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1、10申请公布号CN104119251A43申请公布日20141029CN104119251A21申请号201310145064622申请日20130424C07C303/06200601C07C309/23200601A61K31/19200601A61P29/00200601A61P31/1620060171申请人江西青峰药业有限公司地址341000江西省赣州市章贡区沙河工业园站东大道8号72发明人杨小玲谢宁吕武清刘地发程帆刘尧奇汤新乾刘鹏王章伟欧阳婷54发明名称9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐、制备方法及其制备药物用途57摘要本发明公开了一种9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐，及。
2、其制备方法，以及其具有解热、抗炎、抗病毒的用途，采用本发明制备方法制成的9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐，完全可以不改变穿心莲内酷的化学属性，并且本发明9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐，具有水溶性好、热稳定性高、溶血作用小等特点，最大限度地保证了穿心莲内酯纯天然药物的药理活性作用，而且医学和药学研究人员无法在不做相关实验的前提下，预先得知9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐具有上述的良好用途。51INTCL权利要求书2页说明书18页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书18页附图3页10申请公布号CN104119251ACN104119251。
3、A1/2页21一种通式（）所表示的化合物或其盐，其化学名为9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐；R1、R2可以为氢、钠、钾或NH4。2权利要求1的化合物或其盐的制备方法，包括以下步骤在反应釜中加入溶剂，加入穿心莲内酯使其溶解，在搅拌的情况下采用缓缓滴加磺化剂进行磺化反应，调节反应液温度在1038，磺化反应0525小时；磺化反应后得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸反应物与未反应物的混合物；加入95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，混合均匀；混合物用碱溶液调PH值至58，经大孔吸附树脂、ODS或SEPHADEXLH20柱层析分离，以水乙醇或甲醇为洗脱液，梯度洗脱，收集洗脱液组分，结晶，。
4、得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐。3权利要求2的制备方法，在反应釜中加入的所述溶剂为醋酐或冰醋酸的一种或两种，1G穿心莲内酯用2G10G所述溶剂溶解，优选的，1G穿心莲内酯用3G5G所述溶剂溶解。4权利要求2或3的制备方法，所述溶剂为醋酐和冰醋酸，所述醋酐、冰醋酸由下列重量配比制成的醋酐8020、冰醋酸2080，优选的，其中醋酐667、冰醋酸333。5权利要求2的制备方法，所述磺化剂采用浓硫酸和冰醋酸，1G穿心莲内酯用1G8G浓硫酸冰醋酸进行磺化，所述浓硫酸和冰醋酸由下列重量配比制成的浓硫酸8020、冰醋酸2080，优选的，1G穿心莲内酯用15G4G浓硫酸冰醋酸，其中浓流酸375、冰醋。
5、酸625。6权利要求2的制备方法，所述碱溶液采用550的氢氧化钠或氢氧化钾或25以下的氨水溶液。7权利要求25任一项的制备方法，其中所述的磺化剂采用缓缓滴加、喷雾的方式加入，滴加时控制反应液温度在625，所述的磺化反应时间控制在052小时。8权利要求2的制备方法，其中所述梯度洗脱中，水的比例为9010，乙醇或甲醇的比例为1090。9一种9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐的制剂，该制剂为权利要求1权利要求书CN104119251A2/2页3所述的9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐与药学上可以接受的载体制成。10权利要求1所述的9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐用于制备解热的药物的用途。
6、。11如权利要求10的用途，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐对内毒素致热的解热作用。12如权利要求10的用途，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐对干酵母致热的解热作用。13权利要求1所述的9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐用于制备抗炎的药物的用途。14如权利要求13的用途，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐对败血症的药物作用。15如权利要求13的用途，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的的抗炎作用。16如权利要求13的用途，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的抗炎作用。17权利要求1所述的9去氢穿心莲。
7、内酯17磺酸16羧酸或其盐用于制备抗病毒的药物的用途。18如权利要求17的用途，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐用于抑制神经氨酸酶。19如权利要求17的用途，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐用于抑制流感病毒。20如权利要求17的用途，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐用于抑制流感病毒FM1。权利要求书CN104119251A1/18页49去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐、制备方法及其制备药物用途技术领域0001本发明涉及一种9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐、制备方法及其制备药物用途。背景技术0002穿心莲为爵床科植物穿心莲ANDROGRAPHISPANIC。
