本发明涉及表现出杀微生物或抑微生物作用的组合物。
背景技术
尤其是随着方便食品，例如即食膳食、汤、调味汁或快餐逐渐增加的 趋势，食品安全和食物腐败防止在全世界范围内一直为人们所关注。食物腐 败是食品制造商的重大经济问题。食品制造商需要通过提供食用安全的产品 来保护公众的健康和安全。此类食品必须具有冷藏或环境温度储藏的保证储 藏期限。消费者更喜欢口感佳的高质量食品，这难以通过化学防腐剂、苛刻 的制热工况和其他加工措施实现。食品安全和保护最好通过多个防腐体系使 用温和加工和天然防腐剂的组合方法实现。食物传播的微生物也不能适应使 用不同防腐措施保藏的食物并且不能在其中生长。
食品保护和食物腐败生物体，例如拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)的生长是备受关注的。该特定菌种是问题最多的腐败酵母之一，而且 通常是果汁、调味汁、碳酸软饮料、沙拉酱、蛋黄酱和番茄酱的主要腐败生 物体。独特生理特性，例如对抗微生物剂的独特抗性是它们能够引起腐败的 主要原因。另外，腐败生物体有时可适应不同的防腐剂和储藏条件，因此防 腐措施的组合可比单个措施的效果更好。
日益需要开发出经济的、自然的且有效的防腐体系，来满足公众对储 藏期限得到保证的便利、自然、安全、健康、优质的产品的需求。抗微生物 物质(例如来源于植物的那些)可用作食品防腐剂，以帮助满足该需求。此 类植物提取物被视为可取的，因为它们被认为是天然的。此外从监管的角度 看，由于长期使用，植物提取物通常具有GRAS(通常视为安全的)状态。 还存在利用少量抗微生物物质提供微生物保护的持续期望。因此需要提供新 型抗微生物物质或新型更有效的抗微生物物质组合。
尽管来自植物的抗微生物产品是天然来源的，但仍然期望以尽可能最 低的量使用。期望使食品中“添加剂”的量减至最少，不仅是出于成本原因 也是为了满足消费者的需要。此外，多种植物物质具有相应味道。因此，在 许多严格的食品应用中，减少植物来源的保护剂的量是有利的。
这些目标和其他目标通过本发明来实现。
在一个方面，本发明提供包含如下成分的组合物：(a)异硫氰酸烯丙 酯；和(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物，并且任选地还包 含(c)绿茶[山茶(Camellia sinensis]提取物。
在一个方面，本发明提供防止和/或抑制物质中微生物的生长，和/或杀 死物质中的微生物的方法，该方法包括如下步骤：使物质接触(a)异硫氰酸 烯丙酯；以及以下之一或两者：(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的 混合物和(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物。
在一个方面，本发明提供(a)异硫氰酸烯丙酯；以及以下之一或两者： (b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物；和(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物；用于防止和/或抑制物质中微生物的生长，和/或杀死物质 中的微生物的用途。
在一个方面，本发明提供用于制备本发明组合物的试剂盒，该试剂盒 在分开的包装或容器中包含：(a)异硫氰酸烯丙酯；和(b)有机酸，其选自乙 酸、丙酸以及它们的混合物，并且任选地还包含(c)绿茶[Camellia sinensis]提 取物；任选地附带混合和/或接触和/或使用的说明。
在一个方面，本发明提供包含保护剂组合物的食品，该组合物包含：(a) 异硫氰酸烯丙酯；和(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物，并 且任选地还包含(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物。
本文和所附权利要求中限定了本发明的另外方面。
本发明提供了防止和/或抑制物质(例如食品)中微生物的生长，和/或 杀死物质中的微生物的组分的协同组合。该组分的组合允许低水平的组分活 性剂，例如低水平的(a)异硫氰酸烯丙酯；和/或(b)有机酸，其选自乙酸、丙 酸以及它们的混合物；和/或(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物，用于提供有 效作用，以及防止对抗微生物物质耐性的形成。这在食品应用中是尤其重要 的，其中剂量的减少和/或耐性形成的避免出于商业和监管原因是所期望 的。基于以下事实协同相互作用是特别受关注的：使用相对少量的不同化合 物，从而使其负面特性的影响减至最低，可实现相对较大的抗微生物效果。 此外，主要抗微生物剂的组合将帮助靶向更宽范围的微生物，由于考虑到微 生物细胞，无论是原核生物细胞(细菌)还是真核生物细胞(酵母和真菌) 的代谢复杂性，单个物质不可能发挥所有作用。此外，微生物种群不太可能 对活性化合物组合形成抗性。
参照本发明利用的特定物质，即(a)异硫氰酸烯丙酯；以及以下之一或 两者：(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物和(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物，每个组分均具有不利特性。例如，异硫氰酸烯丙酯的使用 目前是受限的，因为其在极低浓度下具有窦刺激性芳香以及显著的芥菜味 道。高浓度绿茶[Camellia sinensis]提取物的使用会面临监管限制，因为需要 考虑组分儿茶素的允许日摄取量(ADI)值。
为便于查阅，现将在适当的章节标题下讨论本发明的这些方面和更多 的方面。但是，每个章节下的说明内容未必局限于该各章节。
具体实施方式
有机酸
如本文所讨论，本发明可利用有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的 混合物。
在一个方面，有机酸为乙酸。在一个方面，有机酸为丙酸。在一个优 选的方面，有机酸为乙酸和丙酸的混合物。
乙酸和/或丙酸可通过任何已知方法制备，或从任何来源提供。然而， 为了从天然来源提供这些组分，优选从培养产物获得这些组分。因此，在一 个优选的方面，有机酸以培养物发酵的形式提供，或从培养物发酵提供。在 一个优选的方面，乙酸以培养物发酵的形式提供，或从培养物发酵提供。在 一个优选的方面，丙酸以培养物发酵的形式提供，或从培养物发酵提供。在 一个优选的方面，乙酸和丙酸以培养物发酵的形式提供，或从培养物发酵提 供。
本领域技术人员将认识到，培养物发酵可以是任何合适的微生物，以 提供所需有机酸。在一个方面，培养物发酵从一种或多种菌株制备，所述菌 株选自谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)、丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici) 以及它们的组合。在一个方面，培养物发酵由一种或多种谢氏丙酸杆菌菌株 制备。在一个方面，培养物发酵由一种或多种嗜酸乳杆菌菌株制备。在一个 方面，培养物发酵由一种或多种丙酸丙酸杆菌菌株制备。在一个方面，培养 物发酵由一种或多种丙酸丙酸杆菌菌株和一种或多种嗜酸乳杆菌菌株的组合 制备。
可由其作为培养物发酵制备所需有机酸的另外合适微生物包括费氏丙 酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、保 加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobios)、香肠乳杆菌 (Lactobacillus farciminis)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德式乳杆菌 (Lactobacillus delbruekii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳杆 菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)和罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri)。
优选的培养物发酵为其中活性组分为基于发酵物计含量12-15重量％ 的乙酸和基于发酵物计含量20-25重量％的丙酸的发酵物。优选的培养物 发酵为其中活性组分为基于发酵物计含量7-8重量％的乙酸和基于发酵物 计含量2.5-4重量％的丙酸的发酵物。优选的培养物发酵为其中活性组分为 基于发酵物计含量7-8重量％的乙酸和基于发酵物计含量2.5-4重量％的丙 酸的培养右旋糖产物。
有机酸可以任何含量存在，以提供所需的杀微生物或抑微生物效果。 该效果通常可以在最终物质中，其中微生物生长受到抑制。因此，当本发明 提供保护剂组合物时，有机酸可以这样的含量存在使得组合物以指定含量加 入待“保护”物质时，有机酸存在于待保护物质中的含量提供了所需的杀微 生物或抑微生物效果。
在一个方面，有机酸存在的含量提供了杀微生物或抑微生物效果。
在一个方面，组合物为抗微生物保护剂组合物。在这个方面和其他方 面，优选地组合物包含基于组合物计含量至少0.5重量％的有机酸。有机酸 可以基于组合物计至少1重量％的含量存在。有机酸可以基于组合物计至少 2重量％的含量存在。有机酸可以基于组合物计至少3重量％的含量存在。 有机酸可以基于组合物计至少5重量％的含量存在。此外，有机酸可以基于 组合物计至少6重量％的含量存在。在这些方面和其他方面，优选地组合物 包含基于组合物计含量不大于15重量％的有机酸。有机酸可以基于组合物 计不大于12重量％的含量存在。有机酸可以基于组合物计不大于10重量％ 的含量存在。有机酸可以基于组合物计不大于8重量％的含量存在。有机酸 可以基于组合物计不大于7重量％的含量存在。组合物可包含基于组合物计 含量0.5至15重量％的有机酸。组合物可包含基于组合物计含量0.5至12 重量％的有机酸。有机酸可以基于组合物计1至15重量％的含量存在。有 机酸可以基于组合物计2至15重量％的含量存在。有机酸可以基于组合物 计3至12重量％的含量存在。有机酸可以基于组合物计5至12重量％的含 量存在。有机酸可以基于组合物计3至10重量％的含量存在。有机酸可以 基于组合物计5至10重量％的含量存在。此外，有机酸可以基于组合物计6 至10重量％的含量存在。
