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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611134891.5 (22)申请日 2016.12.11 (71)申请人 钦州学院 地址 535011 广西壮族自治区钦州市钦南 区滨海新城滨海大道12号 (72)发明人 方怀义 (74)专利代理机构 北京同辉知识产权代理事务 所(普通合伙) 11357 代理人 魏忠晖 (51)Int.Cl. A61K 39/106(2006.01) A61K 39/02(2006.01) A61K 39/39(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (54)发明名称。
2、 一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗 及其制备方法， 由以下质量份数配方成分组成： 甘氨酸5-8份、 复合维生素5-15份、 天门冬氨酸7- 9份、 鳗弧菌13-15份、 大菱鲆弧菌8-10份、 溶藻弧 菌2-4份、 黄芪多糖佐剂2-4份、 药用淀粉12-13 份、 创伤弧菌4-6份、 迟缓爱德华氏菌菌液4-5份、 麦芽糊精10-20份、 哈维氏弧菌1-3份、 防霉剂 0.5-0.7份， 本发明具有多重的免疫效果， 一次接 种后可以有效预防鲆鲽鱼类五种细菌性病原菌 的感染， 为海水鱼类多联灭活疫苗的研发提供了 依据。 权利要求书1页 说明书。
3、3页 CN 106581670 A 2017.04.26 CN 106581670 A 1.一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗， 其特征在于： 由以下质量份数配方成分组成： 甘氨酸5-8份、 复合维生素5-15份、 天门冬氨酸7-9份、 鳗弧菌13-15份、 大菱鲆弧菌8-10 份、 溶藻弧菌2-4份、 黄芪多糖佐剂2-4份、 药用淀粉12-13份、 创伤弧菌4-6份、 迟缓爱德华氏 菌菌液4-5份、 麦芽糊精10-20份、 哈维氏弧菌1-3份、 防霉剂0.5-0.7份。 2.根据权利要求1所述的一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗， 其特征在于： 由以下质量份数配 方成分组成： 甘氨酸5份、 复合维生素5份、 天。
4、门冬氨酸7份、 鳗弧菌13份、 大菱鲆弧菌8份、 溶藻弧菌2 份、 黄芪多糖佐剂2份、 药用淀粉12份、 创伤弧菌4份、 迟缓爱德华氏菌菌液4份、 麦芽糊精10 份、 哈维氏弧菌1份、 防霉剂0.5份。 3.根据权利要求1所述的一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗， 其特征在于： 由以下质量份数配 方成分组成： 甘氨酸7份、 复合维生素10份、 天门冬氨酸8份、 鳗弧菌14份、 大菱鲆弧菌9份、 溶藻弧菌3 份、 黄芪多糖佐剂3份、 药用淀粉12.5份、 创伤弧菌5份、 迟缓爱德华氏菌菌液4.5份、 麦芽糊 精15份、 哈维氏弧菌2份、 防霉剂0.6份。 4.根据权利要求1所述的一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗，。
5、 其特征在于： 由以下质量份数配 方成分组成： 甘氨酸8份、 复合维生素15份、 天门冬氨酸9份、 鳗弧菌15份、 大菱鲆弧菌10份、 溶藻弧菌 4份、 黄芪多糖佐剂4份、 药用淀粉13份、 创伤弧菌6份、 迟缓爱德华氏菌菌液5份、 麦芽糊精20 份、 哈维氏弧菌3份、 防霉剂0.7份。 5.一种根据权利要求1所述的一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗的制备方法， 其特征在于： 包 括如下步骤： 步骤一、 将上述菌种类原料种到胰蛋白胨大头肉汤培养基平板上， 27-30培养2-5天 进行复苏； 步骤二、 分别挑取上述病原菌到培养基中， 28振荡培养24h， 收集培养液在4条件下 5000rpm离心5分钟， 。
6、将离心后的沉积菌体用pH7.2的PBS缓冲液冲洗3遍后， 用灭菌后的 1.5(重量比)的NaCl溶液分别制成1091010cfu/mL的菌悬液原液； 步骤三、 病原菌的菌悬液原液分别灭活后， 1 1 1 1 1等体积混合， 即为鲆鲽鱼类五联 灭活疫苗原液； 步骤四、 将上述步骤得到的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液与剩余原料混合， 振荡均匀得 到含黄芪多糖的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106581670 A 2 一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及海水鱼疫苗领域， 具体而言涉及一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗及其制备 方法。 背景技术 00。
