与相关申请的交叉参考
本专利申请要求于2014年7月1日提交的美国临时专利申请62/019,717的利益，所述美国临时专利申请的内容全文并入本文。
技术领域
本发明一般涉及包括多层和双层酸保护性口服剂量制剂的饮食补充剂和药物制剂，所述多层和双层酸保护性口服剂量制剂包含益生菌并且作为单一的统一或内聚剂型单位提供。内聚剂型的每个个别酸保护层提供了不同的益生菌有效负荷、将益生菌靶向递送至胃肠道中的特定区域的不同释放概况、或不同的益生菌有效负荷和将不同益生菌靶向递送至胃肠道中的特定区域的释放概况两者之一。
背景技术
常规益生菌剂型提供了用于其中携带的益生菌有效负荷的单一释放模式或速率。
各种益生菌制剂和制备此类制剂的方法是本领域技术人员已知的。例如，均匀的控制释放益生菌制剂公开于美国专利号8,540,980；8,007,777；7,150,623；和6,627,220中。这些专利的内容特别指出且以引用的方式并入本公开内容内。具体地，美国专利号8,540,980和8,007,777涉及用于制备具有控制或持续释放的各种均匀的单一剂型单位的各种益生菌预混合粉末。
使用常规益生菌剂型寻求位于胃肠道的不同区域中的不同微生物的益生菌补充的利益的人和动物必须：(1)摄取各自对于每种特定微生物和胃肠道目的区域的靶向递送特异性的多重剂型；或(2)服用提供不同微生物的均匀释放的无效或较不有效的单一剂型。因此，本发明人已确定在某些情况下，均匀的单一单位剂型制剂包括各种益生菌的混合物或组合可导致益生菌有效负荷的无效和较不有效递送。
均匀的混合或组合的异质益生菌有效负荷剂型可导致无效递送，例如其中最适合于递送至上胃肠道的某些微生物相反整个或部分递送至下胃肠道；同时，最适合于递送至下胃肠道的某些其他微生物可能整个或部分递送至上胃肠道。
存在提供不同益生菌的分开制剂和释放的剂型单位的需要。此外，存在单一内聚分层酸保护性剂型单位的需要，以提供适合于胃肠道的不同区域，例如上胃肠道和下胃肠道的益生菌的不同释放速率和靶向递送。
发明内容
本发明人已首次开发了在不同层中包含不同益生菌的内聚酸保护性口服剂量制剂和剂型，其中每个层具有相同或不同释放速率。本发明的分层口服剂量制剂可实现不同益生菌对胃肠道中的不同区域，例如上胃肠道例如口、食道、胃、十二指肠、空肠和近端回肠，以及下胃肠道例如远端回肠、结肠和肛门的靶向递送，以达到最大效应。
本发明的制剂可用于实现对胃肠道内的不同区域的立即、持续、控制、间歇、脉冲和/或靶向益生菌递送，因此经过立即、间歇、脉冲和/或持续或延长时间段中的任一递送靶向益生菌的释放。本发明的发明人已首次实现分开层中的不同酸保护性益生菌预混合粉末的组合且使分开层中的不同酸保护性益生菌预混合粉末的组合变成可能，以达到在单一的统一或内聚酸保护性剂型单位中不同益生菌制剂的一起递送。本发明的发明人还已首次实现分开层中的不同酸保护性益生菌预混合粉末的组合且使分开层中的不同酸保护性益生菌预混合粉末的组合变成可能，以达到在单一的统一或内聚酸保护性剂型单位中具有不同释放概况的不同益生菌制剂的一起递送。
酸保护制剂的每层可含有在属、种、亚种和菌株水平中的一种或多种上可区分的不同益生菌或益生菌混合物。每层可表征为立即释放或者具有不同水平的脉冲、持续、延长或控制释放中的任何一种。每层可具有不同大小，或相对于其他层中的一个或多个包含更大部分的最终剂型。本发明的发明人发现本发明的多层或双层益生菌酸保护剂型之间的剂型单位粘合优选通过在剂型的每层中包括相似或相同量的一种或多种相似或相同的赋形剂得到最佳化。因此，在本发明的优选实施例中，某些制剂组分跨越各种层制剂共享。
本发明的剂型是酸保护性的，但每层可包括不同水平的酸保护。不同水平的酸保护可有利于对于益生菌有效负荷的靶向递送的层释放概况的定制。
本发明的优选实施例不包括任何肠包衣。因为肠包衣不是实现本发明的利益所需的，所以本文描述的剂型避免与此类肠包衣的包括相关的进一步制造复杂性和费用。然而，本发明的制剂可包括肠包衣，但肠包衣不是必需的。
本发明的制剂可用于保护益生菌不受胃的苛刻酸环境影响。
本发明的制剂可经由直接压制形成为分层片剂或囊片，或相似剂型。本发明制剂的每层可包含在压制前松散的粉末材料或混合物。在最终压制后，本发明的实施例有利地形成对层分离抗性的单一分层内聚非脆性剂型单位。本发明的每个制剂层可首先分开压制，或预压制，并且随后再次与一个或多个另外层一起压制。可替代地，制剂层可在单次压制中一起压制。不同的压制或压紧压力可就压制层中的每一个和/或整个制剂而言使用。此处描述的过程仅是例子，并且不构成可用于制备本发明的过程的排他性列表。
