技术领域
本发明涉及一种皮肤胶原促进剂、一种用于促进皮肤胶原产生的食品 物或饮品和用于促进皮肤胶原产生的化妆品，这些产品可用于防止皮肤皲 裂、产生皱纹、恶化皮肤健康状况等情况。
背景技术
近年来，人们研究了皮肤的机制，结果证实了皮肤干燥感和皲裂的宏观原 因除了因为年龄老化带来的代谢紊乱作用之外还与日光(紫外线)、干燥、氧化 等作用复杂相关。人们发现这种因素造成的作用显著减少了真皮中最主要 的基质—胶原纤维。胶原纤维维持的保持张力的机制(例如皮肤的健康或弹性) 被紫外线等作用所破坏就会增加皮肤的皱纹或松弛。同时，胶原纤维可含有水 分，这有助于皮肤保持湿润。因此，当胶原被外在因素破坏时，皮肤就变得干 燥而粗糙。
由于上述的事实，需要无害并能通过促进真皮层主要成分之一的胶原的生 物合成来防止皮肤皱纹和松弛的皮肤胶原产生促进剂。
发明内容
为解决这些问题，本发明人广泛地研究了食物中含有的对皮肤胶原产生施 加促进作用的物质，并且结果发现源自牛奶的碱性蛋白质组分或通过用蛋白酶 (例如胃蛋白酶或胰酶)降解碱性蛋白质组分得到的碱性肽组分可增加皮肤胶 原的量。此外，本发明人还发现碱性蛋白质组分或碱性肽组分可用作皮肤胶原 产生促进剂、用于促进皮肤胶原产生或用于促进皮肤胶原产生的化妆品的主要 成分，籍此本发明得以完成。
因此，本发明的目的之一是提供皮肤胶原促进剂，包括具有促进皮肤胶原 产生的源自牛奶的碱性蛋白质组分和/或碱性肽组分作为活性成分。此外，本 发明的另一个目的是提供用于促进皮肤胶原产生的食品或饮品和用于促进皮 肤胶原产生的化妆品，二者均包括这种成分。
本发明的“皮肤胶原产生促进剂”指通过口服、敷用等方式对皮肤胶原产 生可施加促进作用的物质。同时，本发明的“用于促进皮肤胶原生产的食物或 饮品”指在皮肤胶原促进剂中配制成粉末、颗粒、片剂、胶囊、饮剂等后不进 一步处理而用于口服或配制后施用并包括进营养添加剂、食物或饮品等物质。 同时，本发明的“用于促进皮肤胶原生产的化妆品”指在皮肤胶原促进剂中配 制进软膏剂、凝胶、乳膏剂、喷剂、贴剂、洗剂等的物质。此外，本发明中上 述用于促进皮肤胶原生产的食物或饮品包括药学产品，并且为了方便，在配制 后不额外处理就可口服施用的物质；而上述的用于促进皮肤胶原生产的化妆品 包括药学产品，并且为了方便，在配制后就可施用于皮肤的物质。
本发明的最佳实施方式
本发明的皮肤胶原产生促进剂的特征在于，用源自牛奶的碱性蛋白质组分 和/或通过用蛋白酶降解源自牛奶的碱性蛋白质组分得到的碱性肽组分作为活 性组分。源自牛奶的碱性蛋白质组分可得自哺乳动物奶，例如牛奶、人奶、山 羊奶或羊奶，而碱性肽组分可用蛋白酶与源自牛奶的碱性蛋白质组分反应得 到。
源自牛奶的碱性蛋白质组分具有一些如测试实施例所示的特性。
1)该组分包含几种分子量为3,000到80,000的蛋白质，分子量用十二烷 基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定。
2)该组分包含重量比为95％或更高的蛋白质。
3)该蛋白质主要包括乳铁蛋白和乳过氧化物酶。
4)该蛋白质的氨基酸组成包括碱性氨基酸，例如赖氨酸、组氨酸和精氨酸， 每种氨基酸为重量比为15％或更高。
碱性氨基酸可用以下方式获得，例如，像脱脂奶等牛奶材料与阳离子交换 树脂接触以吸收碱性蛋白质，吸收到树脂上的碱性蛋白质组分用盐浓度为0.1 到1M的洗脱液洗脱，收集洗脱组分并通过反渗透(RO)膜、电渗析(ED)方法等 进行脱盐和和浓缩，然后如果需要可进行干燥处理。
