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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811039478.X (22)申请日 2018.09.06 (71)申请人 河南师范大学 地址 453007 河南省新乡市牧野区建设东 路46号 (72)发明人 李明军 李成龙 李瑞雪 蒲腾飞 张晓丽 李俊华 赵喜亭 (74)专利代理机构 新乡市平原智汇知识产权代 理事务所(普通合伙) 41139 代理人 路宽 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织 培养扩繁方法 (57)摘要 本发明公开了一种。
2、利用间歇浸没生物反应 器进行怀山药组织培养扩繁方法， 属于药用植物 组织培养技术领域， 该方法以怀山药试管苗为材 料， 通过配制培养基、 灭菌、 转接、 设置间歇浸没 生物反应器的培养参数等系列步骤， 从而快速并 大量获得优质怀山药组培苗。 与传统液体培养相 比， 本发明方法具有培养周期短， 繁殖系数高， 组 培苗成活率高等特点， 并且可以减少组织培养过 程的劳动量， 为植物组织培养快速繁殖怀山药提 供了一种低成本且高效率的方法。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 108849531 A 2018.11.23 CN 108849531 A 1.利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养。
3、扩繁方法， 其特征在于具体过程为： （1） 按照配方基本培养液MS+激素NAA 0.1-0.5mg/mL+激素KT 0.5-1.5mg/mL+蔗糖30g/ L， 调整pH值5.8-6.2配制培养液， 将配制的培养液高温高压湿热灭菌后备用， 再将间歇浸没 生物反应器包扎， 高温高压湿热灭菌后备用； （2） 在无菌环境中， 将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中， 再将怀山 药带腋芽或带节点茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中， 其中怀山药茎段的接种密度为 20-60个/L； （3） 设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率3-15min/6-12h， 培养时间为35-90d， 设定培养环境。
4、条件为光照强度1500-1800lux， 光照12h/d， 温度251。 2.根据权利要求1所述的利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养扩繁方法， 其 特征在于： 所述间歇浸没生物反应器中怀山药的接种密度为30-50个/L。 3.根据权利要求1所述的利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养扩繁方法， 其 特征在于： 所述间歇浸没生物反应器的设定参数为浸没频率5-10min/6-10h。 4.根据权利要求1所述的利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养扩繁方法， 其 特征在于具体步骤为： （1） 按照配方基本培养液MS+激素NAA 0.5mg/mL+激素KT 1.0mg/mL+蔗糖30g/L，。
5、 调整pH 值5.8配制培养液， 将配制的培养液高温高压湿热灭菌后备用， 再将间歇浸没生物反应器包 扎， 高温高压湿热灭菌后备用； （2） 在无菌环境中， 将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中， 再将怀山 药带腋芽或带节点茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中， 其中怀山药茎段的接种密度为 40个/L； （3） 设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率5min/6h， 培养时间为60d， 设定培养环 境条件为光照强度1500-1800lux， 光照12h/d， 温度251， 最终怀山药培养增殖系数为 6.4， 将组培苗移栽后， 植株的成活率达到90%以上且植株生长健康。 权 利 要 求 。
6、书 1/1 页 2 CN 108849531 A 2 利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养扩繁方法 技术领域 0001 本发明属于药用植物组织培养技术领域， 具体涉及一种利用间歇浸没生物反应器 进行怀山药组织培养扩繁方法。 背景技术 0002 山药 （Dioscorea opposita） 为薯蓣科薯蓣属的多年生草本植物， 在国内外均有分 布。 本发明所使用的材料为怀山药， 主产于河南省焦作市温县、 武陟、 沁阳、 博爱、 修武一带， 是著名的四大怀药之一， 有健脾益胃、 滋肾益精、 益肺止咳、 降低血糖等功效。 怀山药具有极 高的药用价值和营养价值， 且应用广泛， 广销于世界各地。 在长。