8、ULATA（BURMF）NEES的干燥地上部分，化学成分和药理实验表明，穿心莲的活性成分是以穿心莲内酯为代表的二萜类化合物为主国家中医药管理局中华本草第7册上海上海科学技术出版社，1999439，穿心莲内酯的结构为分子式C20H30O5，为无色方型方型结晶，MP230232，020126（C02，H2O）。味极苦，可溶于甲醇、乙醇、丙醇、吡啶，微溶于氯仿、乙醚，难溶于水及石油醚。因此，口服制剂通常制片剂、胶囊剂、滴丸、软胶囊；因穿心莲内酯不溶于水，给制备液体制剂带来了困难，目前，已有多种方法被用来转化穿心莲内酯成各种衍生物，以改善穿心莲内酯的水溶性。一般提取穿心莲内酯后制备成各种水溶性衍生物的。
9、注射液，如与亚硫酸钠加硫酸或与亚硫酸氢钠发生加成反应，制得的水溶性磺酸盐，亚硫酸氢钠穿心莲内酯（莲必治注射液），琥珀酸半酯单钾盐，穿心莲内酯经酯化、脱水、成盐精制而成14脱羟11,12二脱氢穿心莲内酯3,19二琥珀酸半酯钾钠盐（炎琥宁注射液）或14脱羟11,12二脱氢穿心莲内酯3,19二琥珀酸半酯单钾盐，但上述盐在水中溶解度、稳定性不是特别好。0003发明内容0004本发明的一个目的在于提供一种通式（）所表示的化合物或其盐，其化学名为9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐，说明书CN104119251A2/18页5R1、R2可以为H、钠、钾或NH4。0005本发明的另一个目的在于提供一种通式（。
10、）的化合物或其盐的制备方法，包括以下步骤在反应釜中加入溶剂，加入穿心莲内酯使其溶解，在搅拌的情况下采用缓缓滴加磺化剂进行磺化反应，调节反应釜温度在35385，磺化反应05275小时；磺化反应后得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸反应物与未反应物的混合物；加入95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，混合均匀；混合物用碱溶液调PH值至58，经大孔吸附树脂、ODS或SEPHADEXLH20柱层析分离，以水乙醇或甲醇为洗脱液，梯度洗脱，收集洗脱液组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐。0006优选的，在反应釜中加入的所述溶剂为醋酐或冰醋酸的一种或两种，1G穿心莲内酯用2G10G所述。
11、溶剂溶解，优选的，1G穿心莲内酯用3G5G所述溶剂溶解。0007优选的，所述溶剂为醋酐和冰醋酸，所述醋酐、冰醋酸由下列重量配比制成的醋酐8020、冰醋酸2080，优选的，其中醋酐667、冰醋酸333。0008优选的，所述磺化剂采用浓硫酸和冰醋酸，1G穿心莲内酯用1G8G浓硫酸冰醋酸进行磺化，所述浓硫酸和冰醋酸由下列重量配比制成的浓硫酸8020、冰醋酸2080，优选的，1G穿心莲内酯用15G4G浓硫酸冰醋酸，其中浓流酸375、冰醋酸625。0009优选的，所述碱溶液采用550的氢氧化钠或氢氧化钾或25以下的氨水溶液。0010优选的，其中所述的磺化剂采用缓缓滴加、喷雾的方式加入，滴加时控制反应液温。
12、度在625，所述的磺化反应时间控制在052小时。0011优选的，其中所述梯度洗脱中，水的比例为9010，乙醇或甲醇的比例为1090。0012本发明的另一个目的在于提供一种9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐的制剂，该制剂为9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐与药学上可以接受的载体制成。0013本发明的另一个目的在于提供了9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐用于制备解热的药物的用途。0014优选的，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐对内毒素致热的解说明书CN104119251A3/18页6热作用。0015优选的，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐对干酵母致热的解热作用。00。
13、16本发明的另一个目的在于提供了9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐用于制备抗炎的药物的用途。0017优选的，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐对败血症的药物作用。0018优选的，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的的抗炎作用。0019优选的，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的抗炎作用。0020本发明的另一个目的在于提供了9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐用于制备抗病毒的药物的用途。0021优选的，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐用于抑制神经氨酸酶。0022优选的，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其。