同时，以下获得源自牛奶的碱性蛋白质组分的方法有已知的例子：通过将 牛奶或源自牛奶的材料与阳离子交换树脂接触再用pH大于5且离子强度大于 0.5的洗脱液将吸附在阳离子树脂上的碱性蛋白质洗脱获得该组分的方法 (JP-A-05-202098)、使用藻酸凝胶获得该组分的方法(JP-A-61-246198)、使用 无机多孔颗粒获得该组分的方法(JP-A-01-086839)和使用硫酸酯化合物从牛 奶获得该组分的方法(JP-a-63-255300)。
另一方面，源自牛奶的碱性肽组分与碱性蛋白质组分具有相同的氨基酸组 成。例如，一种蛋白酶(例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或胰酶制剂)用于 和上述方法之一得到的源自牛奶的碱性蛋白质组分反应，藉此获得平均分子量 为4,000或低一些的碱性肽组合物。分子量的下限优选500或大一些。
当口服或敷用本发明的皮肤胶原产生促进剂时，其对皮肤胶原的产量施加 促进作用。在口服本发明的皮肤胶原产生促进剂的情况中，作为活性成分的源 自牛奶的碱性蛋白质组或碱性肽组分无需额外处理就可使用，但如按照常规方 法该组分要在配制成粉末、颗粒、片剂、胶囊、饮剂等后才能使用。在本发明 中，例如粉末、颗粒、片剂或胶囊的口服制剂通过常规方法使用，例如淀粉、 乳糖、蔗糖、甘露醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等配制。就这种制剂 而言，除了上述的载体，还可能使用结合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、 流动性促进剂、色素、调味剂等。更具体地说，结合剂的例子包括淀粉、糊精、 粉状阿拉伯胶、明胶、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维 素、结晶纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。同时，崩解剂的例子包括淀粉、羟丙基淀 粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠和结晶纤维素。表 面活性剂的例子包括大豆卵磷脂和蔗糖脂肪酸酯。润滑剂的例子包括滑石粉、 蜡、蔗糖脂肪酸酯和氢化植物油。流动性促进剂的例子包括硅酐、干燥的氢氧 化铝和硅酸镁。
此外，碱性蛋白质组分或碱性肽组分无需额外处理或在配制后就可包含进 营养补充剂、一种食品或饮品等。此外，当碱性蛋白质组分或碱性肽组分与通 常认为的具有促进皮肤胶原产生作用的成分(例如维生素C)组合时，可期望有 进一步促进皮肤胶原产生的作用。源自牛奶的碱性蛋白质组分或碱性肽组分相 对热是稳定的，因此含有源自牛奶的碱性蛋白质组分或碱性肽组分的物质可在 常规条件下加热而保持稳定。
在应用本发明的皮肤胶原产生促进剂的情况中，促进剂可包含进一种已知 的一般取决于预期用途使用的成分，藉此来制备各种剂型，例如液体剂型、固 体剂型和半固体剂型。优选组合物的例子包括软膏剂、凝胶剂、油膏剂、喷剂、 洗剂和粉剂。例如，本发明的皮肤胶原产生促进剂可与以下物质混合：烃类， 例如凡士林；高级脂肪酸低级烷基酯，例如硬脂酰剂醇类或肉豆蔻异丙酯；动 物油和脂肪，例如羊毛脂；聚醇，例如甘油；表面活性剂，例如甘油脂肪酸酯 或一硬脂酸聚乙二醇酯；无机盐；蜡；树脂；水；并且如果需要，可与防腐剂 混合，例如对羟基苯甲酸甲酯(methyl paraoxybenzote)或对羟基苯甲酸丁酯 (butyl paraoxybenzote)，藉此生产促进皮肤胶原生产的化妆品或药学产品。