附图说明
图1A、1B、1C和1D分别显示了在暴露于酸后(USP 2型仪器，pH 2.5在37℃下，伴随以50RPM设置的桨搅拌)，随后为在中性溶液中的连续溶解，在零、三、六或九小时根据本发明产生的双层片剂的持续释放评估图像。
图2显示了亲水试剂对活的有益微生物从现有技术制剂控制释放到小肠内的作用，所述现有技术制剂可新近修饰且用于形成双层剂型的一侧。
图3显示了电解质试剂的添加对活的有益微生物从现有技术制剂控制释放到小肠内的作用，所述现有技术制剂可新近修饰且用于形成双层剂型的一侧。
图4显示了pH和酶敏感试剂的添加对活的有益微生物从现有技术制剂控制释放到小肠内的作用，所述现有技术制剂可新近修饰且用于形成双层剂型的一侧。
图5显示了活的有益微生物经过延长持续时间从现有技术制剂控制释放的能力，所述现有技术制剂可新近修饰且用于形成双层剂型的一侧。
图6显示了对于下肠道特异性的有益微生物经过12小时的延长持续时间从现有技术制剂的控制释放，所述现有技术制剂可新近修饰且用于形成双层剂型的一侧。
图7显示了用于控制本发明中的几何可缩放性、片剂大小和形状变化的能力，以及此类变化对活的有益微生物从现有技术制剂控制释放到小肠内的作用，所述现有技术制剂可新近修饰且用于形成双层剂型的一侧。
图8显示了在压片前使试剂干燥对活的有益微生物从现有技术制剂控制释放到小肠内的作用，所述现有技术制剂可新近修饰且用于形成双层剂型的一侧。
图9显示了采用不同粘度的亲水试剂的亲水基质对活的有益微生物从现有技术制剂控制释放到小肠内的作用，所述现有技术制剂可新近修饰且用于形成双层剂型的一侧。
图10显示了生理学可接受的电解质试剂对现有技术制剂的稳定性的作用，所述现有技术制剂可新近修饰且用于形成双层剂型的一侧。
具体实施方式
1.制剂组分
本发明的益生菌包括例如且不限于乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)、拟杆菌属(Bacterioides)的成员或发现具有益生效应的的其他生物，或者此类生物的一部分、片段、组分、蛋白质或副产物。具体地，动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subspecies lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(例如由供应商项目代码1217794和1244824制造，商标名称BI-05 100B 1KG、BI-05 100B 20KG，益生菌活菌计数≥1.0E+11CFU/g；长双歧杆菌B1-05SD-5588)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subspecies casei)、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subspecies rhamnosus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)(例如由制造，益生菌活菌计数≥5.0E+10CFU/g，包括非GMO源材料包括SD-5847)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subspecies lactis)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)和各种经修饰的土壤生物的培养物。本发明的益生菌可包括在自然界中未发现的微生物或在其他方面改变以包括外来遗传材料或化学材料包括重组DNA的益生菌。本发明的益生菌还包括通过细菌产生或来源于细菌或从细菌中分离的益生菌酶，以及其他益生菌副产物，包括例如超氧化物歧化酶(SodA)。本发明的益生菌还可任选包括非存活细胞或者其组分或片段。
制剂的每层可含有在属、种、亚种和菌株水平中的一种或多种上可区分的不同益生菌或益生菌混合物。
根据本发明的制剂包括使益生菌有效负荷免于胃酸的有害作用的一种或多种组分。此类组分包括例如碳酸钠、碳酸氢钠和磷酸钠。