在一个方面，组合物为抗微生物保护剂组合物。在这个方面和其他方 面，优选地组合物包含基于组合物计含量至少0.5重量％的乙酸。乙酸可以 基于组合物计至少1重量％的含量存在。乙酸可以基于组合物计至少2重量 ％的含量存在。乙酸可以基于组合物计至少2.5重量％的含量存在。乙酸可 以基于组合物计至少3重量％的含量存在。此外，乙酸可以基于组合物计至 少4重量％的含量存在。组合物可包含基于组合物计含量0.5至10重量％的 乙酸。乙酸可以基于组合物计1至10重量％的含量存在。乙酸可以基于组 合物计2至10重量％的含量存在。乙酸可以基于组合物计2.5至10重量％ 的含量存在。乙酸可以3至8重量％的含量存在。乙酸可以5至8重量％的 含量存在。乙酸可以基于组合物计3至7重量％的含量存在。此外，乙酸可 以基于组合物计4至6重量％的含量存在。
在一个方面，组合物为抗微生物保护剂组合物。在这个方面和其他方 面，优选地组合物包含基于组合物计含量至少0.1重量％的丙酸。丙酸可以 基于组合物计至少0.2重量％的含量存在。丙酸可以基于组合物计至少0.5 重量％的含量存在。丙酸可以基于组合物计至少1.0重量％的含量存在。丙 酸可以基于组合物计至少1.2重量％的含量存在。此外，丙酸可以基于组合 物计至少1.5重量％的含量存在。组合物可包含基于组合物计含量0.1至5 重量％的丙酸。丙酸可以基于组合物计0.2至5重量％的含量存在。丙酸可 以基于组合物计0.5至3重量％的含量存在。丙酸可以基于组合物计1.0至3 重量％的含量存在。丙酸可以基于组合物计1.0至2.5重量％的含量存在。 丙酸可以基于组合物计1.0至2重量％的含量存在。丙酸可以基于组合物计 1.5至3重量％的含量存在。丙酸可以基于组合物计1.5至2.5重量％的含量 存在。丙酸可以基于组合物计1.5至2重量％的含量存在。此外，丙酸可以 基于组合物计4至6重量％的含量存在。
绿茶提取物
如本文所讨论，组合物可包含绿茶[Camellia sinensis]提取物。本领域技 术人员将会理解，本文所有关于绿茶提取物的提法意指来自物种山茶植株的 提取物。
本领域技术人员会认识到，术语“提取物”是指可从整株植物分离的 任何植物组分。
在优选的方面，所谓术语绿茶“提取物”意指植物的叶或可从整株植 物的叶分离的组分。
多个体外和体内研究提出了绿茶(山茶)和茶多酚的有益健康性质， 包括抗氧化和抗微生物活性[Kubo等人]。总而言之，儿茶素(类黄酮)是 绿茶的主要组分。根据YAM等人(1997)所述，儿茶素及其没食子酸盐的主 要化学部分负责绿茶提取物的抗微生物活性，而具有表构型的该物质似乎更 具活性[Yam等人、Ikigai等人、Kajiya等人]。
在一个优选的方面，绿茶提取物为茶多酚。优选地，绿茶提取物为儿 茶素。在高度优选的方面，绿茶提取物为选自如下的化合物：
以及它们的混合物。这六种化合物在本文中称为绿茶儿茶素或绿茶提 取物儿茶素。绿茶提取物包含基于绿茶提取物计大约75重量％的组合含量 的这六种儿茶素。本领域技术人员将认识到，虽然上述化合物可理想地从绿 茶植物分离，但也可通过合成途径获得。因此，在一个方面，本发明可提 供：
●组合物，其包含：(a)异硫氰酸烯丙酯；和(b)有机酸，其选自乙 酸、丙酸以及它们的混合物，并且任选地还包含(c)选自如下的化 合物：
以及它们的混合物
●防止和/或抑制物质中微生物的生长，和/或杀死物质中的微生物的 方法，该方法包括如下步骤：使物质接触(a)异硫氰酸烯丙酯；以 及以下之一或两者：(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混 合物和(c)选自如下的化合物：
以及它们的混合物。
●(a)异硫氰酸烯丙酯；以及以下之一或两者：(b)有机酸，其选自乙 酸、丙酸以及它们的混合物；和(c)选自如下的化合物中：
以及它们的混合物
用于防止和/或抑制物质中微生物的生长，和/或杀死物质中的微生 物的用途。
●用于制备本发明组合物的试剂盒，该试剂盒在分开的包装或容器中 包含：(a)异硫氰酸烯丙酯；和(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及 它们的混合物，并且任选地还包含(c)选自如下的化合物：
以及它们的混合物；
任选地附带混合和/或接触和/或使用的说明。
●包含保护剂组合物的食品，该组合物包含：(a)异硫氰酸烯丙酯； 和(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物，并且任选地 还包含(c)选自如下的化合物：
以及它们的混合物
绿茶提取物可以任何含量存在，以提供所需的杀微生物或抑微生物效 果。该效果通常可以在最终物质中，其中微生物生长受到抑制。因此，当本 发明提供保护剂组合物时，绿茶提取物以这样的含量存在使得组合物以指定 含量加入待“保护”物质时，绿茶提取物存在于待保护物质中的含量提供了 所需的杀微生物或抑微生物效果。
在一个方面，绿茶提取物存在的含量提供了杀微生物或抑微生物效 果。
本领域技术人员将会理解，绿茶提取物的含量通常以绿茶提取物提供 的儿茶素的含量表示。适用于本发明的绿茶提取物的合适的含量在下文提 供。在一个优选的方面，本文列举的绿茶提取物的含量基于绿茶提取物计包 含75重量％的儿茶素。在这个方面，本领域技术人员可修改本文列举的应 使用的绿茶提取物含量包含大于或小于75重量％的儿茶素含量。
在一个方面，组合物为抗微生物保护剂组合物。在这个方面和其他方 面，优选地组合物包含基于组合物计含量为至少0.1重量％的绿茶提取物。 绿茶提取物可以基于组合物计至少0.2重量％的含量存在。绿茶提取物可以 基于组合物计至少0.5重量％的含量存在。绿茶提取物可以基于组合物计至 少1.0重量％的含量存在。绿茶提取物可以基于组合物计至少1.5重量％的 含量存在。此外，绿茶提取物可以基于组合物计至少2.0重量％的含量存 在。组合物可包含基于组合物计含量0.1至5重量％的绿茶提取物。绿茶提 取物可以基于组合物计0.2至5重量％的含量存在。绿茶提取物可以基于组 合物计0.5至3重量％的含量存在。绿茶提取物可以基于组合物计1.0至3 重量％的含量存在。绿茶提取物可以基于组合物计1.5至3重量％的含量存 在。
在一个方面，组合物为抗微生物保护剂组合物。在这个方面和其他方 面，优选地组合物包含基于组合物计至少0.1重量％的组合含量的绿茶提取 物儿茶素，即。
绿茶提取物儿茶素可以基于组合物计至少0.2重量％的组合含量存在。 绿茶提取物儿茶素可以基于组合物计至少0.5重量％的组合含量存在。绿茶 提取物儿茶素可以基于组合物计至少1.0重量％的组合含量存在。绿茶提取 物儿茶素可以基于组合物计至少1.5重量％的组合含量存在。此外，绿茶提 取物儿茶素可以基于组合物计至少2.0重量％的组合含量存在。组合物可包 含基于组合物计0.1至5重量％的组合含量的绿茶提取物儿茶素。绿茶提取 物儿茶素可以基于组合物计0.2至3重量％的组合含量存在。绿茶提取物儿 茶素可以基于组合物计0.5至3重量％的组合含量存在。绿茶提取物儿茶素 可以基于组合物计1.0至3重量％的组合含量存在。绿茶提取物儿茶素可以 基于组合物计1.5至2.5重量％的组合含量存在。绿茶提取物儿茶素可以基 于组合物计2.0至2.5重量％的组合含量存在。绿茶提取物儿茶素可以基于 组合物计2.1至2.3重量％的组合含量存在。
异硫氰酸烯丙酯
如本文所讨论，组合物可包含异硫氰酸烯丙酯(AITC)。异硫氰酸烯丙 酯的结构为
异硫氰酸烯丙酯也可称为芥菜精油，已知具有抑细菌和抑真菌性质。 精油(EO)通常是包含芳族化合物的疏水性液体。它们主要由于酚醛特征而表 现出抗微生物活性。[3]。因此，在一个方面，异硫氰酸烯丙酯从芥菜种子 获得。在一个方面，异硫氰酸烯丙酯从黑芥(Brassica nigra)或褐色印度芥菜 (Brassica juncea)的种子获得。
在一个方面，组合物为抗微生物保护剂组合物。在这个方面和其他方 面，优选地组合物包含基于组合物计含量至少0.01重量％的异硫氰酸烯丙 酯。异硫氰酸烯丙酯可以基于组合物计至少0.05重量％的含量存在。异硫 氰酸烯丙酯可以基于组合物计至少0.1重量％的含量存在。异硫氰酸烯丙酯 可以基于组合物计至少0.15重量％的含量存在。异硫氰酸烯丙酯可以基于 组合物计至少0.2重量％的含量存在。此外，异硫氰酸烯丙酯可以基于组合 物计大约0.25重量％的含量存在。组合物可包含基于组合物计含量0.01至1 重量％的异硫氰酸烯丙酯。异硫氰酸烯丙酯可以基于组合物计至少0.05至1 重量％的含量存在。异硫氰酸烯丙酯可以基于组合物计至少0.1至1重量％ 的含量存在。异硫氰酸烯丙酯可以基于组合物计至少0.1至0.5重量％的含 量存在。异硫氰酸烯丙酯可以基于组合物计至少0.2至0.5重量％的含量存 在。异硫氰酸烯丙酯可以基于组合物计至少0.2至0.4重量％的含量存在。 此外，异硫氰酸烯丙酯可以基于组合物计0.2至0.3重量％的含量存在。
组成
本发明提供包含如下成分的组合物：(a)异硫氰酸烯丙酯；和(b)有机 酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物，并且任选地还包含(c)绿茶 [Camellia sinensis]提取物。
优选地，组分(c)是存在的，并且组合物包含：
(a)异硫氰酸烯丙酯；
(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物；和
(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物。
(a)、(b)和(c)中的每个的各自优选含量可组合，以提供优选的组合物。 在一个方面，组合物包含：
-基于组合物计含量至少0.1重量％的异硫氰酸烯丙酯；
-基于组合物计含量至少2重量％的乙酸；
-基于组合物计含量至少0.5重量％的丙酸；和
-基于组合物计含量至少1.0重量％的绿茶提取物。
优选的组合物包含：
其中：
(a)异硫氰酸烯丙酯；和
(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物以及任选地
(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物
存在的含量就酵母、霉菌或酵母和霉菌二者而言，提供了杀微生物或抑微生 物协同效果。在另外优选的方面，物质存在的含量(i)就酵母、霉菌或酵母和 霉菌二者而言以及(ii)就革兰氏阴性菌而言，提供了杀微生物或抑微生物协 同效果。
本发明的组合物可用于任何所需的应用。在一个方面，组合物为适于 添加到食品的保护剂组合物。
本发明的组合物或者供在本发明中使用的组合物可含有一种或多种附 加组分。然而，在一些方面，本发明的保护剂组合物(适于添加到食品中) 不含附加组分，或者不含会实质上影响该组合物的性质的附加组分。
本发明的组合物或适用于本发明的组合物可包含一种或多种选自如下 的附加组分：培养物、发酵副产物、细菌素、植物提取物、酶、有机酸以及 它们的混合物。优选的培养物包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)发酵物和 清酒乳杆菌发酵物。优选的精炼代谢物包括MicroGARD CS1-50、CM1- 50、尼萨普林、尼生素、片球菌素和沙克乳杆菌细菌素。优选的植物提取物 在下文列出。优选的酶包括蛋白溶菌酶。优选的有机酸包括乳酸。