口服本发明皮肤胶原产生促进剂的有效量取决于促进剂的剂型、给药方 法、预期用途以及患者的年龄、体重和症状来适当地确定，并且不是固定的。 然而，使用大鼠进行的动物实验表明为了施加促进皮肤胶原生产的作用，大鼠 的每公斤体重至少摄入量为20mg的碱性蛋白质组分和/或碱性肽组分。因此， 按照外推法，当碱性蛋白质组分和/或碱性肽组分中的至少一种的摄入量为至 少20mg/天/成人时，一般可达到预期的效果。所以，该组分可包含进食品或饮 品以实现需求或以药物施用。如果需要，一天可施用数次。
本发明的皮肤胶原产生促进剂应用的有效量依赖促进剂的剂型而变，但是 以所有要应用的组合物的总量为碱性，包含进的碱性蛋白质组分或碱性肽组分 优选重量比0.001-2％。然而，当使用时产品的包含量要稀释，这样就可进一步 增加沐浴粉。
以下将参考实施例和测试实施例详细描述本发明，但是这并不限制本发 明，因为说明书仅说明了本发明的实施方案。
[实施例1]
用去离子水彻底洗涤一根装有400g磺化Chitopearl(由Fuji Spinning Co.，Ltd.生产)作为阳离子交换树脂的柱(直径5cm×高30cm)，然后使40升 未消毒的脱脂奶(pH6.7)以25ml/min的流速流过该柱。流过后，该柱用去离 子水彻底洗涤，吸附在树脂上的碱性蛋白质组分用含有0.98M氯化钠的0.02M 碳酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱。然后使洗脱液脱盐并用反渗透(RO)膜浓缩，接着 进行冻干，藉此获得21g粉末状的碱性蛋白质组分。如此获得的碱性蛋白质组 分无需处理就可用作皮肤胶原产生促进剂。
[测试实施例1]
通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定实施例1得 到的碱性蛋白质组分。测得该组分的分布范围为3,000到80,000。
[测试实施例2]
分析实施例1所得碱性蛋白质组分的成分。结果示于表1。如该表所示， 大多数成分发现为蛋白质。
表1 水 1.06(重量％) 蛋白质 96.50 脂类 0.56 灰分 0.27 其它 1.61
[测试实施例3]
实施例l得到的碱性蛋白质组分于110℃用6N盐酸水解24小时，然后使 用氨基酸分析的设备(L-8500型，由Hitachi，Ltd.制造)分析氨基酸组成。结 果示于表2。碱性蛋白质组分含有含15重量％或更多的碱性氨基酸的氨基酸组 合物。
表2 天冬氨酸 10.1(重量％) 丝氨酸 5.3 谷氨酸 12.3 脯氨酸 4.7 丙氨酸 5.7 亮氨酸 10.2 赖氨酸 8.4
组氨酸 2.5 精氨酸 7.2 其它 33.6
[实施例2]
一根装有30kg SP Toyopearl(由Tosoh公司生产)作为阳离子交换树脂 的柱(直径100cm×高10cm)用去离子水彻底洗涤，然后使己在121℃加热30 秒消毒的3t的干酪乳清(pH 6.2)以10升/分钟的流速流过该柱。流过后，该 柱用去离子水彻底洗涤，吸附在树脂上的碱性蛋白质组分用含有0.9M氯化钠 的0.02M柠檬酸缓冲液(pH5.7)洗脱。然后，洗脱液脱盐并用电渗析(ED)方法 浓缩，接着进行冻干，藉此获得183g粉末状碱性蛋白质组分。如此获得的碱 性蛋白质组分无需处理就可用作皮肤胶原产生促进剂。
