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1、10申请公布号CN104117062A43申请公布日20141029CN104117062A21申请号201310146065222申请日20130424A61K39/40200601A61K9/12200601A61K9/08200601A61P1/02200601A61P31/0420060171申请人杭州雅盛生物科技有限公司地址310007浙江省杭州市西湖区文三路388号钱江科技大厦903室72发明人毕爱国李同森刘诚74专利代理机构北京联瑞联丰知识产权代理事务所普通合伙11411代理人曾少丽54发明名称抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法57摘要本发明涉及一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备。
2、方法，包括抗原制备；注射；获取免疫蛋；抗体的提取纯化将蛋壳消毒，打蛋分离出蛋黄；然后稀释蛋黄并过滤，得滤液；絮凝澄清；超滤浓缩将过滤后的滤液进行超滤浓缩，得超滤浓缩液；调节所述超滤浓缩液至中性，测蛋白总量，加入蛋白保护剂；冷冻干燥加入蛋白保护剂的物质进行冷冻干燥，即得。本发明中提取纯化工艺运用非剪切工艺，根据IGY蛋白特性采用了絮凝剂、蛋白保护剂、蛋白稳定剂组合技术，使得在一系列处理中，蛋白几无变性，保持蛋白活性，提高了IGY对于相应抗原的效价；制备方法简捷精炼，能耗低安全性好，综合成本低，适合于工业化批量生产。51INTCL权利要求书3页说明书9页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12。
3、发明专利申请权利要求书3页说明书9页附图1页10申请公布号CN104117062ACN104117062A1/3页21一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法，包括（1）抗原制备用伴放线放线菌、牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌作为抗原菌的制备，超声破壁处理达到疫苗制剂浓度，制备弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂；（2）注射用上述疫苗对产蛋家禽进行注射；（3）获取免疫蛋检取所述家禽所生的免疫蛋；（4）抗体的提取纯化将蛋壳消毒，打蛋分离出蛋黄；然后稀释蛋黄并过滤，得滤液；（5）絮凝澄清在上述滤液中加入浓度为25的蛋白稳定剂；再加入一种絮凝剂；沉降2030H，虹吸上清液纱布过滤；其中每加一次絮凝剂，都要呈细流在搅。
4、拌下缓缓加入；（6）超滤浓缩将步骤（5）过滤后的滤液进行超滤浓缩，得超滤浓缩液；调节所述超滤浓缩液至中性，测蛋白总量，超滤浓缩液保存加入蛋白稳定剂，在（2030）保存；（7）冷冻干燥将步骤（6）浓缩液加入蛋白保护剂，冷冻干燥或喷雾干燥即得IGY粉状制品。2根据权利要求1所述的一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法，其特征在于，所述蛋白稳定剂为甘油、吐温20、PLRONIC188和羧甲基纤维素的混合物。3根据权利要求1或2所述的一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法，其特征在于，所述蛋白保护剂为海藻糖26WT、甘油0102WT、吐温8012WT、PVPK3012WT和PLRONIC1880203。
5、WT。4根据权利要求3所述的一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法，其特征在于，所述注射具体如下取25周令即将产蛋母鸡注射1ML疫苗；首免用弗氏完全佐剂，注射后7天，第二次免疫用弗氏不完全佐剂，第14天进行第三次注射。5根据权利要求3所述的一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法，其特征在于，所述抗体的提取纯化具体步骤包括方法一；水稀释HAC调PH值法将蛋黄搅碎匀化，按蛋黄量加入9倍纯化水，配成110的稀释液；调PH，按稀释液总量的0773加入1MOL/L的HAC,调节稀释液PH为5052；配好的稀释液加盖封好后，于20冰箱中使完全结冻，在46下解冻，过滤，得澄清透明滤液；方法二HACNAAC缓。