在一个优选的方面，组合物还包含(另外的)植物提取物。优选地， 植物提取物选自：啤酒花提取物(包含α和β酸、律草酮和蛇麻酮)、迷迭 香提取物(包含鼠尾草酸)、香草醛、肉桂提取物(包含反式肉桂醛)、松 树皮提取物、葡萄提取物、白藜芦醇、赤松素、马栗树、鼠尾草、百里酚、 丝兰提取物、覆盆子和柑橘生物类黄酮。
在一个优选的方面，组合物还包含乳化剂。优选地，乳化剂选自聚氧 乙烯脱水山梨糖醇酯(E432-E436)，或者称为聚山梨醇酯(如Tween80、 Tween20)、甘油单酯、甘油二酯、甘油单酯-甘油二酯的乙酸酯、甘油单 酯-甘油二酯的酒石酸酯和甘油单酯-甘油二酯的柠檬酸酯。
在一个优选的方面，组合物还包含螯合剂。优选地，螯合剂选自 EDTA、柠檬酸、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯和多磷酸酯。
另外的合适螯合剂在US5573801中提出，并且包括羧酸、聚羧酸、氨 基酸和磷酸酯。具体地讲，可使用以下化合物以及它们的盐：
乙酸、腺嘌呤、己二酸、ADP、丙氨酸、β-丙氨酸、白蛋白、精氨酸、 抗坏血酸、天冬酰胺、天冬氨酸、ATP、苯甲酸、正丁酸、酪蛋白、柠康 酸、柠檬酸、半胱氨酸、脱氢乙酸、脱铁-正铁5，7-二羟基黄酮、脱铁-铁色 素、脱铁-铁草氨菌素E、3，4-二羟基苯甲酸、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、 丁二酮肟、O，O-二甲基红紫棓精、EDTA、甲酸、富马酸、球蛋白、葡萄糖 酸、谷氨酸、戊二酸、甘氨酸、乙醇酸、双甘氨肽、甘氨酰肌氨酸、鸟苷、 组胺、组氨酸、3-羟基黄酮、肌苷、三磷酸肌苷、无铁铁色素、异戊酸、衣 康酸、曲酸、乳酸、亮氨酸、赖氨酸、马来酸、苹果酸、甲硫氨酸、水杨酸 甲酯、次氮基三乙酸(NTA)、鸟氨酸、正磷酸盐、草酸、羟基硬脂精、β-苯 丙氨酸、磷酸、肌醇六磷酸、庚二酸、新戊酸、聚磷酸盐、脯氨酸、丙酸、 嘌呤、焦磷酸盐、丙酮酸、核黄素、水杨醛、水杨酸、肌氨酸、丝氨酸、山 梨醇、琥珀酸、酒石酸、四偏磷酸盐、硫代硫酸盐、苏氨酸、三偏磷酸盐、 三磷酸盐、色氨酸、尿苷二磷酸、尿苷三磷酸、正戊酸、缬氨酸、香草醛和 黄嘌呤核苷。
多种上述多价螯合剂可以它们的盐的形式用于食品加工，它们通常为 碱金属或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐或季铵盐。具有多价态的多价 螯合化合物可有利地用于调整pH或例如向食品体系涂料选择性引入或提取 金属离子。螯合剂的附加信息在T.E.Furia(Ed.)，CRC Handbook of Food Additives，2nd Ed.，pp.271-294(1972，Chemical Rubber Co.)(T.E.Furia编 辑，《CRC食品添加剂手册》，第2版，第271-294页，1972年，化学橡 胶公司)和M.S.Peterson and A.M.Johnson(Eds.)，Encyclopaedia of Food Science，pp.694-699(1978，AVI Publishing Company，Inc.)(M.S.Peterson和 A.M.Johnson编辑，《食品科学百科全书》，第694-699页，1978年，AVI 出版公司)中有所公开，它们二者的文章据此以引用方式并入。
术语“螯合剂”被定义为能够与金属形成配位络合物的有机或无机化 合物。同样，如本文所用，术语“螯合剂”包括分子包封化合物，例如环糊 精或麦芽糖糊精。螯合剂可以是无机的或有机的，但优选地为有机的。
优选的螯合剂是对哺乳动物无毒的，并且包含氨基聚羧酸以及它们的 盐，例如乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐(尤其是其二钠和三钠盐)和羟羧酸 以及它们的盐，例如柠檬酸。然而，据信非柠檬酸和非柠檬酸羟羧酸螯合剂 也可用于本发明，例如乙酸、甲酸、乳酸、酒石酸以及它们的盐。
如上所述，术语“螯合剂”在本文中定义为并且用作多价螯合剂的同 义词，并且还定义为包括分子包封化合物，例如环糊精。环糊精是具有六 个、七个或八个排列成环形图的葡萄糖单体的环状碳水化合物分子，它们分 别表示α、β或γ环糊精。如本文所用，环糊精是指未改性的和改性的环糊 精单体和聚合物。环糊精分子包封剂可从印第安纳州哈蒙德的美国玉米产品 公司(American Maize-Products of Hammond，Ind)商购获得。环糊精还在 Chapter11entitled，“Industrial Applications of Cyclodextrin”，by J.Szejtli，page 331-390of Inclusion Compounds，Vol.III(Academic Press，1984)(J.Szejtli， 第11章，“环糊精的工业应用”，《包含化合物》，第III卷，第331-390 页，学术出版社，1984年)中有所描述，该章节据此以引用方式并入。
在一个优选的方面，异硫氰酸烯丙酯与环糊精络合。在这个方面，异 硫氰酸烯丙酯很容易以粉末的形式提供。
在一个优选的方面，有机酸与麦芽糖糊精混合。
在一个优选的方面，绿茶提取物与麦芽糖糊精混合。在这个方面，绿 茶提取物可更容易以标准化形式提供。
优选地，螯合剂提高了抗微生物物质的抗微生物活性和/或抗微生物 谱。更优选地，就革兰氏阴性菌和其他微生物而言，螯合剂提高了抗微生物 物质的抗微生物活性和/或抗微生物谱。
在一个优选的方面，组合物还包含分解酶。优选地，
分解酶是溶菌酶。
微生物
在本发明的语境中，术语“抗微生物”旨在表示存在杀细菌和/或抑细 菌和/或杀真菌和/或抑真菌效果和/或杀病毒效果，其中
术语“杀细菌”应当理解为能够杀死细菌细胞。
术语“抑细菌”应当理解为能够抑制细菌生长，即抑制生长中的细菌 细胞。
术语“杀真菌”应当理解为能够杀死真菌细胞。
术语“抑真菌”应当理解为能够抑制真菌生长，即抑制生长中的真菌 细胞。
术语“杀病毒”应当理解为能够使病毒失活。
术语“微生物细胞”表示细菌或真菌细胞，并且术语微生物表示真菌 (包括酵母)或细菌。
在本发明的语境中，术语“抑制微生物细胞的生长”旨在表示细胞处 于非生长状态，即它们不能繁殖。
如本文所讨论，本发明可防止和/或抑制物质中微生物的生长，和/或杀 死物质中的微生物。这可以使减缓或阻止微生物，例如细菌的生长，或杀死 存在的接触本发明组合物的微生物。
在高度优选的方面，杀微生物或抑微生物效果为杀细菌或抑细菌效 果。
就酵母、霉菌或酵母和霉菌二者而言，杀微生物或抑微生物效果是有 利的。优选地，杀微生物或抑微生物效果是(i)就酵母、霉菌或酵母和霉菌二 者而言，以及(ii)就革兰氏阴性菌而言。
在优选的方面，杀微生物或抑微生物效果就选自如下物种的生物体而 言：拜氏接合酵母、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母 (Candida tropicalis)、曲霉属(Aspergillus spp.)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、青霉属(Penicillum spp.)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
在优选的方面，杀微生物或抑微生物效果就选自如下物种的生物体而 言：拜氏接合酵母、热带假丝酵母、寄生曲霉和荧光假单胞菌。
食品
本发明的组合物、方法和用途可防止和/或抑制任何物质中微生物的生 长，和/或杀死任何物质中的微生物。然而，考虑到与食品腐败和污染相关 的问题和考虑到本发明在食品中的特别有效性，优选地，该组合物是食品或 者可添加到食品中。各组分可能已经依序添加到该食品中。在一个另外方 面，一种或多种组分可在食品中原位形成。例如，有机酸和/或AITC可在 食品中原位形成。
本发明还可涵盖将本文所定义的抗微生物组合物用于食品和/或饲料酶 组合物的用途，并且可涵盖包含本文所定义的抗微生物组合物的食品和/或 饲料组合物。此类组合物可包含一种或多种另外的食品成分或添加剂。通过 配制食品和/或饲料组合物中的本发明抗微生物组合物，可稳定组合物，以 允许在用于食品和/或饲料生产前长期储藏(在合适的条件下)。此外，本 发明的抗微生物组合物提供安全用于食品和/或饲料制备应用的合适形式的 抗微生物剂，或用于食品和/或饲料制备的成分。此类组合物可以是液体、 半液体、结晶、盐或固体/颗粒形式。
在一个方面，本发明的组合物是适合添加到食品中的抗微生物保护剂 组合物。
许多食品可通过本发明进行保护。典型的食品为：
佐餐调味汁-用作佐餐调味汁的调味汁包括多用途调味汁，可用作佐餐 调味汁、腌泡汁和/或烹饪调味汁(如，在炒、蒸等等期间)，例如沙司， 包括新鲜沙司或烤肉(BBQ)调味汁。对于每个国家，各种类型的发酵调味汁 存在于不同区域，并且包括其不同变体。例子包括棕色调味汁、辣椒、伍斯 特沙司、李子酱、肉类薄荷酱、塔塔酱、肉类苹果酱、辣根、肉类越橘酱等 以及牡蛎酱、海鲜酱等。
大豆类调味汁-大豆类发酵调味汁。例子包括共混有大豆类调味汁的老 抽和生抽，如-照烧(含添加糖和味醂的共混酱油)-寿喜烧(含添加糖、味 醂和汤汁)-串烧(含添加味醂、清酒、糖)。
意大利面调味汁-直接添加到煮熟的意大利面或提前加热几分钟，或者 添加到新鲜原料，如肉或蔬菜，以及加热制成随后添加到煮熟意大利面的调 味汁。例子包括波伦亚酱、培根蛋酱、蘑菇酱、番茄酱、蔬菜酱、香蒜酱 等。
湿/烹饪调味汁-液体(即非脱水)配方烹饪调味汁/糊，其添加到原料 (肉和/或蔬菜)以制成餐食。这包括可在烹饪过程(腌泡)前和/或烹饪过 程(如蒸、烤、炒、炖等)期间添加的配方调味汁/糊。
干调味汁/粉末混合物-在食用前添加沸水或牛奶的干调味汁。这里包括 干配方粉末混合物和干粉腌泡汁。一些干调味汁可能需要在炉上加热，以便 在添加水/牛奶后浓缩调味汁。例子包括荷兰辣酱油、白调味汁、辣椒酱、 酸甜酱、意大利面肉酱等。
常规沙拉酱(标准现成的)、干沙拉酱(即包装于小袋中的粉末，与 油/醋混合)也包括在内，虽然它们不是即食型。例子包括油类产品、千岛 酱、蓝纹奶酪、凯撒酱、沙拉奶油、牧场酱等。
低脂肪沙拉酱-例子包括油类产品、千岛酱、蓝纹奶酪、凯撒酱、沙拉 奶油、牧场酱等。
香醋-包括所有醋类沙拉酱。例子包括香醋。
其他调味汁、酱和调味品例子包括1)非发酵佐餐调味汁2)芥末3)非配 方泥、糊(如大蒜泥/糊)4)干腌泡汁5)干配方粉末混合物(如法西塔香料 混合物)5)脱水配方糊状物/涂料(用于烹饪，如油炸、烤、烘焙)。
汤：罐装汤-包括所有品种的即食或浓缩(含待添加的水)形式罐装 汤。块状或蒸煮袋形式的即食或浓缩汤也归为UHT汤。例子包括混合蔬菜 汤、豌豆汤、韭葱汤、鱼汤、蘑菇汤、番茄汤、鸡汤、肉汤、牛肉汤、鸡肉 和蘑菇汤、杂烩汤等。
脱水汤-粉末汤，在食用前添加水，然后煮几分钟。