7、02 中国水产科学研究院黄海水产研究所已对我国的养殖鲆鲽类进行了全面、 系统的 疾病流行病学研究， 发现了鲆鲽类20余种典型的疾病症状， 并对它们的病原进行了细致、 深 入的研究。 研究发现鲆鲽类的大多数疾病是由细菌性病原引起的， 而鳗弧菌、 大菱鲆弧菌、 哈维氏弧菌、 溶藻胶弧菌、 迟钝爱德华氏菌是鲆鲽类养殖过程中最为常见的五种病原菌， 可 以造成烂鳍、 腹水、 肠炎、 红体、 肌肉脓肿等多种明显的表观症状。 因为细菌性疾病是我国养 殖鲆鲽类的主要疾病， 广大鲆鲽类养殖者在国内没有商业化的鲆鲽类疫苗可用的情况下， 主要依赖抗生素和化学类药物来防御疾病。 而长期使用抗生素， 不仅容易使病原菌产。
8、生耐 药性， 增加后续预防疾病的困难， 而且其药残问题也关联到养成商品鱼的食品质量安全。 因 此， 开发鲆鲽类养殖专用疫苗迫在眉睫。 通过注射疫苗来预防病原感染， 是具有特异性免疫 系统的动物行之有效的无公害疾病防治技术。 这一技术方法在海水养殖鱼类中同样适用。 在本发明作出之前， 国内外有N.Castro等(Development of an effective Edwardsiella tarda vaccine for cultured turbot S cophthalmus maximus.Fish&Shellfish Immunology， Volume 25， Issue 3， 。
9、September 2008)对大菱鲆的爱德华菌疫苗， 曹宏梅等对 鳗弧菌和溶藻弧菌二联疫苗对大菱鲆的免疫效果(中国水产科学， 2006年13卷第3期)， 朱开 玲等对大菱鲆的鳗弧菌灭活疫苗等方面展开了研究(高级技术通讯， 2004年第2期)。 他们的 研究主要集中在用1种或2种大菱鲆的细菌病原制备疫苗， 而且没有使用黄芪多糖作为疫苗 佐剂， 与本发明相比， 无论在疫苗组成还是疫苗功能上都存在明显的不同。 发明内容 0003 本发明提供了一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗及其制备方法， 本发明具有多重的免疫 效果， 一次接种后可以有效预防鲆鲽鱼类五种细菌性病原菌的感染， 为海水鱼类多联灭活 疫苗的研发提。
10、供了依据。 0004 为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 0005 一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗及其制备方法， 由以下质量份数配方成分组成： 甘氨 酸5-8份、 复合维生素5-15份、 天门冬氨酸7-9份、 鳗弧菌13-15份、 大菱鲆弧菌8-10份、 溶藻 弧菌2-4份、 黄芪多糖佐剂2-4份、 药用淀粉12-13份、 创伤弧菌4-6份、 迟缓爱德华氏菌菌液 4-5份、 麦芽糊精10-20份、 哈维氏弧菌1-3份、 防霉剂0.5-0.7份。 0006 进一步： 由以下质量份数配方成分组成： 甘氨酸5份、 复合维生素5份、 天门冬氨酸7 份、 鳗弧菌13份、 大菱鲆弧菌8份、 溶藻弧菌2份。
11、、 黄芪多糖佐剂2份、 药用淀粉12份、 创伤弧菌 4份、 迟缓爱德华氏菌菌液4份、 麦芽糊精10份、 哈维氏弧菌1份、 防霉剂0.5份。 0007 进一步： 由以下质量份数配方成分组成： 甘氨酸7份、 复合维生素10份、 天门冬氨酸 说 明 书 1/3 页 3 CN 106581670 A 3 8份、 鳗弧菌14份、 大菱鲆弧菌9份、 溶藻弧菌3份、 黄芪多糖佐剂3份、 药用淀粉12.5份、 创伤 弧菌5份、 迟缓爱德华氏菌菌液4.5份、 麦芽糊精15份、 哈维氏弧菌2份、 防霉剂0.6份。 0008 进一步： 由以下质量份数配方成分组成： 甘氨酸8份、 复合维生素15份、 天门冬氨酸 9份。
12、、 鳗弧菌15份、 大菱鲆弧菌10份、 溶藻弧菌4份、 黄芪多糖佐剂4份、 药用淀粉13份、 创伤弧 菌6份、 迟缓爱德华氏菌菌液5份、 麦芽糊精20份、 哈维氏弧菌3份、 防霉剂0.7份。 0009 进一步： 本发明制备方法具有如下步骤： 0010 步骤一、 将上述菌种类原料种到胰蛋白胨大头肉汤培养基平板上， 27-30培养2- 5天进行复苏； 0011 步骤二、 分别挑取上述病原菌到培养基中， 28振荡培养24h， 收集培养液在4条 件下5000rpm离心5分钟， 将离心后的沉积菌体用pH7.2的PBS缓冲液冲洗3遍后， 用灭菌后 的1.5(重量比)的NaCl溶液分别制成1091010cf。