14、盐用于抑制流感病毒。0023优选的，所述9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐用于抑制流感病毒FM1。0024本发明提供的9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐，在水中溶解度非常好、并且稳定性非常高，非常适合实际应用，可以应用于各种常用形式，如片剂、胶囊、软胶囊、分散片、口服液、颗粒、咀嚼片、口崩片、滴丸、缓释片、控释片、缓释胶囊、控释胶囊。当然也可以制成液体制剂如糖浆剂、注射液等，特别是制成注射剂克服了口服药物生物利用低的缺陷。0025另一方面，本发明所提供的9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐的制备方法简单方便、条件温和、生产率高，可以方便地制备出9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐。。
15、0026更为重要的是，本发明通过成千上百次创造性的劳动，最终确定了适宜的溶剂，以及具有创造性的磺化剂及其磺化反应的重要工艺参数，例如磺化剂的加工方式及加入速度、及其反应温度之间的复杂关系的确定，以及适宜的数值范围的确定等，从而才最终获得了所需的反应物。在此基础上，再进一步采用具有创造性的纯化技术进行纯化，从而本发明提供了可以在多种不同条件下制备形成本发明的9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐。0027本发明与现有技术对比表明采用本发明制备方法形成的9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐，完全可以不改变穿心莲内酯原有的化学属性；并且本发明所采用的9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸或其盐与现有技术。
16、相比具有水溶性好、热稳定性高、溶血作用小等特点。最大限度地保证了穿心莲内酯纯天然药物的药理活性作用。0028经过实验数据对比可知，给内毒素1H后，空白对照组健康兔体温均值上升了，并持续上升3H后逐渐开始下降。与空白对照组比较，低剂量组50MGKG19去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠12H表现出明显抑制兔温升高作用，中剂量组100MGKG1，高剂量组200MGKG19去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠12H内表现出极强抑说明书CN104119251A4/18页7制兔体温升高作用，4H时还显示出抑制兔体温升高作用；3个药物实验组中以100MGKG1剂量以上退热作用最好。表明50200MGKG19。
17、去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对内毒素导致的兔体温升高均有降温作用，取得了预料不到的技术效果。0029经过实验数据对比可知，给予干酵母1H时使空白对照组健康大鼠体温持续上升第6H。与空白对照组比较，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠100，200MGKG1在14H内表现出明显抑制大鼠体温升高作用，取得了预料不到的技术效果。0030经过实验数据对比可知，穿心莲内酯和9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠都可以显著改善LPS诱导的败血症小鼠的存活率，时间、剂量依赖性降低败血症小鼠血清中TNF，IL1，ALT，AST的含量，病抑制肝脏组织中炎症因子MRNA水平的升高。而且9去氢穿心莲内酯17磺酸。
18、16羧酸二钠起效较穿心莲内酯快，效果更好。实验结果显示穿心莲内酯改造成9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠后，其水溶性更好，给药起效快，对小鼠败血症的改善作用也得到增强，取得了预料不到的技术效果。0031经过实验数据对比可知，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠各用药组、地塞米松组小鼠耳廓肿胀度明显小于对照组，取得了预料不到的技术效果。0032经过实验数据对比可知，与对照组比，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠各剂量组与地塞米松组均对角叉菜胶所致大鼠脚肿胀有明显抑制作用，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠在200MG/KG时于给药30MIN即出现明显抑制作用并持续5小时，100MG/KG作。
19、用与地塞米松作用相当，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠三个剂量组之间在相同时间点对肿胀的抑制作用有一定量效关系，取得了预料不到的技术效果。0033经过实验数据对比可知，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠能够提取出有效的抑制神经氨酸酶成分；并且9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠随着使用剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨酸酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关。9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠能够通过抑制流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖，从而减少了流感病毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症，。
20、取得了预料不到的技术效果。0034经过实验数据对比可知，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对流感病毒有显著的抑制作用。9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠的IC50低，TI高。9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠抑制FM1流感病毒致细胞病变的作用均随着药物剂量的增加而增强。对药物剂量和药物对CPE的抑制率进行的相关性分析表明，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠的剂量与药物对CPE抑制率之间呈明显的正相关。0035医学和药学研究人员无法预先在不做相关实验的前提下，预先得知9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠具有上述的良好用途。0036附图说明0037图19去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠核。