即食汤-粉末汤，临到食用前向其中添加沸水。
冷汤-由新鲜原料制成的汤，保存在冷冻柜里。这些产品通常具有有限 的贮藏期限
UHT汤-包括所有品种的即食或浓缩(含待添加的水)形式的汤，在环 境下销售(即未保存于冷冻柜里)。产品类型包括混合蔬菜汤、豌豆汤、韭 葱汤、鱼汤、蘑菇汤、番茄汤、鸡汤、肉汤、牛肉汤、鸡肉和蘑菇汤
速冻汤-包括所有品种以冷冻形式销售的汤。产品类型包括混合蔬菜 汤、豌豆汤、韭葱汤、鱼汤、蘑菇汤、番茄汤、鸡汤、肉汤、牛肉汤、鸡肉 和蘑菇汤、杂烩汤等。
另外的应用领域包括：
-烘焙食品，包括精制焙烤食品、中度和高度水分精制焙烤产品，例 如松饼、玉米饼、华夫饼、薄烤饼、比萨、酥皮糕点、海绵蛋糕等 等，
-饮料，包括含水果、含蔬菜和含乳饮料
-乳制品，包括酸奶、酸奶油、奶酪、农家干酪
-水果制品、果酱、果冻、蜜饯
-冷藏和冷冻预制餐食(包含肉/蔬菜/谷物)、蘸料(包含蔬菜/乳/ 谷物)、熟食沙拉和其他预制佐菜(包含肉/蔬菜/谷物)。
在一个方面，食品选自沙司、烤肉(BBQ)调味汁和牧场酱。在一个方 面，食品为沙司。在一个方面，食品为烤肉(BBQ)调味汁。在一个方面，食 品为牧场酱。
在此所用的术语“食品”是指适于人类和/或动物食用的物质。
适当地，如本文所用的术语“食品”可以指即可食用形式的食品。然 而，作为另外一种选择或除此之外，如本文所用的术语“食品”可以指用于 食品制备的一种或多种食物物料。仅以举例的方式，术语食品涵盖由生面团 制得的烘焙食品以及在制备所述烘焙食品时使用的生面团。
在另一方面，根据本发明的食品可为动物饲料。动物饲料可适当地为 宠物食品。根据本发明的食品可为选自液体调味剂和风味增强剂、干的风味 增强剂、犒赏食物(尤其是半湿润犒赏食物)、粗磨食物和饲料的动物饲 料。
在一个方面，优选地食品选自如下的一种或多种：即食加工餐食，例 如即食意大利面、即食意大利面调味汁、即食肉类、即食蔬菜和即食蔬菜调 味汁、即食佐菜例如熟食沙拉，尤其是卷心菜沙拉、鸡肉沙拉、番茄沙拉； 以及香醋、酱和调味汁，尤其是烤肉调味汁、番茄类调味汁、意大利面调味 汁和沙拉酱。
根据本发明的食品优选地为包含水分的食品。适当地，食品可含有10- 99％的水，适当地含14-99％的水，适当地含18-99％的水，适当地含20- 99％的水，适当地含40-99％的水，适当地含50-99％的水，适当地含70- 99％的水，适当地含75-99％的水。
抗微生物组合物通常通过使抗微生物组合物接触食品原料来掺入食 品，以制造保护的食品。这可在食品的正常生产期间进行。在另外的方面， 抗微生物组合物可通过浸渍或表面涂覆食品来施用到食品，所述施用通过将 组合物喷涂在食品的表面上，或通过将组合物施用到浇铸物或涂料或可食用 膜来进行。
在另外的方面，组合物可混合到食品中。
在一个方面，食品可包含基于食品计含量不大于30,000ppm的组合 物。在一个方面，食品可包含基于食品计含量不大于15,000ppm的组合物。 在一个方面，食品可包含基于食品计含量不小于1,000ppm的组合物。在一 个方面，食品可包含基于食品计含量不小于2,500ppm的组合物。例如，食 品或抗微生物保护物质可包含
●基于食品计含量不大于25,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量不大于20,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量不大于15,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量不大于10,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量不大于7,500ppm的组合物，或
●基于食品计含量不小于500ppm的组合物，或
●基于食品计含量不小于1,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量不小于2,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量不小于3,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量不小于5,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量为2,500至30,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量为5,000至20,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量为1,000至15,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量为5,000至15,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量为大约10,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量不大于150ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不大于100ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不大于50ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不大于40ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不大于37.5ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不小于2ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不小于2.5ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不小于5ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不小于10ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不小于15ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不小于20ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不小于25ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量为20至150ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量为20至100ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量为25至50ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量为2至40ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量为2.5至37.5ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量为大约35ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不大于12,000ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不大于10,000ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不大于5,000ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不大于2,000ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不大于1,500ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不大于1,300ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不大于1,275ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不大于1,200ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不小于20ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不小于40ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不小于60ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不小于80ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不小于85ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不小于100ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不小于200ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不小于500ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不小于1,000ppm的有机酸，或
●基于食品计含量为200至12,000ppm的有机酸，或
●基于食品计含量为500至10,000ppm的有机酸，或
●基于食品计含量为1,000至5,000ppm的有机酸，或
●基于食品计含量为80至1,500ppm的有机酸，或
●基于食品计含量为85至1,275ppm的有机酸，或
●基于食品计含量为大约1,150ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不大于5,000ppm的乙酸，或
●基于食品计含量不大于2,000ppm的乙酸，或
●基于食品计含量不大于1,000ppm的乙酸，或
●基于食品计含量不大于900ppm的乙酸，或
●基于食品计含量不小于50ppm的乙酸，或
●基于食品计含量不小于60ppm的乙酸，或
●基于食品计含量不小于100ppm的乙酸，或
●基于食品计含量不小于200ppm的乙酸，或
●基于食品计含量不小于500ppm的乙酸，或
●基于食品计含量为100至5,000ppm的乙酸，或