益生菌制剂的另外的组分包括亲水试剂，例如溶胀剂、粘度增加剂、凝胶强度增强剂。亲水试剂可选自例如：淀粉(例如玉米淀粉、米淀粉或马铃薯淀粉)、亲水树胶、多糖或半乳甘露聚糖(例如果胶、琼脂、右旋糖酐、角叉菜胶、黄蓍胶、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、瓜尔胶、黄原胶、茄替胶、海藻酸或海藻酸钠)、纤维素衍生物(例如甲基纤维素、羧甲基纤维素、淀粉羟乙酸钠、羧甲基纤维素钠或羧甲基纤维素钙、羟乙基甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素或微晶纤维素)、硅石(例如二氧化硅，商标名称PRIOSILPS-200，由Glassven制造；CAS#7631-86-9)、硅酸铝、硅酸镁、硅酸镁铝、硅酸钠或长石、氢氧化铝、蛋白质(例如明胶或酪蛋白)、聚合物(例如丙烯酸酯、羧基聚亚甲基、聚亚烷基二醇或聚乙烯吡咯烷酮)、亲水聚合物(例如纤维素衍生物例如微晶纤维素(MCC))(例如CAS#9004-34-6；由Accent Microcell Private Ltd.制造的微晶纤维素MCC 112；材料可源自木浆，且包括非GMO源)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)(也称为羟丙甲纤维素)(例如由THE DOW CHEMICAL COMPANY制造的K100 PREMIUM；材料可源自木浆和棉短绒；CAS#9004-65-3)、或羟丙基纤维素(HPC)、或树胶和多糖例如瓜尔胶或麦芽糖糊精。还可使用组合材料，例如由FMC Biopolymer制造的CE-15(MCC)和瓜尔胶，其中每种组分分别源自木浆和植物源，并且包括非GMO源；(CAS#9004-34-6和CAS#9004-30-0)。
还可使用疏水试剂包括蜡及其他惰性材料例如乙基纤维素或巴西棕榈蜡。
本文制剂可使用pH特异性溶胀特征或位点特异性酶降解，以定制益生菌的控制释放。例如，可使用下述组分中的一种或多种，或调整其在制剂中的相对量：海藻酸盐、多糖例如明胶或胶原、瓜尔胶、黄原胶、果胶(例如源自柑橘和苹果皮、包括非GMO柑橘和苹果皮)、异质蛋白质混合物、多肽、多糖(例如由Herbstreith&Fox制造的PECTIN 150SLOW SET；CAS#9000-69-5)、果胶和/或海藻酸盐和半乳甘露聚糖胶(例如瓜尔胶、黄原胶和/或刺槐豆胶)、聚乙烯衍生物(例如聚氧化乙烯(PEO)和/或聚乙二醇(PEG))、水解蛋白质(例如明胶和/或胶原)、以及多肽(例如明胶、胶原、酪蛋白或异质蛋白质混合物)。
另外，可包括电解质尤其是例如无水碳酸钠、无水碳酸钾、无水碳酸钠(例如，食品级无水碳酸钠，包括CAS#497-19-8)或钙盐。生理学可接受的电解质的包括可产生缓冲环境，所述缓冲环境允许重构和释放在对于细菌活力最佳的pH条件下发生。电解质和例如亲水试剂之间的相互作用不仅可允许益生菌的pH不依赖性释放，还可稳定剂型的内部pH。维持稳定的内部pH促成益生菌的稳定性。
粘合剂可包括HPMC、MCC、瓜尔胶、果胶(作为内聚粘合剂)等，所述粘合剂中的一些可在如上所述的制剂中发挥双重目的。
另外的任选成分包括盐、干燥剂、崩解剂、流动试剂和管道试剂、润滑剂和着色剂。例如，生理学可接受的盐可在冻干期间以1.0:0.1至1.0:25益生菌与盐的比率引入益生菌中。盐的添加还帮助维持剂型自身内的恒定pH，且在冻干过程期间充当冷冻保护剂，以帮助防止细胞裂解。干燥剂可包括例如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、胶体二氧化硅和/或其组合。崩解剂可包括例如可得自Blanver Farmoquimica LTDA的作为销售的交联羧甲基纤维素钠，以及可得自BASF的作为销售的交聚维酮(不溶性聚乙烯吡咯烷酮)。流动试剂和管道试剂和润滑剂可包括例如硬脂酸镁和硬脂酸(例如STEARIC ACID TRISTAR 149)。着色剂可包括例如姜黄(例如NO.03255TURMERIC CG 90)。
2.用于制备制剂的过程
本发明的制剂可通过组合各种粉末混合物进行制备，每种混合物包含一种或多种预选择的益生菌。这些混合物可通过单次压制一起压制成分层剂型。可替代地，用于形成任何一个层的混合物可在与一个或多个另外的层组合之前进行预压制。在一个实施例中，剂型是多层片剂或囊片。在一个优选实施例中，剂型是用于经口施用的双层片剂或囊片。在另一个优选实施例中，剂型是通过在双面压片机上的序贯直接压制形成的双层片剂。压制可涉及冷却的有意使用，以避免损害益生菌。
与本发明一起使用的粉末混合物是干燥的。粉末混合物可包括冻干的益生菌预混物。具体地，在压制前粉末混合物的含湿量不超过5％。根据本发明的成品剂型具有不超过0.275Aw的含水量。