6、冲液稀释法试PH值，按蛋黄的9倍无菌纯水用水，加入01MOL/L的无水醋酸钠（AR）溶解搅匀，倒入蛋黄充分搅匀，用纱布虑除卵黄膜，在搅拌下用1MOL/LHAC调节PH至518524，记录HAC用量；批量稀释，取卵黄量的9倍无菌纯水，剩余水中按蛋黄10倍量重量，加入试调PH值时比例的1MOL/LHACNAAC，充分溶解搅匀，并在搅拌下将稀释的卵黄液缓缓倒入搅匀；测PH值518524；加盖密封阴凉处沉降1224H。6根据权利要求3所述的一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中的絮凝剂料的添加如下权利要求书CN104117062A2/3页3先加入浓度为12的壳聚糖至终浓度。
7、为006007加入浓度为12的海藻酸钠至终浓度为004006；再加入浓度为810的氯化钙至终浓度为002006；最后加入浓度为810三聚磷酸钠至终浓度为004006。7根据权利要求6所述的一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）卵黄抗体冻干粉水分含量为50。8根据权利要求6所述的一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中得到的抗牙周病抗原复合IGY作为活性成分用于制成口腔喷雾剂型或口腔漱口类剂型。9根据权利要求8所述的一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法，其特征在于，所述口腔喷雾剂型或口腔漱口类剂型的配方包括10根据权利要求8所述的一种抗牙。
8、周病致病菌复合IGY的制备方法，其特征在于，所述口腔护理液的配方包括权利要求书CN104117062A3/3页4权利要求书CN104117062A1/9页5抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法技术领域0001本发明涉及生物工程领域，特别是指一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法。背景技术0002牙周病是一种常见的和多发性口腔疾病，临床主要表现为牙龈炎和牙周炎两大类，牙周炎、牙龈炎成人儿童患病率在75以上，公认的主要致病微生物牙龈卟啉单胞菌（PG，）、伴放线放线菌（AA）、福赛氏杆菌（TF）、牙垢密螺旋体（TD）、中间普氏杆菌（PI）这些微生物分泌酶，引发牙周支持组织的炎性破坏使牙龈液化、牙床萎缩。
9、、致牙齿松动脱落，也能引起心血管相关疾病，比龋齿危害更大，由于不是致命性疾病人们也忽视早期的预防和治疗，流行病学调查显示牙周炎是成年人丧失牙齿的首位原因，后期治疗成本较大加重医疗负担。在现有的临床药物中无选择性针对牙周病致病菌的预防和治疗牙周病的药物，一般抗生素治疗易产生抗药性问题，治疗效果存在不理想和病情反复复发的状况。目前尚无见运用卵黄抗体的治疗和预防牙周炎的临床案例。抗牙周病致病菌复合IGY制备是根据抗原决定簇原理对病原体进行优化选择和组合，制备免疫抗原，注射产蛋母鸡，免疫应答后可不断在卵黄中产生相应的多克隆IGY抗体，一只鸡卵黄含IGY约100MG以上，产蛋时间一般可达7个月以上。使低。
10、成本大产量的工业化生产成为可能。卵黄IGY抗体其特点蛋白量MW180000道尔顿；抗体活性高，50NG/ML仍有特异性活性；具有类似于单抗的均一性；625、30分钟仍有活性；PH40110时稳定。IGY抗体取自禽类鸡蛋卵黄与哺乳动物和人类亲缘关系想差距大，禽类IGY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应，不激活哺乳动物的补体系统，首先表现为对其抗原的特异性生物活性稳定，其长效性、安全性好，与抗原结合性强，活性高。抗体的应用只针对致病菌，能避免长期使用抗生素产生的抗药性问题，避免各种口腔消毒剂的副作用和刺激，因此，较好地维持口腔微生态平衡，应用复合抗牙周病IGY，于儿童和成人牙周病预防，。