●基于食品计含量为200至2,000ppm的乙酸，或
●基于食品计含量为500至1,000ppm的乙酸，或
●基于食品计含量为60至1,000ppm的乙酸，或
●基于食品计含量为60至900ppm的乙酸，或
●基于食品计含量为大约800ppm的乙酸，或
●基于食品计含量不大于5,000ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不大于2,000ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不大于1,000ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不大于750ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不大于500ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不大于400ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不大于375ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不小于20ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不小于25ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不小于50ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不小于100ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不小于200ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不小于300ppm的丙酸，或
●基于食品计含量为100至5,000ppm的丙酸，或
●基于食品计含量为200至2,000ppm的丙酸，或
●基于食品计含量为300至1,000ppm的丙酸，或
●基于食品计含量为20至400ppm的丙酸，或
●基于食品计含量为25至375的丙酸，或
●基于食品计含量为大约350ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不大于300ppm的绿茶提取物(当包含75％儿茶素 时)，或
●基于食品计含量不大于200ppm的绿茶提取物(当包含75％儿茶素 时)，或
●基于食品计含量不大于150ppm的绿茶提取物(当包含75％儿茶素 时)
●基于食品计含量不小于10ppm的绿茶提取物(当包含75％儿茶素 时)
●基于食品计含量不小于15ppm的绿茶提取物(当包含75％儿茶素 时)
●基于食品计含量不小于100ppm的绿茶提取物(当包含75％儿茶素 时)
●基于食品计含量不小于120ppm的绿茶提取物(当包含75％儿茶素 时)
●基于食品计含量不小于130ppm的绿茶提取物(当包含75％儿茶素 时)
●基于食品计含量为100至300ppm的绿茶提取物(当包含75％儿茶 素时)
●基于食品计含量为10至200ppm的绿茶提取物(当包含75％儿茶 素时)
●基于食品计含量为15至200ppm的绿茶提取物(当包含75％儿茶 素时)
●基于食品计含量为120至200ppm的绿茶提取物(当包含75％儿茶 素时)
●基于食品计含量为130至150的绿茶提取物(当包含75％儿茶素 时)
●基于食品计含量为大约135ppm的绿茶提取物。
在一个方面，食品包含的组合物含量可使得在加工后，尤其是在加热 后，食品包含上述含量的组合物。本领域技术人员将会知道，食品的加工， 尤其是加热可减少活性保护剂组合物的含量。因此，在一个方面，食品可包 含基于食品计含量不大于30,000ppm的组合物，其中食品任选地经过后续加 工，尤其是加热。例如，食品或抗微生物保护物质可包含
●基于食品计含量不大于25,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量不大于20,500ppm的组合物，或
●基于食品计含量不大于15,000ppm的组合物，或
●基于食品计含量不大于100ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不大于75ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不大于60ppm的异硫氰酸烯丙酯，或
●基于食品计含量不大于36,000ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不大于30,000ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不大于24,000ppm的有机酸，或
●基于食品计含量不大于24,000ppm的乙酸，或
●基于食品计含量不大于18,000ppm的乙酸，或
●基于食品计含量不大于12,000ppm的乙酸，或
●基于食品计含量不大于18,000ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不大于12,000ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不大于6,000ppm的丙酸，或
●基于食品计含量不大于675ppm的绿茶提取物，或
●基于食品计含量不大于375ppm的绿茶提取物，或
●基于食品计含量不大于300ppm的绿茶提取物，
其中食品任选地经过后续加工，尤其是加热。
方法
如本文所讨论，在一个方面，本发明提供防止和/或抑制物质中微生物 的生长，和/或杀死物质中的微生物的方法，该方法包括如下步骤：使物质 接触
(a)异硫氰酸烯丙酯；以及以下之一或两者：
(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物
(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物。
在一个方面，该方法包括如下步骤：使物质接触
(a)异硫氰酸烯丙酯；和
(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物。
在一个方面，该方法包括如下步骤：使物质接触
(a)异硫氰酸烯丙酯；和
(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物。
在一个方面，该方法包括如下步骤：使物质接触
(a)异硫氰酸烯丙酯；
(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物；和
(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物。
在一个方面，接触物质是同时进行的。在一个方面，接触物质是按顺序进行 的。
如本文所讨论，在一个方面，本发明提供
(a)异硫氰酸烯丙酯；以及以下之一或两者：
(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物
(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物；
用于防止和/或抑制物质中微生物的生长，和/或杀死物质中的微生物的用 途。
在一个方面，
(a)异硫氰酸烯丙酯；和
(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物；
用于防止和/或抑制物质中微生物的生长，和/或杀死物质中的微生物。
在一个方面，
(a)异硫氰酸烯丙酯；和
(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物；
用于防止和/或抑制物质中微生物的生长，和/或杀死物质中的微生物。
在一个方面，
(a)异硫氰酸烯丙酯；
(b)有机酸，其选自乙酸、丙酸以及它们的混合物；和
(c)绿茶[Camellia sinensis]提取物；
用于防止和/或抑制物质中微生物的生长，和/或杀死物质中的微生物。
现将仅以举例方式更详细地描述本发明，同时参考以下附图：-
图1至8为曲线图。
现将在以下实例中更详细地描述本发明。
实例
样品物质
表1列出了用于本研究的不同化合物以及它们的组合，它们从商业来 源获得，然后共混。
表1：样品列表
*配方中使用的浓度基于监管限制和感觉限制
每种FP1000混合物给出的％基于混合物的总重量计。
细菌培养物的制备
用于抗微生物活性评估的靶菌株是不同来源的分离体，如客户、国家 菌株保藏中心(如DSMZ、ATCC)提供、保藏于丹麦布拉布兰丹尼斯克公 司的丹尼斯克培养物保藏中心(Danisco Culture Collection，DCS，Danisco， Brabrand，Denmark)、以合适的含甘油50％(v/v)的肉汤保存在-86℃下的食物 腐败分离体、腐败生物体。选择菌株以代表革兰氏阴性菌和真菌菌株。所有 物种在有氧条件下使用。在每次实验前，储存培养物在合适的培养基和温度 下通过两个连续生长周期繁殖。过夜培养物用盐水溶液稀释，以得到工作培 养物。
霉菌孢子接种物按如下方法制备：将大约2ml无菌去离子水用于从过 度生长的霉菌上洗掉孢子(最少5天的旧平板)。将该悬浮液转移到无菌容 器中。
酵母和霉菌菌株在25℃下温育，细菌分离体在30℃有氧条件下生长， 取决于特定菌株的优选条件(方法No AP-002)。
表2：测试的指示菌株
最小抑制浓度的确定
最小抑制浓度测定(MIC)是基于液体的96孔测定法，其为自动化评估 系统而开发，并且基本上如(方法No AP-003)所述执行。通过假设的抗微 生物物质以及它们的组合，使用宽浓度范围(取决于化合物)，在这种情况 下通过在pH6.0(±0.2)下执行每个样品的2/3-稀释系列来测试指示菌株(表 2)的生长抑制。从10倍稀释的过夜培养物，将5μl每个菌株接种于一个孔 中，对应于大约103-104个细胞/孔的接种密度。对于酵母和霉菌，所用的培 养基为YM肉汤，对于细菌分离体为CASO肉汤。菌株在24℃或30℃下根 据菌株接种24至48小时。将温育后光密度(O.D.)的增加与生长对照物比 较，以估计物质是否具有抑细菌效果，并且确定MIC。MIC定义为抑制可 测量生长的抗微生物剂最低浓度。抑细菌效果定义为ODs20小于或等于温育 后生长对照物的20％。
为了获得更准确的估计值，使用Excel宏处理原始数据。宏扫描原始数 据，并且查找位于O.D.20％阈值任何一侧的两个浓度。然后，其使用线性 相关精确定位O.D.跨过阈值处的实际浓度。所有数据以每种微生物两个平 行样的平均值表示。