片剂共混物的加工在环境室温和湿度下完成。理想地，加工室温和湿度不超过23℃/45RH，但极低湿度可导致静电问题以及干燥成分的共混和压制中的困难。散装培养浓缩物和成品散装剂量形式的贮存维持在-10℃下或低于-10℃。当片剂不是主动地被制造时，过程中片剂共混物贮存于4-15℃的冷藏温度下的密封衬里中。
本文描述的制剂的稳定性可使用各种测试和方案进行评价。例如，且不限于，制剂可优选经过18个月的时期和/或在周围稳定性环境(17-20摄氏度/≤50％相对湿度)中，在例如1天后并且随后再次在120天后就活CFU进行实时测试。可替代地，例如，且不限于，制剂可经过18个月的时期和/或在周围稳定性环境(25摄氏度/60％相对湿度)中，在例如1天后并且随后再次在120天后就活CFU进行实时测试。
考虑稳定性不应受影响；然而，由于多阶段或两阶段压制过程，初始压制损失可更大。
制造益生菌双层囊片或片剂可遵循由用于制备双层剂型的压片机制造商提供的标准设置和说明书。例如，设计为通过双重压制过程掺入两种独特的配方共混物的双面压片机被装配且在两个进料斗各自中充满共混物。随着加工开始，操作者调整转速、流速、压制力和冲压深度，以引入共混物且在囊片的第一阶段(主要侧)中压制它。这个侧面在模具中继续至第二阶段填充和压制(次要侧)，以形成单一片剂。
在一个实施例中，取决于使用的压片机和片剂模具，主要侧和次要侧的片剂双层重量的相对量可从大约60％:40％变成70％:30％。在一个特定实施例中，如实例1中所示，片剂双层重量包含在主要侧压制中的总重量的大约67％和次要侧压制中的总重量的大约33％。一旦完成，片剂就从压片机中弹出，并且冲压/模具站继续其旋转回到第一阶段，以重复该过程。
3.制剂
除本文提供的一般制剂参数之外，在本发明的任何层、或个别侧中任一或两者(如果是双层片剂)、或每个亚组分(如果是多层片剂)中使用的制剂与美国专利号8,540,980和8,007,777(所述美国专利号涉及和/或描述BIO-制剂)中所述的均匀的个别剂型单位制剂中的某些重叠。为此，本发明人在此处包括与某些均匀的酸保护性不同释放的益生菌均匀剂型的制备有关的现有技术证据和数据，他们已自此确定，可有利地基本上重新设计，重新配置且改变用途，以形成本发明的分层剂型，其中每层包含不同益生菌且任选具有不同释放概况。参见实例4-12和图2-10。
在一个优选实施例中，本发明的双层片剂的一个或多个个别层或“侧面”可包括5-40％亲水试剂、5-40％释放改性剂和1-40％电解质。释放时间修饰最初通过使用脱模剂的不同输入％和粘度来实现。
例如，在一个实施例中，本发明提供了根据本发明的双层片剂，具有约923mg的靶重量，其中第一层占约621mg并且第二层占约302mg。考虑可制备本实施例的变化，其中第一层占约621mg(±50mg)并且第二层占约302mg(±30mg)。
本发明人还已确定在每层中包括某些相同成分的某些百分比(％)重量量(w/w)促成统一内聚分层剂型的成功制备，并且减少或消除最终剂型脆碎度。例如，对于主要设计为提供来自分开的分层剂型的不同益生菌的剂型，用所有成分的相同相对百分比平衡双层片剂的主要侧和次要侧层，对于层是最佳的。本发明人也已确定对于制剂组分例如HPMC、果胶、MCC和益生菌粉末预混物，以相对相似量存在于每个侧面上以最佳促进单位内聚是特别重要的。剂型内聚不仅对于产品货架验收是重要的，还对于剂型的稳定性和功能性是重要的。这是因为分开、破坏和分裂的剂型更难以处理，并且物理上导致更小的剂量质量大小和增加量的表面积，所述表面积暴露于可导致过早溶解以及益生菌有效负荷的无能或无效递送的氧(稳定性)和/或胃肠道溶解试剂。
在本发明的几种双层片剂制剂中，HPMC、果胶、MCC和益生菌粉末预混物是成品剂型中的主要输入组分(w/w)。
在一个实施例中，本发明的双层片剂制剂在每层中包括相同或基本上相似的相对百分比(w/w)量的一种或多种给定制剂主要输入组分，包括但不限于HPMC、果胶、MCC和益生菌粉末预混物，以帮助制备统一的内聚分层剂型。例如，双层片剂的每个侧面中的给定制剂组分的相对百分比(w/w)量可在另一侧的约20％内，更优选在另一侧的约15％内，再更优选在另一侧的约10％内，且最优选在另一侧的约5％内，且最佳地在另一侧的约1％内。
注意到虽然本发明剂型在本文中最频繁地被称为双层片剂，但本发明包含多层制剂和所有可压制的可经口摄取的剂型类型，例如片剂和囊片。
4.靶向释放
不同培养物群优先居住于人胃肠道的不同区域。为了靶向释放益生菌可摄取剂量形式的目的，居住于口腔和食道区域的微生物不是本讨论的部分。小肠(十二指肠、空肠和回肠)的微生物生态学占优势地被例如乳杆菌属和链球菌属物种占据。结肠(升结肠、横结肠和降结肠)包含例如由双歧杆菌属、拟杆菌属和梭菌属(Clostridium)以及肠杆菌科(Enterobacteriaceae)主导的一些严格厌氧的微生物群。
