻；肠粘膜轻度充血、水肿，炎细胞浸润较轻，腺体无 明显消失。
腹腔感染24h，模型组大鼠均出现肺及小肠的病理性损伤，诸改变基 本特征与8h相似，肺及小肠损伤的范围无明显扩大。扶正透邪方组诸项改 变基本特征较8h轻度加重，但未见肺及小肠损伤范围进一步扩大。
腹腔感染72h，模型组部分大鼠肺泡壁毛细血管扩张充血，肺泡腔内 可见红细胞，并有一定数量的中性粒细胞和少量巨噬细胞；肠粘膜损伤特 征与8h相似，但范围进一步扩大。扶正透邪方组诸项改变基本特征与较 24h有所减轻，与8h相似。
腹腔感染5d，模型组部分大鼠肺泡壁毛细血管进一步扩张充血，肺泡 腔内可见连接呈网状的纤维素和红细胞，并有一定数量的中性粒细胞和少 量巨噬细胞；肠粘膜进一步充血、水肿，腺体排列紊乱，偶见纤维素。扶 正透邪方诸项改变基本特征较8h进一步减轻。
附图说明
附图1：多肽阵列模式示意图(示意图对多肽芯片上每个多肽点进行 了位置编号标注，每个编号对应附件给出的多肽序列。以下所有多肽阵列 实验结果分析中的表位数字与上述标注数字及多肽序列编号一一对应。)
附图2药物对腹腔感染大鼠血清对TEM-1蛋白影响图片(a为TEM-1 与空白组大鼠血清反应；b为TEM-1与模型组大鼠血清反应c为TEM-1 与扶正透邪方组大鼠血清反应)
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
具体实施方式
实施例1：水煎剂
生黄芪 85g 当归 15g
金银花 25g 青蒿 20g
虎杖 10g
取上述原料药，加水煎煮2次，加水量为常规用量，合并水提取液， 制成水煎剂。
实施例2：片剂
生黄芪 50g 当归 18g
金银花 24g 青蒿 15g
虎杖 6g
取上述原料药，加入乙醇常温下浸渍24小时，合并提取液回收乙醇， 浓缩干燥，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂。
实施例3：胶囊剂
生黄芪 110g 当归 8g
金银花 15g 青蒿 28g
虎杖 18g
取上述原料药，加入乙醇至药材量的10倍进行渗漉，回收乙醇，浓缩 干燥，加入常规辅料，按照常规工艺，制成胶囊剂。
实施例4：口服液体制剂
生黄芪 40g 当归 20g
金银花 22g 青蒿 12g
虎杖 8g
取上述原料药，按照常规工艺，制成口服液体制剂。
实施例5：注射剂
生黄芪 100g 当归 10g
金银花 12g 青蒿 25g
虎杖 15g
取上述原料药，加入水提取3次，每次1个小时，合并滤液，浓缩干 燥，加入常规辅料，按照常规工艺，制成注射剂。
实施例6：颗粒剂
生黄芪 90g 当归 15g
金银花 15g 青蒿 25g
虎杖 15g
取上述原料药，加入水提取3次，每次1个小时，合并滤液，浓缩干燥， 加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。