[实施例3]
将50g得白实施例2的碱性蛋白质组分溶解于10升蒸馏水中，然后加入 Pancreatin(Sigma生产)直至浓度达到1％，接着在37℃反应2小时。反应后， 于80℃热处理10分钟使酶失活，然后进行浓缩和冻干，藉此得到48.3g粉末 状碱性肽组分。如此获得的碱性肽组分无需处理就可用作皮肤胶原产生促进 剂。
[测试实施例4]
使用大鼠进行动物实验以检测实施例2所得的碱性蛋白质组分和实施例3 所得的碱性肽组分对皮肤具有生产的促进作用。7周大的Wistar雄性大鼠分为 5个测试组(n＝6)：施用生理盐水的组(组A)；以每公斤大鼠体重20mg的浓度施 用实施例2所得碱性蛋白质组分的组(组B)；以每公斤大鼠体重200mg的浓度 施用实施例2所得碱性蛋白质组分的组(组C)；以每公斤大鼠体重20mg的浓度 施用实施例3所得碱性肽组分的组(组D)；以每公斤大鼠体重200mg的浓度施 用实施例3所得碱性肽组分的组(组E)。大鼠饲养10周同时每天用探针施用每 个组分一次。
每只大鼠的真皮按照Nimi等的方法(见Arch.Biochem.Biophys.，p.292， 1967)处理以检测皮肤胶原的量，然后测定可溶性组分中羟脯氨酸的量。羟脯 氨酸是仅存在于胶原中的一种特殊的氨基酸并且占构成胶原的所有氨基酸的 约10％，这样就可估计胶原的量(见Ryuji Asano等，Bio Industry，P.12，2001)。
结果示于表3。
表3 组 羟脯氨酸的量(μg/ml) 组A 0.35±0.3a 组B 0.72±0.07bc 组C 0.91±0.09d 组D 0.63±0.06b 组E 0.84±0.08cd
这些数值代表平均值±标准偏差(n＝6)。
同时，在不同字母之间具有显著的差异(p＜0.05)。
按照该结果，10周后得到的组B、C、D和E的可溶性组分中羟脯氨酸显 著高于组A。
该结果表明碱性蛋白质组分和碱性肽组分均有促进皮肤胶原生产的作用 并是有效的皮肤胶原产生促进剂。
此外，发现了碱性蛋白质组分或碱性肽组分以至少每公斤大鼠体重20mg 的浓度施用才会施加促进皮肤胶原生产的作用。
[实施例4]
具有表4所示组成的促进皮肤胶原生产的饮料按常规方法生产。生产的饮 料具有良好的风味，这种风味即使在常温下保存1年后也未变差，并且不会产 生沉淀。
表4 混合的异构化的糖 15.0(重量％) 果汁 10.0 柠檬酸 0.5 碱性蛋白质组分粉末(实施例2) 0.1 调味剂 0.1
矿物质混合物 0.1 水 74.2
[实施例5]
具有表5所示组成的面团按常规方法制备、成形并烘烤来生产促进皮肤胶 原生产的饼干。
表5 面粉 50.0(重量％) 糖 20.0 盐 0.5 人造黄油 12.5 鸡蛋 12.5 水 2.5 矿物质混合物 0.8 碱性蛋白质组合物粉末(实施例2) 1.2
[实施例6]
具有表6所示组成的皮肤胶原产生促进剂按常规方法生产。
表6 结晶右旋糖一水合物 83.5(重量％) 碱性蛋白质组分粉末(实施例2) 10.0 矿物质混合物 5.0 糖酯 1.0 调味剂 0.5
[测试实施例5]