人胃肠道是远离疾病的第一道防御机制之一。在病原体有机会感染且增殖或引起疾病之前，胃中的酶和酸作用于杀死病原体。益生菌培养物可通过暴露于胃酸、消化酶和胆汁盐而被杀死。
培养物在其抵抗这些消化试剂的能力方面不同，一些是非常敏感的并且一些是更有抵抗力的。然而，一般地，活细胞的显著损失在胃中发生。益生菌选择历史上已集中于能够抵抗这些试剂的菌株，并且存在几种有效的递送技术以保护敏感培养物通过胃肠道的消化区域。
益生菌产品的许多常规粉末和液体剂型不对培养物剂量提供酸保护，并且通常依赖培养物的天然耐酸性以存活通过胃。许多递送技术在pH/酶依赖性爆发应答中在小肠开始处释放其整个有效负荷。对于适合该环境的培养物，这可能是足够的，但对于对上部小肠的氧势敏感的培养物，爆发或立即释放可导致活力丧失。关于对上部小肠的氧势敏感的培养物的更佳递送系统将经过稍后或延长持续时间提供活培养物的保护和释放到下胃肠道包括结肠内。
在一个实施例中，本发明涉及不同释放概况的制剂，以将至少两个不同类别的益生菌优选沉积到其预期的微生物小生境内。例如，本发明可在小肠或上胃肠道中递送乳杆菌属和链球菌属，并且将严格厌氧菌如双歧杆菌属进一步递送到下部肠道内。证实该概念的示例制剂包括每种培养物作为阴性对照(无保护)的立即释放固体剂量和例如根据本发明的双层片剂的比较。
婴儿双歧杆菌对氧和酸暴露非常敏感。例如，婴儿双歧杆菌共混物可设计为具有延长释放持续时间和优良的酸保护，例如用于递送至下胃肠道。此外，植物乳杆菌是气生耐受和耐酸的；这种共混物设计用于适度酸保护和更短的释放概况，例如用于经由可经口摄取的剂型递送至上胃肠道。
在本发明的一个实施例中，在主要侧中具有婴儿双歧杆菌共混物和在次要侧中具有植物乳杆菌的双层片剂可就制造压制损失和在溶解中随着时间过去的差异活菌计数释放进行评估。在另一个实施例中，在主要侧中具有乳双歧杆菌(B.lactis)共混物和在次要侧中具有发酵乳杆菌的双层片剂可就制造压制损失和在溶解中随着时间过去的差异活菌计数释放进行评估。
另外，注意到双层片剂的主要层或主要侧或者第一层或第一侧相对于次要层的另外的质量可影响酸存活。相应地，上述双层实施例可通过比较第一层或第二层中的每种益生菌进行测试，以测定哪种分层剂型提供最佳总体存活率。
优选组合可在例如第3-7小时之间释放小肠制剂的固体剂量重量的25-70％；和例如在第6-12小时之间释放结肠制剂的35-90％。
在某些双层片剂实施例中，例如，约30-40％的固体剂量重量在第3-7小时之间主要从主要第一侧递送至小肠制剂。随后，固体剂量重量的剩余量在第6-12小时之间主要从次要侧递送至结肠或下部肠道。在某些其他双层片剂实施例中，例如，约20-30％的固体剂量重量在第3-7小时之间主要从主要第一侧递送至小肠制剂。随后，固体剂量重量的剩余量在第6-12小时之间主要从次要侧递送至结肠或下部肠道。
实例
实例1：内聚乳双歧杆菌和发酵乳杆菌双层制剂和制备
表1
部分B
使用Double-Sided Press with Precompression(标记IV型号)双层片剂压片机制备使用上述制剂的双层片剂，以通过双重压制过程掺入两种独特的制剂共混物。
使用的模具或冲头大小为大小0.312x 0.750(冲头ID：D23)。双层片剂可使用1,000粒丸剂/分钟的转塔速度进行制造。上冲穿透包括8mm后部和4mm前部。第一层具有约0.531(设定点0.377)的填充深度，并且第二层具有约0.564(设定点0.394)的填充深度。关于第一层的平均冲头压力(磅/英寸2)为以约202的预压制和以约738的主要压制。关于第二层的平均冲头压力为以约64的预压制和以约2188的主要压制。最终KP(千克力)为约10.7KP(平均值)。此类双层片剂的脆碎度为约0.25％，其中脆碎度指示破坏的丸剂或层的分离。
脆碎度是关于片剂耐久力的USP标准测试：称重十(10)个片剂，随后插入标准尺寸以及转速和时间的转筒内，随后再次称重。损失记录为百分比。<1％的损失对于大多数补充剂是良好的，但对于益生菌例外。
因此，成品剂型重量(w/w)为约870mg，具有约923mg的靶重量，其中第一层占约621mg，并且第二层占约302mg。
实例2：不同培养物压片双层制剂的酸保护评估