21、磁共振氢谱图。说明书CN104119251A5/18页80038图29去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠核磁共振碳谱图。0039图39去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠质谱图。0040图49去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠HPLC图。0041具体实施方式0042实施例1取穿心莲内脂，加入3倍量醋酐6667与冰醋酸3333混合溶液使溶解，在搅拌下，缓缓滴加穿心莲内脂16倍量的硫酸（375）与冰醋酸（625）混合溶液磺化，并保持反应液温度在1820，放置60分钟使磺化（1620），加入7倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，用50NAOH调PH为70，加入95乙醇使含醇量达8。
22、5以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠，其钠盐分子式C20H30O9SNA2，分子量492。0043反应式例9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠理化性质及波谱数据9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠分子式为C20H30O9SNA2，白色粉末，易容易水，甲醇，ESIMSM/Z493M，515MNA，469MNA，447M2NA，1H600MHZ,D2O和13CNMR150MHZ,D2O数据1H600M。
23、HZ,D2O171M,1H,H1，124D,J125HZ,1H,H1，171M,2H,H2，336DD,J104,59HZ,1H,H3，124D,J125HZ,1H,H5，171M,1H,H6，140DD,J124,59HZ,1H,H6，203M,1H,H7，233DD,J177,56HZ,1H,H7，321DD,J178,81HZ,1H,H11，274DD,J178,48HZ,H11，628DD,J80,49HZ,1H,H12,457DD,J74,49HZ,1H,H14，362DD,J116,76HZ,1H,H15，349DD,J116,48HZ,1H,H15，356D,J142HZ,1H,。
24、H17，326D,J142HZ,1H,H17，106S,3H,H18，396D,J116HZ,1H,H19，341D,J说明书CN104119251A6/18页9116HZ,1H,H19，106S,3H,H20。004413CNMR150MHZ,D2O3420C1，2663C2，7957C3，4241C4，5080C5，1870C6，3193C7，12401C8，14502C9，3884C10，2595C11，14105C12，13349C13，6997C14，6512C15，17532C16，5498C17，2166C18，6352C19，1985C20。0045实施例2取穿心莲内脂，加入3。
25、2倍量醋酐6667与冰醋酸3333混合溶液使溶解，在搅拌下，缓缓滴加穿心莲内脂15倍量的硫酸（375）与冰醋酸（625）混合溶液磺化，并保持反应液温度在1618，放置50分钟使磺化（1820），加入8倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，用30NAOH调PH为65，加入95乙醇使含醇量达85以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠实施例3取穿心莲内脂，加入28倍量醋酐65与冰醋酸35。
26、混合溶液使溶解，在搅拌下，缓缓滴加穿心莲内脂19倍量的硫酸（36）与冰醋酸（64）混合溶液磺化，并保持反应液温度在2023，放置30分钟使磺化（2023），加入8倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，用40NAOH调PH为60，加入95乙醇使含醇量达85以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠。0046实施例4取穿心莲内脂，加入32倍量醋酐67与冰醋酸33混合溶液使溶解，在搅拌下，缓。
27、缓滴加穿心莲内脂15倍量的硫酸（38）与冰醋酸（62）混合溶液磺化，并保持反应液温度在2225，放置40分钟使磺化（2225），加入7倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，用35NAOH调PH为72，加入95乙醇使含醇量达85以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠。0047实施例5取穿心莲内脂，加入3倍量醋酐6667与冰醋酸3333混合溶液使溶解，在搅拌下，缓缓滴加穿心莲内脂16倍。
28、量的硫酸（375）与冰醋酸（625）混合溶液磺化，并保持反应液温度在1820，放置60分钟使磺化（1620），加入7倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，用30KOH调PH为70，加入95乙醇使含醇量达85以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钾。0048实施例6取穿心莲内脂，加入33倍量醋酐65与冰醋酸35混合溶液使溶解，在搅拌下，说明书CN104119251A7/18页10缓缓滴。