MIC测定法在完全自动化评估系统上运行，该系统由9-hotel Cytohotel (热电公司(Thermo))、Biomek FxP移液机械手(贝克曼库尔特公司 (Beckman Coulter))、3米轨道上的ORCA机械臂(贝克曼库尔特公司 (Beckman Coulter))、2个Synergy HT分光光度计(贝欧特公司(Biotek))、 Cytomat6001培养箱(热电公司(Thermo))和Cytomat2C培养箱(热电公司 (Thermo))组成。
结果
最小抑制浓度的确定
在芥菜精油(MEO-S)、绿茶提取物(GTE)和OA-F的单个化合物、2组分 体系以及所有三个组分的组合的存在下考察测试菌株的生长。
表3至6包括了MEO-S(A)、OA-F(B)和GTE(C)的可能组合对6种酵 母和3种霉菌以及对革兰氏阴性菌的最小抑制浓度(MIC)。出于比较目的， 表中还包括单独每种组分及其在引起测试菌株全抑制的组合浓度下存在(计 算)的MIC(ppm)数据。
所有获得的最小抑制浓度数据以每种微生物两个平行样的平均值表 示。MIC值越小，抑细菌活性水平越高。
下面图1至图3示出了本发明的配方中单个组分对革兰氏阴性生物以 及酵母和霉菌的显著效力，其中图1示出了MEO-S，图2示出了GTE，图 3示出了OA-F的效果。
MEO-S(表3)对酵母和霉菌的最小抑制浓度在38和380ppm之间。 这些研究结果表明，MEO-S的活性组分异硫氰酸烯丙酯(AITC)可为食品防 腐的潜在天然抗真菌剂。芥菜精油抑制细菌菌株的活性似乎无效。革兰氏阴 性菌通常不被芥菜精油产物抑制，或仅被中度抑制。如果在0.13mg/mL至 5mg/mL的测试范围内，对革兰氏阴性菌的最小抑制浓度为通常很高的 4.2mg/mL，尤其是考虑到该类型化合物的感官影响。
OA-F对指示菌株生长的影响在0.78mg/mL至30mg/mL的范围内考察。 与生长对照物相比，对于大多数测试菌株仅观察到最终生长的很小差异。在 高浓度(10.3mg/mL)发酵物下，荧光假单胞菌的生长在某种程度上受到抑 制。粘红酵母是最敏感的酵母。对于该菌株观察到3.28mg/mL的MIC。
绿茶提取物的抗微生物活性也在表3中示出。GTE对革兰氏阴性菌的 平均MIC为4.13mg/mL，比对酵母菌株的平均抑制浓度(4.9mg/mL)稍低。然 而，测试霉菌对GTE最敏感，平均在0.78mg/mL下受到抑制。
由于考虑到微生物细胞，无论是原核生物细胞(细菌)还是真核生物 细胞(酵母和真菌)的代谢复杂性，单个物质不可能发挥所有作用。当上述 物质的组合用于配方时，由于多种作用模式可能得到更有效的细胞裂解。因 此，不仅观察到更宽的抑制谱，而且控制单个微生物所需的浓度更低。组合 中单个化合物抑制浓度的降低是协同作用的指示。MEO、GTE和OA-F的 协同组合使单个组分的效力最多增加136倍。这在图2中可见(也可参见表 3)，如对于测试菌株近平滑假丝酵母，其中GTE单独仅在4mg/mL下与精 油和发酵物组合抑制酵母，仅需要0.029mg/mL的植物提取物来控制酵母。 考虑所有考察的测试菌株，组合中GTE的抗微生物活性通常比单个化合物 高5至136倍。
就OA-F而言，显示出对寄生曲霉的效力比单个组分高最多115倍，如 可在图3中示出(也可参见表3)，其中OA-F在30mg/mL的浓度下不足以 抑制霉菌的生长。相比之下，与精油和植物提取物的组合仅需要0.26mg/mL 发酵物来控制霉菌。
正如对于GTE和OA-F，对于MEO，3种化合物的组合也可得到协同 效果，比单个化合物的抑制浓度低3至25倍，如分别可在图1和表3中可 见。
本发明的协同组合“FP1000-S”对酵母和霉菌生物体的MIC在 0.55mg/mL至5.4mg/mL的范围内，并且对革兰氏阴性菌的MIC在5.8mg/mL 至＞10mg/mL的范围内(表3，列“FP1000-S”)。
比较3组分体系的MIC值与可能的2组分组合的MIC值，可以看出 “FP1000-S”比MEO和OA-F组合的效力高15％(表4，MIC值列 “FP1000-AB”)，比MEO和GTE组合的效力高40％(表5，MIC值列 “FP1000-AC”)，甚至比OA-F和GTE组合的效力高70％(表6，MIC值 列“FP1000-BC”)。此外，尤其是就革兰氏阴性测试菌株而言， “FP1000-S”中的抑制谱比2组分组合中的抑制谱更广。例如，在5.4至 10mg/mL的“FP1000-S”浓度范围中，在实验结束时达到的光密度比大肠杆 菌和肠炎沙门氏菌的对照值稍低。然而，“FP1000-AB”和“FP1000-BC” 的组合不抑制这些测试菌株的生长。“FP-1000-AC”在较高浓度下抑制革 兰氏阴性菌生长但并不抑制荧光假单胞菌生长。
结论
本发明的新配方包含经批准可直接用于食品(经FDA认可为GRAS) 或经证明对人类接触和环境安全的组分。
包含所有3种组分芥菜精油、OA-F和绿茶提取物的配方对抑制革兰氏 阴性菌和酵母以及霉菌是最有效的，平均最小抑制活性分别为0.86mg/mL、 0.3mg/mL和0.12mg/mL。此外，所述组合的协同性质允许低剂量的单个组 分。
芥菜精油和OA-F组合显示出的效力比3组分体系低15％。芥菜精油和 绿茶的效力甚至低40％，OA-F和绿茶的效力平均低70％。
除3组分配方的显著降低的最小抑制浓度之外，还观察到与2组分共 混物相比更宽的抑制谱。
应用研究-BBQ调味汁
本研究的目的是监测两种浓度的本发明抗真菌剂(YM10)对巴氏消毒的 BBQ调味汁中腐败酵母和霉菌的效果，从而评估该产品与200 现有技术竞争发酵物和山梨酸钾相比的潜力。
本发明的抗真菌剂由来自褐色芥菜的异硫氰酸烯丙酯、来自绿茶的儿 茶素以及来自丙酸杆菌属发酵物的有机酸组成，将所述抗真菌剂以1％和 0.5％的浓度加入，BBQ调味汁(pH3.8)分别经受500至1000CFU/ml的预定 接种率的4种酵母物种库和4种霉菌物种库。
挑战研究的实验结果显示，0.5％(w/w)的本发明抗真菌剂(YM10)提供 了对测试菌株的杀菌效果，并且与储藏至少15周的基准山梨酸钾竞争。
竞争抗微生物剂和200分别以1.25％和1％利用，在所施 用的测试条件下不能令人信服地保护测试的BBQ调味汁免于酵母腐败，因 为与未经防腐的对照物相比，仅观察到稍微推迟。
在20℃下温育，霉菌未找到适于BBQ调味汁的底物。未检测到可见的 霉菌生长。
总之，本研究的结果表明，当保藏在环境温度(20℃)下时，本文考 察的抗真菌配方即本发明的抗真菌剂(YM10)具有控制接种酵母(500- 1000CFU/g)库在BBQ调味汁(pH＜4.0)中过度生长的潜力。
介绍
本发明的抗真菌剂(YM10)包含来自褐色芥菜的异硫氰酸烯丙酯(AITC) (以得自三菱食品公司(Mitsubishi Food，Inc.)的WasaOURO D的形式)、绿 茶儿茶素(得自太阳铁工(Taiyo Ltd.)的水提取绿茶)和来自丙酸杆菌属发酵 物的有机酸(以200的形式)。
当在体外和原位测试时，共混物及其单个组分具有经验证的抗真菌和 抗细菌活性。为了证明本发明抗真菌剂(YM10)在烹饪产品，例如BBQ调味 汁中的潜在用途，进行挑战研究，其目的是监测新开发的共混物在原位以不 同剂量的功能共混物对腐败酵母和霉菌的效果，基准为山梨酸钾、竞争产品 和Danisco抗微生物产品200(表7)。
BBQ调味汁被选为代表性烹饪产品，其预期贮藏期限为90天。
表7：考察的抗微生物剂及其组合物
实验
含有以及不含实验共混物的BBQ调味汁的样品(配方见表9)在布拉 布兰的丹尼斯克烹饪应用实验室(Danisco Culinary Application Laboratory， Brabrand)制备。变量的设计旨在表明，概念抗真菌剂在本发明的水平上的 抗真菌效果的可行性，基准为常用水平的山梨酸钾、竞争产品和 200。
每批分为(方案表8)90克试样，并且置于无菌瓶中。分别地，每批 的42个试样接种所需水平的酵母，每批的5个试样接种霉菌孢子，目标接 种率为500至1000CFU/g。
粘稠产品在接种的10分钟内充分混合(2分钟)，以确保种菌均匀分 布于整个产品中。一个样品保留未接种，用作阴性对照来监测天然污染菌 群。所有样品在环境温度(20℃)下温育，并且进行酵母测定，接种于适当 酵母培养基上，分别直到确认失败(≥1.0E+06CFU/g)或直到可见霉菌生长。 平行地，分别监测所有批次和非接种盲测中MRS和PCA上的乳酸菌生长和 总细胞数。
实验配方：BBQ调味汁
本研究考察的BBQ调味汁根据使用以下变量的标准配方制备：
表9：BBQ调味汁配方。
CFF1105是得自丹尼斯克公司(Danisco A/S)、由改性淀粉、藻酸钠和刺 槐豆胶组成的构造剂/稳定剂。
程序
共混干燥成分和抗微生物剂*
在剪切下缓缓向水中添加干混物5-8分钟，水化几分钟。
添加其余成分(番茄类)
加热至90℃，同时在300RPM下混合，保持5-7分钟
完成冷却至25℃，然后填充
*将抗微生物剂溶解于50ml水中，用柠檬酸调整pH至4。
细菌培养物的制备
该挑战研究中考察的酵母和霉菌菌株在表10中示出。将得自丹麦布拉 布兰丹尼斯克公司的丹尼斯克培养物保藏中心(Danisco’s Culture Collection (DCS)(Danisco A/S，Brabrand，Denmark))的总共8个菌株，用作相应的BBQ 调味汁中的一种酵母和一种霉菌库。起初，它们例如从腐败的番茄酱、蛋黄 酱、沙司酱分离，或从官方培养物保藏中心例如DMSZ获得。
表10：在本研究中用作1酵母和1霉菌库的考察菌株。
在每个实验前，每种酵母的储存培养物保存在-86℃下包含50％(v/v)甘 油的合适肉汤中，在合适的培养基(YGC-琼脂(VWR)，pH5.1+0.2；YM 肉汤(碧迪公司(Becton，Dickinson and company))中以及pH6.0±0.2和温 度25℃下经过两个连续生长周期繁殖。过夜培养物用盐水溶液稀释，以得 到工作培养物。酵母的混合物通过将等细胞数的每种培养物加入无菌容器 中，并且适当混合来制备。稀释酵母混合物，并且接种到产物中，以得到最 终所需的浓度。库计数通过平板计数确定。
霉菌孢子如下制备：将大约2ml无菌去离子水用于从过度生长的霉菌 品种上洗掉孢子(最少5天的旧平板)。将该悬浮液转移到无菌容器中。库 计数通过平板计数确定。
样品分析
BBQ调味汁在时间零点、第2天、第5天、第12天、每周直到第10 周(第68天)、然后每两周直到第19周(第131天)进行测定。检测接种 有酵母的每批3个样品的CFU/g。在每次取样前(密闭瓶)，充分混合样 品。从每个瓶中无菌取出10克样品，用蛋白胨水稀释。使每个样品(1分 钟、正常设置)以两个平行样均质化接种于YGC琼脂(VWR)和MRS(VWR) 上，分别在25℃下温育5天，37℃下温育3天。
通过视觉分析每批接种有霉菌的5种样品的霉菌生长。
未接种样品物质的pH测量在每个取样日期使用Mettler Toledo SevenEasy pH计进行。
结果和讨论
样品分析