活益生菌培养物的存活在USP 2型溶解仪器中评估在pH 2.5下在37℃下暴露30分钟的禁食状态测试参数，伴随以50RPM设置的桨搅拌。每个数据点是在900mL溶解培养基中个别重复的三个个别剂量测试的平均值。测试的剂型是根据实例1制备的那些。
益生菌计数在暴露结束时通过下述对残留囊片材料完成：轻轻地将水合的囊片提出腔室且通过轻轻溶解加工其用于板计数测定，并且在铁胃(stomacher)搅拌器中匀浆化，随后为标准板计数测定，以计数活菌落形成单位。
为了评价处于无保护状态的益生菌的存活，冻干的粉状培养物(用于制造囊片)就酸暴露前的活菌计数进行测定，并且使1g这种材料在溶解培养基中在仪器中水合且接受相同暴露。在暴露后，从培养基中抽取样品且如上所述加工用于活菌计数。
乳双歧杆菌和发酵乳杆菌的差异计数通过培养物的不同菌落外观成为可能，且报告为就稀释因子调整后的总的回收活细胞。存活通过将酸后回收的CFU除以引入的CFU进行测定，并且表示为百分比。这还表示为通过将囊片存活百分比除以无保护粉末存活百分比的关于个别培养物的“保护因子”。
表2
在37℃50RPM下30
分钟pH 2.5
发酵乳杆菌是酸敏感培养物，但它靶向用于递送至上胃肠道，使得它可照惯例视为适合于立即释放制剂或者不需要延长或控制释放概况的制剂。本文数据显示当发酵乳杆菌在酸中直接测试时，发酵乳杆菌活力中的严重丧失，以及当在本发明的酸保护剂型例如实例1中所述的那些中制备时，这些损失的显著避免或减少。这些结果突出显示在胃通过期间关于酸保护的关键需要，即使被施用的培养物靶向用于递送至上胃肠道，并且因此不预期需要不受胃酸影响的保护。
这一系列测试证实关于通过双层片剂提供的益生菌培养物的两个趋异属各自的活有效负荷的优良保护。令人惊讶的是，根据本发明的发酵乳杆菌培养物不存在的制剂被证明对于酸是非常敏感的。事实上，本发明人发现本发明制剂提供了对于发酵乳杆菌培养物超过1800X的令人惊讶的制剂保护因子。
此处，即使双歧杆菌属培养物乳双歧杆菌最终比发酵乳杆菌培养物耐酸性高几个数量级，但两种培养物均获益于通过双层片剂剂型提供的酸保护。本文数据证实使用本文公开的酸保护制剂对于所有培养物的重要优点，与掺入制剂内的培养物对酸更敏感还是更不敏感无关，并且与靶向递送部位是上胃肠道还是下胃肠道无关。
此外，本实例显示本发明的酸保护制剂允许含有例如敏感或耐酸培养物的截然不同的制剂在单一内聚剂型中组合，所述单一内聚剂型提供了对于剂型益生菌有效负荷转运通过胃的共享的相似酸保护。相应地，本实例显示本发明的酸保护的分层剂型可有助于适当益生菌包括酸敏感益生菌对位于胃肠道的不同区域中的靶部位的沉积。
实例3：持续释放评估
为了证实来自根据实例1制备的这些剂型的活益生菌通过模拟肠通道的持续释放，相同USP 2型仪器和测试参数用于如上文实例2中注明的初始酸暴露(即USP 2型溶解仪器，用于在pH 2.5下在37℃下的30分钟暴露的禁食状态测试参数，伴随以50RPM设置的桨搅拌)。随后，在30分钟时，室的pH调整至中性pH 7.0-7.5，并且允许剂量保持在室中另外的溶解暴露至3、6或9小时的总时间。根据实例1制备的剂型的图像在此处对于零时间、3小时时间、6小时时间和9小时时间分别如图1A、1B、1C和1D提供。在测试期结束时，残留剂型轻轻地从室中取出且如上加工以测定在完整囊片中剩余的活菌计数。获取溶解培养基的样品且测定在培养基中释放的益生菌活菌计数。调整计数以反映引入溶解室内且从溶解室中回收的总CFU。再次，对于每个数据点测试三个重复且在报告中求平均值。
下文数据显示随着双层片剂溶解逐步增加的细胞计数回收。在底部处的总回收部分显示回收的益生菌逐步下降，但重要的是，细胞回收发生，并且存在通过至少约9小时暴露。
表3
在37℃50RPM下30分钟pH 2.5，随后为培养基的中和以及连续溶解
溶解前CFU/
残留剂型证实随着剂型侵蚀到培养基内活菌计数中的进行性减少。培养基样品通过测试的9小时在计数中进行性增加。重要的是，活细胞回收持续通过9小时，其中总回收从在30分钟时间点的初始剂量的66％下降到分别在3、6和9小时时的26％、24％和14％。注意到显著活跃细胞计数在溶解自始至终都回收到。
下述实例提供了提议用于用作本发明的剂型的亚组分的层制剂。单独获取的这些制剂在总质量中视为太小而无法与许多常规分层压片机一起工作。注意到增加总质量重量的一种方法是例如包括填料例如MCC或麦芽糖糊精。然而，注意到虽然MCC或麦芽糖糊精的包括对于片剂压制可能是重要的，但这些组分一般不帮助片剂内聚。此外，包括大量MCC或麦芽糖糊精可影响片剂释放速率，即增加释放速率。