29、加穿心莲内脂17倍量的硫酸（39）与冰醋酸（61）混合溶液磺化，并保持反应液温度在2426，放置100分钟使磺化（1620），加入7倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，用40KOH调PH为60，加入95乙醇使含醇量达85以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钾。0049实施例7取穿心莲内脂，加入28倍量醋酐65与冰醋酸35混合溶液使溶解，在搅拌下，缓缓滴加穿心莲内脂2倍量的硫酸（3。
30、5）与冰醋酸（65）混合溶液磺化，并保持反应液温度在1518，放置120分钟使磺化（1518），加入7倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，用35KOH调PH为72，加入95乙醇使含醇量达85以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钾。0050实施例8取穿心莲内脂，加入35倍量醋酐68与冰醋酸32混合溶液使溶解，在搅拌下，缓缓滴加穿心莲内脂18倍量的硫酸（35）与冰醋酸（65）混合溶液。
31、磺化，并保持反应液温度在1922，放置50分钟使磺化（1922），加入75倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，用45KOH调PH为65，加入95乙醇使含醇量达85以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钾。0051实施例9取穿心莲内脂，加入3倍量醋酐6667与冰醋酸3333混合溶液使溶解，在搅拌下，缓缓滴加穿心莲内脂16倍量的硫酸（375）与冰醋酸（625）混合溶液磺化，并保持反应液。
32、温度在1820，放置60分钟使磺化（1620），加入7倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，用18NH4OH调PH为70，加入95乙醇使含醇量达85以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二铵。0052实施例10取穿心莲内脂，加入32倍量醋酐64与冰醋酸36混合溶液使溶解，在搅拌下，缓缓滴加穿心莲内脂19倍量的硫酸（36）与冰醋酸（64）混合溶液磺化，并保持反应液温度在1517，放置12。
33、0分钟使磺化（1417），加入8倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，用21NH4OH调PH为65，加入95乙醇使含醇量达85以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二铵。0053实施例11说明书CN104119251A108/18页11取穿心莲内脂，加入29倍量醋酐67与冰醋酸33混合溶液使溶解，在搅拌下，缓缓滴加穿心莲内脂18倍量的硫酸（37）与冰醋酸（63）混合溶液磺化，并保持反应。
34、液温度在1922，放置80分钟使磺化（1922），加入8倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，用23NH4OH调PH为67，加入95乙醇使含醇量达85以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二铵。0054实施例12取穿心莲内脂，加入35倍量醋酐66与冰醋酸34混合溶液使溶解，在搅拌下，缓缓滴加穿心莲内脂2倍量的硫酸（35）与冰醋酸（65）混合溶液磺化，并保持反应液温度在2225，放置40。
35、分钟使磺化（2225），加入8倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，用33NAOH调PH为65，加入95乙醇使含醇量达85以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠。0055实施例13取穿心莲内脂，加入32倍量醋酐66与冰醋酸34混合溶液使溶解，在搅拌下，缓缓滴加穿心莲内脂2倍量的硫酸（35）与冰醋酸（65）混合溶液磺化，并保持反应液温度在2123，放置40分钟使磺化（2123），加入。
36、8倍量95乙醇，搅匀，减压浓缩成稠膏，加入等量纯化水，搅匀，加入95乙醇使含醇量达85以上，静置12H，减压回收乙醇，水浴至几乎无醇味，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水乙醇梯度洗脱，水的比例为9010，乙醇的比例为1090，分段收集洗脱液，HPLC测定，合并相同组分，结晶，得9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸。0056以下实验用9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠均取实施例1制备方法所获得的样品。0057实验数据19去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠HPLC方法1仪器WATERS2695高效液相色谱仪2色谱条件检测波长210NM柱温30流速10ML/MIN色谱柱ULTIMATEXBC18。
37、46250MM,5M流动相以乙腈为流动相A，以02磷酸缓冲盐溶液（每1000ML中加入磷酸二氢钾34G）为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱说明书CN104119251A119/18页123供试品溶液制备取实施例1制备方法所获得的样品适量，加水制成每1ML含9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠01MG的溶液，摇匀，虑过，即得。0058测定精密吸取供试品溶液50L注入高效液相色谱仪中分析，见图4。0059实验数据29去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对内毒素致热的影响取日本大耳白兔,体重1823KG，雌雄兼有，实验前1D，选取体温在380394之间，当日体温变化不超过04的家兔作为实验用兔。实。