13、u/mL的菌悬液原液； 0012 步骤三、 病原菌的菌悬液原液分别灭活后， 1 1 1 1 1等体积混合， 即为鲆鲽鱼类 五联灭活疫苗原液； 0013 步骤四、 将上述步骤得到的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液与剩余原料混合， 振荡均 匀得到含黄芪多糖的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗。 0014 本发明的有益效果是： 本发明具有多重的免疫效果， 一次接种后可以有效预防鲆 鲽鱼类五种细菌性病原菌的感染， 为海水鱼类多联灭活疫苗的研发提供了依据。 具体实施方式 0015 下面将结合本发明实施例， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。
14、。 基于本发明中的 实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都 属于本发明保护的范围。 0016 实施例一： 0017 一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗由以下质量份数配方成分组成： 甘氨酸5-8份、 复合维 生素5-15份、 天门冬氨酸7-9份、 鳗弧菌13-15份、 大菱鲆弧菌8-10份、 溶藻弧菌2-4份、 黄芪 多糖佐剂2-4份、 药用淀粉12-13份、 创伤弧菌4-6份、 迟缓爱德华氏菌菌液4-5份、 麦芽糊精 10-20份、 哈维氏弧菌1-3份、 防霉剂0.5-0.7份。 0018 实施例二： 0019 一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗由以下质量份数配方成分组。
15、成： 甘氨酸5份、 复合维生 素5份、 天门冬氨酸7份、 鳗弧菌13份、 大菱鲆弧菌8份、 溶藻弧菌2份、 黄芪多糖佐剂2份、 药用 淀粉12份、 创伤弧菌4份、 迟缓爱德华氏菌菌液4份、 麦芽糊精10份、 哈维氏弧菌1份、 防霉剂 0.5份。 0020 实施例三： 0021 一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗由以下质量份数配方成分组成： 甘氨酸7份、 复合维生 素10份、 天门冬氨酸8份、 鳗弧菌14份、 大菱鲆弧菌9份、 溶藻弧菌3份、 黄芪多糖佐剂3份、 药 用淀粉12.5份、 创伤弧菌5份、 迟缓爱德华氏菌菌液4.5份、 麦芽糊精15份、 哈维氏弧菌2份、 防霉剂0.6份。 0022 实施例四：。
16、 说 明 书 2/3 页 4 CN 106581670 A 4 0023 一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗由以下质量份数配方成分组成： 甘氨酸8份、 复合维生 素15份、 天门冬氨酸9份、 鳗弧菌15份、 大菱鲆弧菌10份、 溶藻弧菌4份、 黄芪多糖佐剂4份、 药 用淀粉13份、 创伤弧菌6份、 迟缓爱德华氏菌菌液5份、 麦芽糊精20份、 哈维氏弧菌3份、 防霉 剂0.7份。 0024 实施例五： 0025 一种鲆鲽鱼类五联灭活疫苗的制备方法制备方法包括如下步骤： 0026 步骤一、 将上述菌种类原料种到胰蛋白胨大头肉汤培养基平板上， 27-30培养2- 5天进行复苏； 0027 步骤二、 分别挑取上。
17、述病原菌到培养基中， 28振荡培养24h， 收集培养液在4条 件下5000rpm离心5分钟， 将离心后的沉积菌体用pH7.2的PBS缓冲液冲洗3遍后， 用灭菌后 的1.5(重量比)的NaCl溶液分别制成1091010cfu/mL的菌悬液原液； 0028 步骤三、 病原菌的菌悬液原液分别灭活后， 1 1 1 1 1等体积混合， 即为鲆鲽鱼类 五联灭活疫苗原液； 0029 步骤四、 将上述步骤得到的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗原液与剩余原料混合， 振荡均 匀得到含黄芪多糖的鲆鲽鱼类五联灭活疫苗。 0030 此外， 应当理解， 虽然本说明书按照实施方式加以描述， 但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案， 说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见， 本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体， 各实施例中的技术方案也可以经适当组合， 形成本领域技术人员 可以理解的其他实施方式。 说 明 书 3/3 页 5 CN 106581670 A 5 。