本发明的剂型的制备可包含下述层制剂中的一种或多种连同如本文描述的其他层制剂一起，以形成本发明的分层内聚酸保护制剂，以提供不同益生菌层且提供具有不同释放概况的不同益生菌层。
实例4
如表4中所示制备多层剂型的一种亚组分或双层片剂剂型的侧面，称重大约382mg，且含有亲水试剂和益生菌预混物。组A1是对照。在本实例中，益生菌预混物包含有益微生物例如冻干粉末的乳酸菌预混物和淀粉。采用的亲水试剂是微晶纤维素(MCC)、麦芽糖糊精、羟丙基甲基纤维素(HPMC)或聚氧化乙烯(PEO)。亲水试剂的添加延迟来自剂型的益生菌释放。硬脂酸被包括作为流动试剂，并且二氧化硅用作流动试剂和干燥剂。
如图2中所示，本实例的结果反映通过使用包含亲水试剂和冻干益生菌的基质授予的，来自双层剂型的分开侧面的控制释放水平。这种控制释放通过在暴露于胃介质后递送的比对照高得多水平的活乳酸菌菌落形成单位(CFU)显示。较少溶胀的亲水试剂例如MCC和麦芽糖糊精的使用与足够但更低的控制水平相关。优良的控制水平在聚氧化乙烯和HPMC基质两者中得到证实。因此，亲水试剂并不限于特定类型的亲水试剂，只要实现足够的基质粘度。
表4
实例5
可如表5中所示制备作为片剂的双层剂型的一个侧面，大约382mg，含有亲水试剂、电解质试剂和益生菌预混物。组B1是对照。制剂采用HPMC作为亲水试剂。所使用的电解质试剂包括NaHCO3、Na2CO3或NaH2PO4中的任何一种。在这种情况下，益生菌由冻干粉末的乳酸菌预混物和淀粉组成。电解质试剂NaHCO3、Na2CO3或NaH2PO4中的任何一种的添加建立在递送系统的剂型内的内部pH。硬脂酸被包括作为流动试剂，并且二氧化硅用作流动试剂和干燥剂。
如图3中所示的，本实例证实双层剂型的分开侧面的内部pH通过电解质试剂的存在加以改变，从而影响递送的活CFU的量。特定内部pH的这种建立与给定重构冻干BC的不同活力水平相关。特别地，制剂B2含有Na2CO3，并且电解质试剂提供了在递送系统的剂型内的内部pH且帮助重构活乳酸菌。
表5
剂量配方(mg) B1(对照) B2 B3 B4 乳酸菌预混物 150 150 150 150 HPMC 00 100 100 100 MCC 200 0 0 0 Na2CO3 0 100 0 0 NaHCO3 0 0 100 0 NaH2PO4 0 0 0 100 硬脂酸 16 16 16 16 二氧化硅 16 16 16 16 总重量 382 382 382 382
实例6
可如表6中所示制备作为片剂的双层剂型的一个侧面，大约382mg，含有亲水试剂、释放改性剂和益生菌预混物。组C1是对照。所采用的亲水试剂是HPMC。所采用的释放改性剂是果胶或明胶。冻干粉末的乳酸菌预混物和淀粉构成BC。硬脂酸被包括作为流动试剂，并且二氧化硅用作流动试剂和干燥剂。
如图4中所示，本实例示出当释放改性剂加入亲水可溶胀基质中时，增加的控制水平是可能的。果胶或明胶作为释放改性剂的存在与pH依赖性降解程度和基质粘度中的总体增加相关，所述基质粘度中的总体增加延迟益生菌的释放。这在暴露于胃pH介质后递送的活CFU中的增加中反映。
表6
剂量配方(mg) C1(对照) C2 C3 乳酸菌预混物 150 150 150 HPMC 0 100 100 MCC 200 0 0 果胶 0 100 0 明胶 0 0 100 硬脂酸 16 16 16 二氧化硅 16 16 16 总重量 382 382 382
实例7
如表7中所示制备作为片剂的双层剂型的一个侧面，大约534mg，含有亲水试剂、电解质试剂、释放改性剂、惰性填料和益生菌预混物。所采用的亲水试剂是HPMC。所使用的电解质试剂是NaHCO3。所采用的释放改性剂是果胶，并且所采用的惰性填料是MCC。在本实例中采用的益生菌预混物由冻干粉末的乳酸菌预混物和淀粉组成。惰性填料的添加与增加的粉末流动性相关，所述增加的粉末流动性在制造过程期间通常是有利的。硬脂酸被包括作为流动试剂，并且二氧化硅用作流动试剂和干燥剂。姜黄被包括作为着色剂。
如图5中所示，本实例的结果证实活益生菌细菌经过延长持续时间的控制释放的能力。亲水基质的控制释放也显示类似地执行，与对胃介质的暴露持续时间无关。E1和E2是分别显示基于1小时或2小时暴露时间在控制释放中的差异的相同制剂。
表7
剂量配方(mg) E1 E2 乳酸菌预混物 150 150 HPMC 50 50 NaHCO3 50 50 MCC 200 200 果胶 50 50 硬脂酸 16 16 二氧化硅 16 16 姜黄 2 2 总重量 534 534
实例8