11、特别对儿童和老年人口腔健康具有良好的社会意义。0003目前IGY抗体制备方法存在的缺陷一般都是培养细菌，用各种方法灭活细菌，再制备疫苗免疫母鸡，母鸡免疫应答弱，卵黄中IGY的对应抗原的效价水平低；在IGY提取过程中离心澄清分离液体，离心机产生的离心切力形成对蛋白的剪切和破坏降低了IGY抗体的效价和得率；由IGY普通工艺提取过程的直接冻干或喷干处理不可避免地降低了IGY抗体活性，普通工业化生产中形成的IGY原料属性，限制了IGY抗体应用途径和范围。发明内容0004本发明提出一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法，解决了现有技术中在制备IGY抗体的过程中活性低、活性保持期短的问题。0005本发明的。
12、技术方案是这样实现的0006一种抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法，包括0007（1）抗原制备说明书CN104117062A2/9页60008用伴放线放线菌（AA）、牙龈卟啉单胞菌（PG，）、变形链球菌SMUTANS血清C型作为抗原菌扩菌，浓缩，按一定菌浓制备菌液，不采用一般灭活抗原菌的处理方法制备弗氏完全佐剂和/或弗氏不完全佐剂制成疫苗；0009（2）注射用上述疫苗对产蛋家禽进行注射；0010（3）获取免疫蛋检取所述家禽所生的免疫蛋；0011（4）抗体的提取纯化0012将蛋壳消毒，打蛋分离出蛋黄；然后稀释蛋黄并过滤，得滤液；0013（5）絮凝澄清0014在上述滤液中加入浓度为25的蛋白稳定剂。
13、；再加入一种絮凝剂；沉降2030H，虹吸上清液纱布过滤；其中每加一次絮凝剂，都要呈细流在搅拌下缓缓加入；0015（6）超滤浓缩0016将步骤（5）过滤后的滤液进行超滤浓缩，得超滤浓缩液；调节所述超滤浓缩液至中性，测蛋白总量。超滤浓缩液保存方法加入蛋白稳定剂，在（2030）保存；此步骤制得IGY液状制品可直接用作原料，如用于液体、膏体应用产品；0017（7）冷冻干燥0018将步骤（6）浓缩液加入蛋白保护剂，冷冻干燥或喷雾干燥即得IGY粉状制品。0019作为优选的技术方案，所述蛋白稳定剂为甘油、吐温20、PLRONIC188和羧甲基纤维素的混合物。0020作为优选的技术方案，所述蛋白保护剂为海藻糖。
14、适量、甘油0102WT、吐温8012WT、PVPK3012WT和PLRONIC1880203WT。0021作为优选的技术方案，所述注射具体如下取25周令即将产蛋母鸡注射1ML疫苗；首免用弗氏完全佐剂，注射后7天，第二次免疫用弗氏不完全佐剂，第14天进行第三次注射。0022作为优选的技术方案，所述抗体的提取纯化具体步骤包括0023方法一；水稀释HAC调PH值法将蛋黄搅碎匀化，按蛋黄量加入9倍纯化水，配成110的稀释液；调PH，按稀释液总量的0773加入1MOL/L的HAC,调节稀释液PH为5052；配好的稀释液加盖封好后，于20冰箱中使完全结冻，在46下解冻，过滤，得澄清透明滤液；0024方法二。
15、HACNAAC缓冲液稀释法0025试PH值，按蛋黄的9倍无菌纯水用水，加入01MOL/L的无水醋酸钠（AR）溶解搅匀，倒入蛋黄充分搅匀，用纱布虑除卵黄膜，在搅拌下用1MOL/LHAC调节PH至518524，记录HAC用量，以便准确定量HACNAAC缓冲液PH52加入量；0026批量稀释，取卵黄量的9倍无菌纯水，剩余水中按蛋黄10倍量重量，加入试调PH值时比例的1MOL/LHACNAAC，充分溶解搅匀，并在搅拌下将稀释的卵黄液缓缓倒入搅匀；测PH值518524；加盖密封阴凉处沉降1224H。0027作为优选的技术方案，所述步骤（5）中的絮凝剂料的添加如下0028先加入浓度为12的壳聚糖至终浓度为。
16、0060070029加入浓度为12的海藻酸钠至终浓度为004006；0030再加入浓度为810的氯化钙至终浓度为002006；说明书CN104117062A3/9页70031最后加入浓度为810三聚磷酸钠至终浓度为004006。0032作为优选的技术方案，所述步骤（7）卵黄抗体冻干粉水分含量为50。0033本发明制备的卵黄抗体的效价检测，用酶标免疫吸附试验，测得抗牙周病病菌复合IGY对应抗原的的效价分别为0034对牙龈卟啉单胞菌（PG，）抗原11280000035对伴放线放线菌（AA）抗原11280000036对变形链球菌抗原12560000037电泳试验，采用SDSPAGE法测得抗牙周病病菌。