7、期进行营养繁殖的过程中， 出现了病毒感染、 产量下降、 种质退化等现象。 0003 应用植物组织脱毒快繁方法可以在一定程度上解决长期营养繁殖过程中出现的 问题， 有关怀山药脱毒快繁技术的研究国内已有报道。 但是， 应用传统植物组织培养方法生 产怀山药种苗， 耗费大量的人力、 物力， 且其生产成本一直居高不下， 不利于怀山药种苗广 泛应用与工厂化生产。 0004 利用间歇浸没生物反应器成功进行其它植物培养的研究已有报道。 如公开号为 CN101720668A的专利公开了一种利用间歇浸没式间歇浸没培养系统进行甘蔗组织培养快 繁的方法， 其利用间歇浸没培养反应器对三个品种的甘蔗培养进行了介绍； 公开。
8、号为 CN103120126A的专利公开了一种利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快繁的方 法。 而怀山药与这两种植物均相差较大， 生理、 生化方面也大不相同， 相应的培养方法以及 培养条件也均有较大差异， 故以上专利文献中提及的步骤以及其中涉及到的具体的培养方 式和培养条件完全不能用于利用间歇浸没生物反应器培育怀山药。 且关于利用间歇浸没培 养怀山药的报道目前在国内外还未见相关报道。 0005 利用间歇浸没生物反应器进行怀山药种苗的生产可以弥补传统方法生产的缺陷， 为低成本的生产高质量的怀山药种苗提供了有效的方法。 鉴于利用间歇浸没式培养方法进 行怀山药种苗的生产未见报道和公开应用， 因。
9、此， 有必要研究出一种利用间歇浸没生物反 应器进行怀山药组织培养快速繁殖的方法。 发明内容 0006 本发明解决的技术问题是提供一种周期短、 成本低且操作简单的利用间歇浸没生 物反应器进行怀山药组织培养扩繁方法。 0007 本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案， 利用间歇浸没生物反应器进行怀 山药组织培养扩繁方法， 其特征在于具体过程为： （1） 按照配方基本培养液MS+激素NAA 0.1-0.5mg/mL+激素KT 0.5-1.5mg/mL+蔗糖30g/ L， 调整pH值5.8-6.2配制培养液， 将配制的培养液高温高压湿热灭菌后备用， 再将间歇浸没 生物反应器包扎， 高温高压湿热灭菌后。
10、备用； （2） 在无菌环境中， 将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中， 再将怀山 说 明 书 1/3 页 3 CN 108849531 A 3 药带腋芽或带节点茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中， 其中怀山药茎段的接种密度为 20-60个/L； （3） 设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率3-15min/6-12h， 培养时间为35-90d， 设定培养环境条件为光照强度1500-1800lux， 光照12h/d， 温度251。 0008 进一步优选， 所述间歇浸没生物反应器中怀山药的接种密度为30-50个/L。 0009 进一步优选， 所述间歇浸没生物反应器的设定参数为浸没频率5。
11、-10min/6-10h。 0010 本发明所述的利用间歇浸没生物反应器进行怀山药组织培养扩繁方法， 其特征在 于具体步骤为： （1） 按照配方基本培养液MS+激素NAA 0.5mg/mL+激素KT 1.0mg/mL+蔗糖30g/L， 调整pH 值5.8配制培养液， 将配制的培养液高温高压湿热灭菌后备用， 再将间歇浸没生物反应器包 扎， 高温高压湿热灭菌后备用； （2） 在无菌环境中， 将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中， 再将怀山 药带腋芽或带节点茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中， 其中怀山药茎段的接种密度为 40个/L； （3） 设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率5mi。
12、n/6h， 培养时间为60d， 设定培养环 境条件为光照强度1500-1800lux， 光照12h/d， 温度251， 最终怀山药培养增殖系数为 6.4， 将组培苗移栽后， 植株的成活率达到90%以上且植株生长健康。 0011 通过大量实验证实， 间歇浸没生物反应器培养怀山药适宜的怀山药带腋芽茎段的 接种密度20-60个/L， 当接种量低于20个茎段/L时， 组培苗生长缓慢， 培养60天后组培苗没 有充满整个反应器， 空间和营养利用率均较低； 当接种量高于60个茎段/L时， 反应器中组培 苗拥挤， 茎较细弱， 叶片较小， 生长一段时间后易出现叶片发黄的现象。 0012 采用本发明生产怀山药种苗。