38、验当日，取上述合格兔，测定造模前基础体温，自家兔耳静脉注射细菌内毒素生理盐水溶液，剂量为1ML/KG10EU/ML，观察家兔体温变化，每30MIN记录1次。选取注射1H后体温上升超05的家兔，随机分成5组，每组9只。分别耳静脉注射给予09氯化钠溶液，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠低剂量组50MGKG1，中剂量组100MGKG1，高剂量组200MGKG1及注射用精氨酸阿司匹林100MGKG1，分别于给药后1，2，3，4，5，6H测定各兔体温。以给药前体温均值为基数，计算各测定时间兔温变化值。见表2。0060由表2可知，给内毒素1H后，空白对照组健康兔体温均值上升了，并持续上升3H后逐渐开始。
39、下降。与空白对照组比较，低剂量组50MGKG19去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠12H表现出明显抑制兔温升高作用，中剂量组100MGKG1，高剂量组200MGKG19去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠12H内表现出极强抑制兔体温升高作用，4H时还显示出抑制兔体温升高作用；3个药物实验组中以100MGKG1剂量以上退热作用最好。表明50200MGKG19去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对内毒素导致的兔体温升高均有降温作用。0061说明书CN104119251A1210/18页13实验数据39去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对干酵母所致大鼠发热的影响实验用大鼠预先测体温3D，实验当日测定值为。
40、大鼠基础体温，筛选体温变化不超过03的动物，随机分成5组，每组10只。皮下注射20干酵母混悬液5ML/KG，致热后腹腔注射09氯化钠溶液，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠低剂量组50MGKG1，中剂量组100MGKG1，高剂量组200MGKG1及阿司匹林100MGKG1，测量给药后16H的大鼠体温，每小时1次，以不同时间点体温值与基础值的差值作为观察指标，结果见表3。0062表3看出，给予干酵母使空白对照组健康大鼠体温持续上升第6H。与空白对照组比较，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠100，200MGKG1在14H内表现出明显抑制大鼠体温升高作用。0063实验数据49去氢穿心莲内酯17。
41、磺酸16羧酸二钠对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响取小鼠50只，随机分成5组。每日给9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠低剂量组50MGKG1，中剂量组100MGKG1，高剂量组200MGKG12次，连续3天，地塞米松磷酸钠注射液仅在致炎前给药。末次给药后1H，每只小鼠左耳廓内外侧滴涂01ML二甲苯致炎，右耳作为对照。致炎后2小时脱颈锥处死小鼠，并沿耳廓基线剪下鼠两耳，用直径6MM打孔器分别于左、右耳相同部分打下耳片，置电子天平上称重并记录数据。以左右耳片重量差值表示肿胀度。说明书CN104119251A1311/18页140064表4显示，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠各用药组、地塞米松组。
42、小鼠耳廓肿胀度明显小于对照组。0065实验数据59去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响取大鼠45只，随机分为5组。每日给9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠低剂量组50MGKG1，中剂量组100MGKG1，高剂量组200MGKG12次，连续3天，地塞米松磷酸钠注射液仅在致炎前给药。末次给药后，每只大鼠灌胃给予生理盐水8ML，30分钟后于大鼠足爪中部皮下注射015ML1角叉菜胶溶液，并于注入后30MIN、1H、2H、3H、4H、5H用千分尺测定其左后足爪厚度作为大鼠足肿胀程度指标。0066表5结果显示，与对照组比，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠各剂量组与地塞米松。
43、组均对角叉菜胶所致大鼠脚肿胀有明显抑制作用，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠在200MG/KG时于给药30MIN即出现明显抑制作用并持续5小时，100MG/KG作用与地塞米松作用相当，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠三个剂量组之间在相同时间点对肿胀的抑制作用有一定量效关系。0067实验数据69去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对神经氨酸酶活性的抑制作用取9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠，加适量水使溶解，应用神经氨酸酶抑制剂鉴定试剂盒测定9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠抑制神经氨酸酶（N1）的效价见表6。0068标准曲线准备A在96孔荧光酶标板内每孔加入70L神经氨酸酶检测缓冲液。
44、；B每孔再分别加入0、1、2、5、75、10LH5N1神经氨酸酶；C每孔再加入020LMILLIQ水。0069样品检测的准备A在96孔荧光酶标板内每孔加入70L神经氨酸酶检测缓冲液；B每孔再加入10LH5N1神经氨酸酶；C每孔再加入010L9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠样品；D每孔再加入010LMILLIQ水。0070检测步骤A振动混匀约1MIN；B37孵育2MIN使抑制剂和H5N1神经氨酸酶充分相互作用，做标准曲线的样品也一起孵育；说明书CN104119251A1412/18页15C每孔加入10L神经氨酸酶荧光底物；D再振动混匀约1MIN；E37孵育2030MIN后进行荧光测定。激发波。