17、复合IGY含量4060，蛋白值9098。0038应用方面复合抗牙周病致病菌IGY作为活性成分制成口腔喷雾剂和漱口类剂型，在产品配方中应用保护剂、稳定剂完善了组方使其具有良好的分散度不会产生蛋白凝聚活性降低；组方充分考虑到目前IGY类制剂蛋白活性保持期不长的问题，为此而设计的组方及工艺的选择使本制剂保持其对抗原的特异性生物活性具有可靠的稳定性，其长效性和稳定性表现在常温下24年对应抗原的效价不低于11280000039基本组方，可在此基础上衍生其他需求配方00400041本发明中提取纯化工艺运用非剪切工艺，根据IGY蛋白特性采用了絮凝剂、蛋白保护剂、蛋白稳定剂组合技术，使得在一系列处理中，蛋白几。
18、无变性，保持蛋白活性，提高了IGY对于相应抗原的效价；制备方法简捷精炼，能耗低安全性好，综合成本低，适合于工业化批量生产。0042本发明中加了蛋白保护剂，蛋白稳定剂，使得喷干工艺和冷冻干燥工艺IGY抗体无损伤，蛋白几无变性，保持了较高的活性效价；在以IGY抗体为原料的剂型应用方面，一说明书CN104117062A4/9页8般IGY抗体制剂保质68个月活性效价只有132以下，在溶液制剂中添加了稳定剂、保护剂、特种油水界面排斥剂提高了IGY抗体在载体中的的稳定性，23年制剂效价还保持1128至1256。0043本发明的抗牙周病致病菌复合IGY的制备方法，有良好的产业链组合，工艺流程对环境友好，耗能。
19、少综合成本低。适用于工业化批量生产。其制成品安全性好，可作为液体剂型、粉制剂型、膏类和凝胶类制品的抗体原料。附图说明0044为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。0045图1IGY电泳图；0046图中0047A标准BSA0048B抗牙周病致病菌复合IGY加辅料浓缩液冻干粉0049C抗牙周病致病菌复合IGY冻融浓缩液冻干粉0050D抗牙周病致病菌复合IGY加辅料浓缩喷干粉0。
20、051E鸡蛋清溶菌酶。具体实施方式0052下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。0053抗牙周病致病菌复合IGY提供了一种安全有效防治牙周病方法，已知牙龈卟啉单胞菌（PG，）、伴放线放线菌（AA）、福赛氏杆菌（TF）、牙垢密螺旋体（TD）、中间普氏杆菌（PI）是牙周病的主要致病菌，一般抗原制备采取抗原菌灭活的处理方法，这使免疫应答不强，提取的卵黄IGY效价不高。本方法采用免灭活制备抗原給鸡注射，根据动。
21、物种属人与禽类血缘关系较远，鸡场鸡群不会产生应激反应和鸡群的群体死亡，能提高鸡的免疫应答，提高产蛋中IGY抗体的效价。0054在IGY抗体提取上运用非离心法澄清，减少了离心机对抗体的剪切和破坏，因此提取后效价很高；在IGY抗体提取后加了蛋白保护剂，蛋白稳定剂，使得冻干后IGY抗体无损伤，蛋白几无变性，保持了较高的活性效价，提高了IGY抗体收得率。0055活性保护技术本技术制备的抗牙周病致病菌复合IGY剂型具有较好的高效性，稳定性和长效性，本设计液态剂型在溶液中添加了，稳定剂，保护剂，分散剂，克服了一般IGY液态制剂活性保持时间短，蛋白凝聚和附壁现象，增强IGY抗体的活性保持、提高了IGY抗体的。
22、稳定性，一般IGY抗体在制剂中保质2年至4年其效价还有1128至1256（不加上述辅料效价仅18116）说明书CN104117062A5/9页90056实施例100571抗原制备0058牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线菌、变形链球菌分别液体培养基厌氧增菌培养48H，集菌，使菌浓2109CFU/ML一20，加完全弗氏佐剂（CFA）与抗原菌液11乳化（首免），以后用不完全弗氏佐剂（IFA）乳化。00592注射0060首次免疫用完全弗氏佐剂CFA,以后的加强免疫用不完全弗氏佐剂IFA。免疫200只海兰褐产蛋鸡，疫苗总量200ML。疫苗配好后每只鸡按1ML分4点肌肉注射。0061首次免疫后过7天行第二次免疫。