13、的技术方案， 其产生的有益效果是： （1） 增殖率高。 间歇浸没液体培养系统是利用无菌空气产生的压力将液体培养基与植 物组培苗间歇的接触， 将植物组织培养过程中的气体交换和营养利用最大化， 怀山药培养 的增殖率可达6左右， 为传统液体培养的3倍左右。 0013 （2） 自动化程度高、 劳动量小。 由于间歇浸没液体培养系统是半自动化控制， 整个 培养过程只需要一次接种， 省去了频繁转接和大批量组培瓶的灌装清洗等的操作， 大大的 减少了劳动量， 降低了生产成本。 0014 （3） 组培苗质量好， 适应性强。 同传统的液体培养相比减少了继代次数， 降低了变 异率， 组培苗根系更发达， 并且在培养过程。
14、中进行了充分的气体交换， 营养利用率高， 组培 苗环境适应能力强、 生长健壮、 移栽成活率高。 附图说明 0015 图1是实施例3中怀山药组培苗在间歇浸没生物反应器中的培养情况， 其中培养 7天； 培养30天； 培养60天。 具体实施方式 0016 以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明， 但不应该将此理解为本 发明上述主题的范围仅限于以下的实施例， 凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发 说 明 书 2/3 页 4 CN 108849531 A 4 明的范围。 0017 实施例1 （1） 按照配方MS+激素NAA 0.5mg/mL+激素KT 1.0mg/mL+ 蔗糖30g/L， 。
15、调整PH值5.8， 配 制培养液， 并包扎间歇浸没生物反应器， 高温高压湿热灭菌后备用； （2） 在无菌环境中， 将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中， 再将怀山 药带腋芽或带节点茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中， 其中怀山药茎段的接种密度为 30个/L； （3） 设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率5min/6h， 培养时间为60d， 设定培养环 境条件为光照强度1500-1800lux， 光照12h/d， 温度251。 0018 怀山药培养增殖系数为6， 将组培苗移栽后， 植株的成活率达到90%以上且植株生 长健康。 0019 实施例2 （1） 按照配方MS+激素NAA 0。
16、.5mg/mL+激素KT 1.0mg/mL+ 蔗糖30g/L， 调整PH值5.8， 配 制培养液， 并包扎间歇浸没生物反应器， 高温高压湿热灭菌后备用； （2） 在无菌环境中， 将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中， 再将怀山 药带腋芽或带节点茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中， 其中怀山药茎段的接种密度为 40个/L； （3） 设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率5min/6h， 培养时间为60d， 设定培养环 境条件为光照强度1500-1800lux， 光照12h/d， 温度251。 0020 怀山药培养增殖系数为6.4， 将组培苗移栽后， 植株的成活率达到90%以上且植株 。
17、生长健康。 0021 实施例3 （1） 按照配方MS+激素NAA 0.5mg/mL+激素KT 1.0mg/mL+ 蔗糖30g/L， 调整PH值5.8， 配 制培养液， 并包扎间歇浸没生物反应器， 高温高压湿热灭菌后备用； （2） 在无菌环境中， 将已灭菌的培养液倒入已灭菌的间歇浸没生物反应器中， 再将怀山 药带腋芽或带节点茎段直接接种于间歇浸没生物反应器中， 其中怀山药茎段的接种密度为 50个/L； （3） 设定间歇浸没生物反应器的参数为浸没频率5min/6h， 培养时间为60d， 设定培养环 境条件为光照强度1500-1800lux， 光照12h/d， 温度251。 0022 怀山药培养增殖系数为3.8， 将组培苗移栽后， 植株的成活率达到90%以上且植株 生长健康。 0023 以上实施例描述了本发明的基本原理、 主要特征及优点， 本行业的技术人员应该 了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原 理， 在不脱离本发明原理的范围下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变化和改进均落入 本发明保护的范围内。 说 明 书 3/3 页 5 CN 108849531 A 5 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 6 CN 108849531 A 6 。