图4和表11中的相关数据显示与未经防腐的对照物相比，不同抗微生 物剂对以大约500CFU/ml接种的酵母库生长的影响。如图中可见，在环境 温度(20℃)下温育12天后，对照物(图4中的红色曲线)中接种的酵母 开始生长。因此，在49天后达到稳定生长，YGC琼脂上的细胞计数为 9.2E+07CFU/g。批次F的1.25％竞争产品遵照对照物的生长曲线，与未保护 的批次相比，在第19天后仅观察到稍低的细胞计数。在4周(第26天)后 达到稳定生长，细胞计数为5.4E+05CFU/g。MicroGARD200批次C可保持 接种水平的细胞计数最多12天。然而，在下次取样时，确定与未保护的对 照物和竞争产品批次具有同样高的酵母计数。
在另一个方面，杀菌效果可见于具有1％和0.5％抗真菌剂本发明的抗 真菌剂(YM10)(图4中的绿色和紫色曲线)和山梨酸钾(图4中的橙色曲 线)的BBQ样品中，该效果通过将初始负荷减少至低于检测限(3倍对数 杀灭)可见。0.5％的抗真菌剂剂量可与山梨酸钾竞争至少直到第104天。 在取样第117天开始观察到所添加酵母的过度生长。在最后取样天(第131 天)，存活酵母的计数也可在山梨酸钾样品中确定。然而，90天的贮藏期 限的目标可在使用0.5％本发明的抗真菌剂(YM10)时实现。值得关注的是， 1％剂量率的本发明抗真菌剂(YM10)不能控制酵母过度生长，尽管开始时观 察到3倍对数减少。在第19天已确定3.6E+03CFU/ml。细胞计数在6周内 增加到最多5.0E+05CFU/ml。
表11：对YGC-琼脂上的细胞计数，以确定不同BBQ调味汁批次在接 种300-800CFU/g后的测试期内的酵母生长。
“-”未进一步测定
除酵母生长之外，还监测了霉菌的生长。因此，每种样品变体测试5 管。所接种的霉菌孢子在环境温度下，甚至在未保护样品中未显示出可见生 长。
此外，还考虑到由于乳酸菌造成的腐败。然而，未发现任何批次的可 培养细胞超过131天的测试期。
如上所述，具有低剂量本发明抗真菌剂(YM10)的批次中存在更好的保 护，这稍微出乎意料。为了解释该生长行为以及排除包含新开发的抗真菌剂 的两个批次的可能混合物，我们通过分析方法(GC/MS；A2729)考察了2个不 同BBQ调味汁批次的有机酸含量。表12包含了有机酸含量的测定结果。
丙酸是该试验的重要标记。考虑到批次B(1％YM10)和C(0.5％YM 10)中与抗微生物剂一起添加的丙酸浓度，预期浓度将为约300至150ppm。 就排列而言，浓度与预期很好地拟合。因此，我们排除了两个批次混合的可 能性。
表12：两个所选BBQ批次的有机酸含量(ppm)
pH是细菌生长的非常重要的参数和障碍，例如增加的pH可产生不同 的抗微生物菌群，因为pH-水平作为障碍降低。为了避免不同批次的pH差 异，用柠檬酸调整pH。在对BBQ调味汁进行配方后，预期pH被认为是约 pH3.8。
值得注意的是，所有批次中的pH，除未控制的样品之外，在测试期内 保持稳定。这也支持了未发现可行乳酸的事实(如前所述)。在对照批次中 测量到pH稍微增加。
表13：不同BBQ调味汁批次在测试期中的pH发展
结论
总之，本研究的结果表明，当保藏在环境温度(20℃)下时，本文考 察的抗真菌配方即本发明的抗真菌剂(YM10)可控制接种酵母(500- 1000CFU/g)库在BBQ调味汁(pH＜4.0)中的过度生长。
1％和0.5％抗真菌剂即本发明的抗真菌剂(YM10)以及山梨酸钾的剂量 产生了接种细胞负荷的初始3倍对数减少。0.5％的抗真菌剂量可与山梨酸 钾竞争至少直到第104天(第15周)。在取样第117天(第17周)开始观 察到所添加酵母的过度生长。在最后取样天(第131天)，存活酵母的计数 也可在山梨酸钾样品中确定。
竞争产品和200分别以1.25％和1％利用，在所施用的测 试条件下不能令人信服地保护测试的BBQ调味汁免于酵母腐败，因为与未 经防腐的对照物相比，仅观察到稍微推迟。
所考察的霉菌未找到适于所选食品模型的底物。未检测到可见霉菌生 长。此外，随着这些腐败生物体受到关注，在测试期内监测到乳酸菌的过度 生长。然而，在131天的测试期内，在所有批次中均未发现可培养细胞。这 可与未记录到pH的显著变化的事实相关联。
通过该挑战研究，我们发现本发明的组合(YM10)在添加时显示出直接 和有效的抗真菌效果，并且其控制了目标酵母在所考察产品(BBQ调味 汁)中在环境温度下储藏经过至少17周后的过度生长。因此，其支持本发 明的抗真菌剂(YM10)提升为新型抗真菌产品。
应用研究-(新鲜)沙司
本研究的目的是监测两种新型抗真菌共混物FP1000变型对非巴氏消毒 的沙司酱模型中腐败酵母和霉菌的效果，从而评估该产品与 200和山梨酸钾相比的效力。
FP1000-D1和FP1000-D2由来自褐色芥菜的异硫氰酸烯丙酯、来自绿 茶的儿茶素以及来自丙酸杆菌属发酵物的有机酸以不同比率组成，将它们以 1％的浓度加入，新鲜沙司(pH4.2)分别经受500CFU/ml的每两个预定接种率 的4种酵母物种库和4种霉菌物种库。
挑战研究的实验结果显示，1％(w/w)的FP1000-D1和FP1000-D2提供 了对测试菌株的杀菌效果，甚至稍微优于基准山梨酸钾。商业化抗微生物剂 200以1％使用，在所施加的测试条件下不能令人信服地保护 测试的沙司酱免于酵母腐败，因为该批次中存在最高酵母细胞计数。
在92天挑战试验期间，非处理样品(对照批次)中存活酵母细胞的数 量增加至1.2E+05CFU/g，虽然过度生长开始出乎意料地迟(第42天)。所 有批次中的最高乙酸浓度存在于对照物中，如GC/MS研究末期所确定。
在4℃下温育，霉菌未找到适于沙司酱的底物。未检测到可见的霉菌生 长。
在抗微生物剂方面，根据我们的结果，不可能识别任何一种配方，因 为二者的表现相同。抗真菌产品FP1000-D1可为优选的，因为其具有低浓 度的活性组分异硫氰酸烯丙酯和绿茶儿茶素，因此据信感觉影响降低。
介绍
包含来自褐色芥菜的异硫氰酸烯丙酯(AITC)(以得自三菱食品公司 (Mitsubishi Food，Inc.)的WasaOURO D的形式)、绿茶儿茶素(得自太阳铁 工(Taiyo Ltd.)的水提取绿茶)和来自丙酸杆菌属发酵物的有机酸(以 200的形式)的FP1000是新型共混物。
当在体外和原位测试时，共混物及其单个组分具有经验证的抗真菌和 抗细菌活性。为了证明FP1000在烹饪产品，例如沙司酱中的潜在用途，进 行挑战研究，其目的是监测新开发的共混物在原位以不同剂量的活性组分 (FP1000-D1和FP1000-D2)对腐败酵母和霉菌的效果，基准为山梨酸钾 和200(表14)。
非巴氏消毒的沙司酱在本文中称为“新鲜沙司酱”被选为代表性烹饪 产品，其预期贮藏期限为30天。预期贮藏期限相对较短是由于方法中缺乏 加热步骤。
表14：考察的抗微生物剂及其组合物
MicroGARDTM200包含乙酸(7-8％)和丙酸(2-4％)
实验
制备含有和不含实验共混物的沙司酱样品(表17中的配方)。变量的 设计旨在表明，概念抗真菌剂在本发明的水平上的抗真菌效果的可行性，基 准为常用水平的山梨酸钾和200。需要提及的是，沙司酱未经 巴氏消毒。
每批分为(方案表15)90克试样，并且置于无菌瓶中。分别地，每批 的21个试样接种所需水平的酵母，每批的5个试样接种霉菌孢子，目标接 种率为300至800CFU/g。
粘稠产品在接种的10分钟内充分混合(2分钟)，以确保种菌均匀分 布于整个产品中。一个样品保留未接种，用作阴性对照来监测天然污染菌 群。所有样品在暗处和低温(4℃)下温育，进行酵母测定，接种于适当酵 母培养基上，分别直到确认失败(≥1.0E+06CFU/g)或直到可见霉菌生长。平 行地，分别监测所有批次和非接种盲测中MRS和PCA上的乳酸菌生长和总 细胞计数。
表15：样品概览
测量关键：
1-总接种计数，pH测量值
2-酵母计数/乳酸计数，pH测量值
3-可见(霉菌生长)
细菌培养物的制备
该挑战研究中考察的酵母和霉菌菌株在表16中示出。将得自丹麦布拉 布兰丹尼斯克公司的丹尼斯克培养物保藏中心(Danisco’s Culture Collection (DCS)(Danisco A/S，Brabrand，Denmark))的总共8个菌株，用作相应的沙司 酱中的1种酵母和1种霉菌库。起初，它们例如从腐败的番茄酱、蛋黄酱、 沙司酱分离，或从官方培养物保藏中心例如DMSZ获得。
表16：在本研究中用作1酵母和1霉菌库的考察菌株。
在每个实验前，每种酵母的储存培养物保存在-86℃下包含50％(v/v)甘 油的合适肉汤中，在合适的培养基(YGC-琼脂(VWR)，pH5.1+0.2；YM 肉汤(碧迪公司(Becton，Dickinson and Company))中以及pH6.0±0.2和温 度25℃下经过两个连续生长周期繁殖。过夜培养物用盐水溶液稀释，以得 到工作培养物。酵母的混合物通过将等细胞数的每种培养物加入无菌容器 中，并且适当混合来制备。稀释酵母混合物，并且接种到产物中，以得到最 终所需的浓度。库计数通过平板计数确定。
霉菌孢子如下制备：将大约2ml去离子水用于从过度生长的霉菌品种 上洗掉孢子(最少5天的旧平板)。将该悬浮液转移到无菌容器中。库计数 通过平板计数确定。
实验配方：沙司酱
本研究考察的沙司酱根据使用以下变量的标准配方制备：
表17：沙司酱配方。
程序
共混干燥成分和抗微生物剂
缓缓向水中添加干混物，水化几分钟
添加其余成分(番茄类)
在加工期间均质化
样品分析
沙司酱在时间零点、第3天、第7天、第14天进行测定，两周后接 种，直到第92天。检测接种有酵母的每批3个样品的CFU/g。在每次取样 前(密闭瓶)，充分混合样品。从每个瓶中无菌取出10克样品，用蛋白胨 水稀释。使每个样品(1分钟、正常设置)以两个平行样均质化接种于 YGC琼脂(VWR)和MRS(VWR)上，分别在25℃下温育5天，37℃下温育3 天。
通过视觉分析每批接种有霉菌的5种样品的霉菌生长。
对于未处理、未接种的样品，总细胞计数通过接种于PC-琼脂和MRS- 琼脂(VWR)上进行。
非接种样品物质的pH测量在每个取样日期使用Mettler Toledo SevenEasy pH计进行。
结果和讨论
样品分析
图5和表18中的相关数据显示了与未经防腐的对照物相比，不同抗微 生物剂对以大约500CFU/ml接种的酵母库生长的影响。如图中可见，在低 温(4℃)下温育42天后，对照物(图5中的蓝色曲线)中接种的酵母首次 生长。未经防腐的沙司样品中目标指示菌株的迟缓过度生长是出乎意料的， 尤其是与包含1％(w/w)200的批次相比时，其中酵母在一周 后开始生长(在42天后达到稳定计数)。即使在研究末期，92天后，未经 防腐批次中的酵母计数比添加1％200的酵母计数低大约2倍 对数，其在YGC琼脂上的酵母细胞计数最多达到2.0E+07CFU/g。
在另一个方面，1％的实验共混物FP1000-D1和FP1000-D2(图5中的 粉色和黄色曲线)的表现最好，即使与显示出杀细菌效果的山梨酸钾(图7 中的紫色曲线)相比较。然而，根据结果识别两种共混物是不可能的，因为 细胞计数的差异不显著。