23、，二免后再过7天行3免。第4次免疫，在2月后效价低于要求时再注射。00623获取免疫蛋0063在第一次免疫后第21天开始捡蛋，并检测效价。免疫蛋收集后，4贮存。4抗体的提取纯化0064方法一水稀释HAC调PH值法打蛋分离蛋黄，将蛋黄搅碎匀化，按蛋黄量加入9倍纯水，配成110的稀释液；调PH，加入1MOL/L的HAC,调节稀释液PH为5052。配好的稀释液加盖封好后，于20冰箱中使完全结冻，在46下解冻，可使分层完全容易过滤。得澄清透明滤液。0065方法二HACNAAC缓冲液稀释法0066将蛋黄搅碎匀化，用12倍无菌纯水兑入搅匀备用。0067加入01MOL/L的醋酸无水醋酸钠（AR）溶解搅匀，倒。
24、入蛋黄液充分搅匀，用纱布虑除卵黄膜，在搅拌下用1MOL/LHAC调节PH至518524。4度下沉降过夜。0068过滤，虹吸上清液过滤。00695絮凝澄清（精制）0070在上述过滤液中先加入006007的壳聚糖（CTS）充分搅匀，再加入004海藻酸钠SA，继之加入002的氯化钙，最后加入004的三聚磷酸钠TPP，每加一次辅料，都要呈细流在搅拌下缓缓加入，具体见权利部分。0071（6）超滤浓缩0072设备用密理博（MILLIPORE）公司超滤系统，BIOMAX改良聚砜复合膜堆（截留分子量100KDA）超滤浓缩使浓缩至原体积约1/20时，用4氢氧化钠调节其PH值至中性（PH70左右）；加入蛋白稳定剂。
25、甘油2，吐温2005，PLRONIC18805，羧甲基纤维素004G/ML充分混匀，20存。0073浓缩液干燥前处理0074超滤浓缩液加蛋白保护剂配制0075例如，浓缩液2000G（蒸干法测总蛋白为571），加入0076说明书CN104117062A6/9页100077（7）冷冻干燥0078按一般冻干工艺方法进行冷冻干燥，使冻干粉水分含量5左右。0079样品超滤浓缩液；加辅料浓缩液。性状比较008000810082ELISA检测以及蛋白电泳检测0083ELISA检测00841抗原破壁。00852抗原包被用包被液按14比例稀释菌液加到96孔板里，用保鲜膜密封后，4过夜。00863加封闭液（现配现。
26、用）00875待测样品鸡卵黄IGY的制备（等比稀释）00886加样加入待测的稀释标本到包被好的酶标板说明书CN104117062A107/9页1100897加二抗加已配制好的酶标二抗工作液用保鲜膜密封，置37水浴放置40MIN。00908加底物溶液（现配现用，观察颜色）加已配制好的底物溶液（现配现用），用保鲜膜密封，立即置于37水浴放置15MIN，00919加终止液（终止反应）加入硫酸终止液终止反应009210紫外检测仪测光密度009311试验结果观察与分析0094SDSPAGE检测009515GEL009600970098参见图1。0099实施例20100用实施例1制备的抗牙周病复合IGY作。
27、为主要原料制成一种喷雾剂。0101制成1000ML0102配方0103说明书CN104117062A118/9页120104配制方法01051、称取PVPK30、木糖醇溶于800ML蒸馏水中，加入抗牙周病复合IGY搅拌均匀待用01062、乙醇中加薄荷脑、薄荷香精搅拌溶解再加甘油、吐温80混合均匀，在搅拌下徐徐将此液加入上述液中搅匀。01073、过滤加纯化水至配制量。调PH85密封备用。01084、，灌装设备清洗消毒，无菌操作，灌装封口制成每瓶20ML的喷雾剂，50瓶批号打码套入外包装。0109实施例30110用实施例1所制备的抗牙周病复合IGY作为主要原料制成一种口腔护理液。制成4000ML0111配方0112说明书CN104117062A129/9页130113配制方法0114制法1、称取PVPK30、木糖醇溶于3800ML蒸馏水中，加入抗牙周病菌复合IGY搅拌均匀待用。01152、乙醇中加薄荷脑、搅拌溶解再加甘油、吐温80、薄荷香精、茉莉花香精混合均匀，在搅拌下徐徐将此液加入1液中搅匀。01163、过滤加纯化水至配制量。调PH85密封备用。01174、灌装设备清洗消毒，无菌操作，灌装封口制成每瓶200ML的喷雾剂，20瓶批号打码，装入包装箱。说明书CN104117062A131/1页14图1说明书附图CN104117062A14。