使用正常的人成纤维细胞株[CCD45SK(ATCCRL 1506)收集自白种女人的皮 肤]进行实验以检测实施例2所得的碱性蛋白质组分和实施例3所得的碱性肽 组分对皮肤胶原生产的促进作用。用含有10体积％胎牛血清(以下简称为FBS) 的改进的Eagle培养基(MEM，10-101，Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd． 生产)将正常的人成纤维细胞株以4×104细胞/孔/0.4ml的浓度接种至24孔 板。然后在含有5％二氧化碳和饱和水蒸气条件下于37℃培养24小时，接着用 含有6体积％的FBS的改进的Eagle培养基替换原培养基。然后，以0.1体积 ％的浓度将得自实施例2的碱性蛋白质组分和得自实施例3的碱性肽组分加入 各孔并培养24小时。接着分别以50μg/m1和1μCi/ml的浓度加入β-氨基丙 腈和氚-L-脯氨酸，再培养24小时得到培养基。按照Webster等所述方法(见， Analytical Biochemistry，p.220，1979)从如此获得的培养基中分级胶原组 分并测定胶原组分的放射性。注意要进行不加碱性蛋白质组分和碱性肽组分的 类似的对照实验。结果示于表7。
表7 胶原产生(％) 对照 100±2.1a 碱性蛋白质组分粉末(实施例2) 212±4.1c 碱性肽组分粉末(实施例3) 196±3.2b
数值代表了平均值±标准偏差(n＝6)。同时，不同字母之间有显著的差异。
按照该结果可以发现加入碱性蛋白质和碱性肽的组比不加的组(对照)施 加了约两倍的促进皮肤胶原产生的能力。
该结果表明，碱性蛋白质组分和碱性肽组分影响皮肤胶原成纤维细胞并具 有促进皮肤具有产量的作用，并且这说明该组分作为皮肤具有产生促进剂是有 用的。
[实施例7]
按照常规方法生产具有表8所示组成的洗剂。
表8 甘油 3(重量％) 1，3-丁二醇 3 聚氧乙烯山梨坦单油酸酯(20E.0.) 0.5 对羟基苯甲酸甲酯 0.15 柠檬酸 0.1 柠檬酸钠 1
调味剂 0.05 碱性蛋白质组分粉末(实施例2) 0.05 纯水 92.15
[实施例8]
按照常规方法生产具有如表9所示组成的软膏剂。
表9 液体石蜡 5(重量％) 白蜂蜡 4 鲸蜡醇 3 角鲨烯 10 羊毛脂 2 硬脂酸 1 聚氧乙烯山梨坦单油酸酯(20E.O.) 1.5 单硬脂酸甘油酯 3 1，3-丁二醇 6 对羟基苯甲酸甲酯 1.5 调味剂 0.1 碱性蛋白质组分粉末(实施例2) 0.5 纯水 62.4
[测试实施例6]
使用实施例7得到的洗剂和实施例8得到的软膏剂进行实践使用测试。就 进行比较的洗剂和软膏剂的组成而言，使用的洗剂和软膏剂除了不含急促蛋白 质组分以外与实施例7和8的组成相同。
20位脸上具有凹陷或细小皱纹并具有干性皮肤的成年妇女随即分为2组， 每组有10位受试者(组A和B)，而20位手上有皲裂的成年妇女随即分为2组， 每组有10位受试者(组C和D)。本发明的洗剂、进行比较的洗剂、本发明的软 膏剂和进行比较的软膏剂分别以和平常相同的方式施用于组A和组B的脸部以 及组C和组D的手和手指上，每天进行2次共10天。结果显示，本发明的洗 剂相比于进行比较的洗剂明显改善了干燥感和皮肤皲裂并具有优秀的促进皮 肤胶原产生的作用。同时，本发明的软膏剂相比于进行比较的软膏剂明显改善 了干燥感和皮肤皲裂并具有抑制天然恶化(如皮肤皲裂)的作用。
[工业实用性]
本发明提供了一种皮肤胶原产生促进剂、一种促进皮肤胶原产生的食品或 饮品和一种促进皮肤胶原产生的化妆品，以上每一种均含有源自牛奶的碱性蛋 白质组分和/或碱性肽组分作为活性成分。
本发明的皮肤胶原产生促进剂、促进皮肤胶原产生的食品或饮品和促进皮 肤胶原产生的化妆品均对皮肤具有产量具有促进作用并且在预防和治疗皮肤 皱纹、凹陷、干燥感和皮肤皲裂中有用。