45、长为360NM，发射波长为440NM。0071根据标准曲线计算出样品对于H5N1神经氨酸酶的抑制百分比，以及做浓度曲线后计算出9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对于H5N1神经氨酸酶的IC50。9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠达到对神经氨酸酶的抑制率IC50为024G/L。见表6。0072根据上述实验结果可以清楚地看到9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠能够提取出有效的抑制神经氨酸酶成分；9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠随着使用剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨酸酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关；由上述实验可见，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠能够通过抑。
46、制流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖，从而减少了流感病毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症。0073医学和药学研究人员无法预先在不做抑制流感病毒感染、复制，或抑制神经氨酸酶的实验的前提下，预先得知9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠具有预防和治疗流感病毒性感冒的良好效果。0074实验数据79去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对流感病毒感染鸡胚的抑制作用取9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1H1N1鉴定9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠抑制FM1流感病毒在鸡胚中复制和抑制的能力。007。
47、5将FM1流感病毒液接种于10D龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚02ML，37孵育72H，观察并计算半数鸡胚感染量EID50。00769去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对鸡胚的毒性作用采用无菌生理盐水对9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠作系列稀释后接种于10D龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚02ML，每个浓度接种6胚，37孵育，观察鸡胚生长发育情说明书CN104119251A1513/18页16况，以鸡胚可存活96H的最大浓度作为药物的TD0。00779去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠在鸡胚中对流感病毒的抑制作用采用01ML的流感病毒液和不同稀释度的9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠混。
48、合，37作用2H，接种于10D龄无特定病原体鸡胚尿囊腔，每组接种6胚，37孵育72H。病毒攻击量为50EID50，同时设病毒对照、无菌生理盐水正常对照，计算9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对病毒抑制作用的半数有效剂量ED50。0078FM1流感病毒对鸡胚的毒力经REEDMUENCH法计算，其EID50为10468。9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠接种于鸡胚后，其生长发育与正常对照组基本一致。96H鸡胚均存活。鸡胚给予9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠原液未见鸡胚死亡，所以可认为TD0为214G/L。00799去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠在鸡胚中对流感病毒的抑制作用见表7。008。
49、0由表7可知，9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠在006048G/L对流感病毒有显著的抑制作用P005，ED50为00924G00047G/L，TI为6096212。0081实验数据89去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对FM1流感病毒影响取9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1H1N1鉴定9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠抑制FM1流感病毒毒力的能力。0082FM1对狗肾传代细胞（MDCK）的毒力测定采用细胞半数感染量TCID50微量法。00839去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠对MDCK细胞的毒性测定采用无血清的DMEM对9去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠作系列稀释后接种于已形说明书CN104119251A1614/18页17成单层的MDCK细胞孔中，每孔100L，每个稀释度重复4个孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37、5CO2培养箱内培养，每日观察细胞病变CPE，连续观察3D，以“”记录结果，按REEDMUENCH法计算药物半数中毒浓度TD50和最大无毒浓度TD0。00849去氢穿心莲内酯17磺酸16羧酸二钠抑制FM1流感病。