如表8中所示制备作为片剂的双层剂型的一个侧面，大约532mg，含有亲水试剂、电解质试剂、释放改性剂、惰性填料和益生菌预混物。所采用的亲水试剂是HPMC或PEO。所使用的电解质试剂是NaHCO3。所采用的释放改性剂是果胶，并且所采用的惰性填料是MCC。在本实例中采用的益生菌由冻干粉末的双歧杆菌属预混物和淀粉组成。硬脂酸被包括作为流动试剂，并且二氧化硅用作流动试剂和干燥剂。姜黄被包括作为着色剂。
如图6中所示，本实例的结果证实益生菌经过延长持续时间的控制释放的能力。亲水基质的控制释放也显示在八小时后以对于BC(在这种情况下，由双歧杆菌属组成)递送有利的概况释放。此类例子可用于将双歧杆菌属递送至下部肠和超过下部肠。
表8
剂量配方(mg) F2 F3 双歧杆菌预混物 150 150 HPMC 150 0 PEO 0 150 果胶 100 100 NaHCO3 100 100 硬脂酸 16 16 二氧化硅 16 16 总重量 532 532
实例9
如表9中所示制备作为片剂的双层剂型的单个侧面，分别为大约684mg和342mg，含有亲水试剂、电解质试剂、释放改性剂、惰性填料和益生菌预混物。所采用的亲水试剂是HPMC。所采用的电解质试剂是NaHCO3。所采用的释放改性剂是果胶。在本实例中采用的益生菌预混物由冻干粉末的乳酸菌预混物和淀粉组成。硬脂酸被包括作为流动试剂，并且二氧化硅用作流动试剂和干燥剂。
如图7中所示，本实例的结果证实亲水试剂、电解质试剂和释放改性剂的组合能够控制几何可缩放性、片剂形状、大小和体积，同时控制在其亲水基质中和整体片剂的剂型中来自递送系统的益生菌释放。当需要不同制剂体积，特别是改变片剂形状和大小时，改变剂型的这种灵活性尤其可用于制造中。
表9
剂量配方(mg) H1 H2 乳酸菌预混物 75 150 果胶 50 100 HPMC 50 100 NaHCO3 50 100 瓜尔胶 100 200 硬脂酸 8 16 二氧化硅 8 16 姜黄 1 2 总重量 342 684
实例10
如表10中所示制备作为片剂的双层剂型的一个侧面，大约684mg，含有亲水试剂、电解质试剂、释放改性剂、惰性填料和益生菌预混物。所采用的亲水试剂是HPMC。所使用的电解质试剂是NaHCO3。所采用的释放改性剂是果胶，并且所采用的惰性填料是MCC。在本实例中采用的益生菌由冻干粉末的乳酸菌预混物和淀粉组成。硬脂酸被包括作为流动试剂，并且二氧化硅用作流动试剂和干燥剂。姜黄被包括作为着色剂。
如图8中所示，本实例的结果证实使压片前的预混物(I2)相对于非干燥的预混物(I1)的赋形剂的相同制剂干燥的应用。当与非干燥的预混物I1相比较，干燥的有益效应通过在干燥的预混物I2中递送的活乳酸菌或益生菌CFU中的增加得到证明。
表10
剂量配方(mg) I1 I2 乳酸菌预混物 150 150 HPMC 100 100 果胶 100 100 NAH(CO3)2 100 100 MCC 200 200 硬脂酸 8 8 二氧化硅 8 8 姜黄 2 2 总重量 684 684
实例11
如表11中所示制备作为片剂的双层剂型的一个侧面，大约532mg，含有亲水试剂、电解质试剂、释放改性剂、惰性填料和益生菌预混物。所采用的亲水试剂是粘度4000mPa(H1)或15000mPa(H2)的HPMC。所采用的电解质试剂是NaHCO3。所采用的释放改性剂是果胶，并且所采用的惰性填料是MCC。在本实例中采用的益生菌预混物由冻干粉末的双歧杆菌属预混物和淀粉组成。硬脂酸被包括作为流动试剂，并且二氧化硅用作流动试剂和干燥剂。姜黄被包括作为着色剂。
如图9中所示，本实例的结果证实通过采用不同粘度的亲水试剂，活益生菌的差异控制释放的能力。
表11
实例12
如表12中所示制备作为片剂的双层剂型的一个侧面，大约343mg，含有亲水试剂、电解质试剂、释放改性剂、惰性填料和益生菌预混物。所采用的亲水试剂是HPMC。所采用的电解质试剂是NaHCO3。所采用的释放改性剂是果胶，并且所采用的惰性填料是MCC。在本实例中采用的益生菌预混物由冻干粉末的乳酸预混物和淀粉组成。硬脂酸被包括作为流动试剂，并且二氧化硅用作流动试剂和干燥剂。姜黄被包括作为着色剂。
如图10中所示，本实例的结果证实通过相对恒定量的活乳酸菌CFU证明的，当贮存于周围环境(25摄氏度，60％相对湿度)中时，关于随着时间过去稳定性增加的能力。
表12
剂量配方(mg) K1 乳酸菌预混物 75 HPMC 50 果胶 50 NaHCO3 50 MCC 100 硬脂酸 8 二氧化硅 8 姜黄 2 总重量 343
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