由于沙司酱生产期间缺乏巴氏消毒步骤，乳酸菌受到关注。然而，图6 和表19中的相关数据显示，乳酸菌虽然是天然存在的，但未达到高细胞计 数。除包含山梨酸钾(图6中的紫色曲线)的批次之外，MRS-琼脂上的微 生物计数在接种3天后增加约1倍对数，如图中可见。然而，长期温育所有 样品中的细胞计数会减少。因此，与对照物(图6中的蓝色曲线)相比，包 含FP1000-D1和FP1000-D2(图6中的粉色和黄色曲线)的批次的计数减 少更快。与任何其他处理相比，山梨酸钾似乎更好地控制乳酸菌的过度生 长。在42天后MRS-琼脂上未检测到更多的菌落。然而，细菌生长的斜率 相当于FP1000样品的斜率。
表18：对YGC-琼脂上的细胞计数，以确定不同沙司酱批次在接种300 -800CFU/g后的测试期内的酵母生长。
表19：在测试期内对MRS-琼脂上的细胞计数，以确定不同沙司酱批 次中乳酸菌的天然菌群。
*MRS平板长满酵母，不可能进行菌落计数
除酵母生长之外，还监测了霉菌的生长。因此，每种样品变体测试5 管。所接种的霉菌孢子在4℃下，甚至在未保护样品中未显示出可见生长。 然而，在贮藏期限末期，在没有任何防腐剂体系的情况下在酵母接种样品中 找到霉菌(平板计数)。在另一个方面，1％的3组分实验共混物，可控制 霉菌过度生长12周。这也可见于200和山梨酸钾的应用中。
为了解释对照批次中目标生物体的迟缓过度生长，我们通过分析方法 (GC/MS；A2729)考察了5个不同沙司酱批次的有机酸含量。表20包含了有 机酸含量的测定结果。
丙酸是该试验的重要标记。考虑到批次B、C和D中与抗微生物剂一 起添加的丙酸浓度，预期浓度将为0.036％、0.035％和0.039％。浓度虽然稍 微低于所添加，但就排列而言，与预期很好地拟合。更精确地，批次B、C 和D中存在0.03％、0.028％和0.032％的丙酸。
沙司酱中乙酸的默认浓度(根据表15中的配方)可为约0.13％ (w/w)，如同乙酸也存在于包含山梨酸钾的样品中(批次E)(未添加另外 的乙酸；未腐败)。
未经防腐的对照物稍微出乎意料，具有最高的乙酸浓度。0.52％的乙酸 含量比批次E高大约三倍，并且比批次B、C和D高两倍，其中所利用的抗 微生物剂，与批次A和E相比，添加0.064至0.08％以上的乙酸。这些高水 平的乙酸不太可能由于细菌发酵、给定的环境条件、低pH、低温、底物而 产生。然而，细菌可在某些程度上作出贡献，因为乳酸菌还产生乙酸以及乳 酸。形成乙酸的革兰氏阴性醋杆菌属(Acetobacter spp)可为所用香草及香料 的污染物，并且可将葡萄糖代谢为乙酸。
沙司酱中的低pH(4.2)和冷冻储藏条件可为对照物中迟缓过度生长的原 因。一旦开始生长，目标酵母毕赤酵母和拜氏接合酵母可为存在高乙酸浓度 的原因。另一种情况可以是，如果乙酸在试验开始时存在于样品中，则乙酸 和乳酸的高浓度均可解释该样品(批次A)中的迟缓过度生长。
表20：沙司酱批次的有机酸含量(w/w％)
此外，值得一提的是，分离来自包含200的批次的优势 菌落，并且通过VITEK和18S测序识别。进行上述操作为了表明野生酵母 是否在样品中生长，或是否为目标生物体之一。
有趣的是，200批次中分离的酵母鉴定为未添加到库中的 Saccharomyces servazzii。对照批次中的优势酵母追溯到毕赤酵母(Pichia spp.)，可能是添加的DCS1175菌株。污染酵母出现的时间点未知。通过确 定最小抑制浓度(数据未示出)在体外测试污染酵母Saccharomyces servazzii对异硫氰酸烯丙酯和FP1000变体FP1000-D1 的易感性。结果确认了酵母对1％(w/v)的耐受性，以及分 别对0.01％异硫氰酸烯丙酯和1％(w/v)FP1000-D1的易感性。因此， Saccharomyces servazzii虽然最终存在于所有批次中，在经防腐批次中受到 抑制，但能够生长于批次D中。未经防腐批次A中的高乙酸浓度以及竞争 酵母菌群可引起那些样品中污染物的抑制。
总结这些发现可知，批次D中的高酵母细胞计数和早期过度生长与 耐受性污染物相关，因此不应直接与对照批次A比较。
在对沙司酱进行配方后，预期pH被认为是约pH4.1。然而，值得注意 的是，对照物的pH稍高，为pH4.23，如图7中可见。已证实，施用实验 共混物和发酵物后，pH分别增加至pH4.44(4.51)和4.50 (表21)。此观察更早地进行，并且通过发酵物的产生以及通过概念共混 物的组合物解释。稍微出乎意料的是添加0.1％山梨酸钾对pH的影响，该影 响也可使pH增加至pH4.32。
pH是细菌生长的非常重要的参数和障碍，例如增加的pH可产生不同 的抗微生物菌群，因为pH-水平作为障碍降低。然而，为了不施加同样影响 抗微生物活性的其他酸，决定不调整批次中的pH，而是通过确定合适生长 培养基上的总细胞计数和乳酸菌的计数来监测微生物效果。值得注意的是， 所有批次中的pH遵循相同的趋势，并且随着测试期推移稍微降低。
表21：不同沙司酱批次在测试期中的pH发展
结论
总之，本研究的结果表明，当保藏在4℃下时，本文考察的FP1000配 方(FP1000-D1和FP1000-D2)具有控制接种酵母(300-800CFU/g)和霉菌 (300-800CFU/g)库在非巴氏消毒的沙司酱(pH＜4.2)中过度生长的潜力。
在92天挑战试验期间，未处理样品中存活酵母细胞的数量增加至 1.2E+05CFU/g，虽然过度生长开始出乎意料地迟(第42天)。在所有批次 中，该批次包含最高的乙酸浓度。
显然，1％的FP1000-D1和FP1000-D2显示出对测试菌株的杀细菌效 果，甚至稍微优于基准山梨酸钾。
商业化抗微生物剂以1％使用，在所施加的测试条件 下不能令人信服地保护测试的沙司酱免于酵母腐败，因为该批次中存在最高 酵母细胞计数。然而，分离的菌株鉴定为Saccharomyces servazzii，不是接 种酵母库的成员，在体外测试时显示出对发酵物的耐受性。
所考察的霉菌未找到适于所选食品模型的底物。未检测到可见霉菌生 长。
此外，随着这些腐败生物体受到关注，在测试期内监测到乳酸菌的过 度生长。虽然观察到初始1倍对数增加，但细胞计数在测试期内保持稳定， 并且低于1.3E+04CFU。
值得注意的是，所有批次中的pH遵循相同的趋势，并且随着测试期推 移稍微降低。通过腐败细菌的酸化可部分解释该效果，虽然与细胞计数的相 关性不存在于所有样品中。
在抗微生物剂方面，根据我们的结果，不可能识别任何一种配方，因 为二者的表现相同。
应用研究-牧场酱
本研究的目的是监测新开发的抗真菌组合物“FP1000”对常规牧场酱 中腐败酵母和霉菌的效果，从而与和山梨酸钾比较评估潜 在产品的两种组合物。“FP1000-D1”和“FP1000-D2”均由来自褐色芥菜 的异硫氰酸烯丙酯、来自绿茶的儿茶素以及来自丙酸杆菌属发酵物的有机 酸，但以2种不同比率组成，将它们以1％(w/w)的浓度加入，并且常规牧 场酱(pH4)分别经受500至1000CFU/g的预定接种率的4种酵母物种库和4 种霉菌物种库。
挑战研究的实验结果显示，当保藏在环境温度(20℃)下时，以1％施 用的抗真菌配方“FP1000D1”和“FP1000D2”具有控制接种酵母库在常 规牧场酱中过度生长的潜力。所提供的对测试菌株的杀细菌效果(初始2倍 对数减少)与基准山梨酸钾竞争至少29周(198天)的储藏期。
在20℃下温育，霉菌未找到适于牧场酱的底物。未检测到可见的霉菌 生长。
介绍
“FP1000”包含来自褐色芥菜的异硫氰酸烯丙酯(AITC)(以得自三菱 食品公司(Mitsubishi Food，Inc.)的WasaOUROD的形式)、绿茶儿茶素(得 自太阳铁工(Taiyo Ltd.)的水提取绿茶)和来自丙酸杆菌属发酵物的有机酸 (以的形式)。
当在体外和原位测试时，共混物及其单个组分具有经验证的抗真菌和 抗细菌活性-参见上文。然而，为了评估“FP1000”在烹饪产品，例如常规 牧场酱中的潜在用途，进行挑战研究，其目的是监测新开发的共混物在原位 以不同剂量水平的共混物组分对腐败酵母和霉菌的效果，基准为山梨酸钾和 Danisco抗微生物产品200(表22)。
常规牧场酱被选为代表性烹饪产品，其在环境温度下的预期贮藏期限 为90至120天。
表22：考察的抗微生物剂及其组合物
实验
含有以及不含实验共混物的常规牧场酱的样品(配方见表24)在布拉 布兰的丹尼斯克烹饪应用实验室(Danisco Culinary Application Laboratory， Brabrand)制备。变量的设计旨在表明，概念抗真菌剂在本发明的水平上的 抗真菌效果的可行性，基准为常用水平的山梨酸钾和
每批分为(方案表23)90克试样，并且置于无菌瓶中。分别地，每批 的36个试样接种所需水平的酵母，每批的5个试样接种霉菌孢子，目标接 种率为500至1000CFU/g。
粘稠产品在接种的10分钟内充分混合(2分钟)，以确保种菌均匀分 布于整个产品中。一个样品保留未接种，用作阴性对照来监测天然污染菌 群。所有样品在环境温度(20℃)下温育，并且进行酵母测定，接种于适当 酵母培养基上，分别直到确认失败(≥1.0E+05CFU/g)或直到可见霉菌生长。 平行地，分别监测所有批次和非接种盲测中MRS和PCA上的乳酸菌生长和 总细胞计数。
表23：样品概览
*500-1000CFU/g
测量关键：
1-总平板计数/酵母计数/乳酸计数，pH测量值
2-可见(霉菌生长)
实验配方：牧场酱
本研究考察的牧场酱根据使用以下变量的标准配方制备：
表24：配方牧场酱。
程序
干混糖和黄原胶
将其加入水相，让水解胶体水解几分钟
添加蛋黄
添加酪乳粉
添加其余干成分(盐、香料、香草、抗微生物剂(批次B至E))
使油在高剪切下乳化
添加酸性成分(醋和柠檬汁)
细菌培养物的制备
该挑战研究中考察的酵母和霉菌菌株在表4中示出。将得自丹麦布拉 布兰丹尼斯克公司自身的丹尼斯克培养物保藏中心(Danisco’s Culture Collection(DCS)(Danisco A/S，Brabrand，Denmark))的总共8个菌株，用作相 应的牧场酱中的1种酵母和1种霉菌库。起初，它们例如从腐败的番茄酱、 蛋黄酱、沙司酱分离，或从官方培养物保藏中心例如DMSZ获得。
表25：在本研究中用作1酵母和1霉菌库的考察菌株。
在每个实验前，每种酵母的储存培养物保存在-86℃下包含50％(v/v)甘 油的合适肉汤中，在合适的培养基(YGC-琼脂(VWR)，pH5.1+0.2；YM 肉汤(碧迪公司(Becton，Dickinson and company))中以及pH6.0±0.2和温 度25℃下经过两个连续生长周期繁殖。过夜培养物用盐水溶液稀释，以得 到工作培养物。酵母的混合物通过将等细胞数的每种培养物加入无菌容器 中，并且适当混合来制备。稀释酵母混合物，并且接种到产物中，以得到最 终所需的浓度。库计数通过平板计数确定。
霉菌孢子如下制备：将大约2ml无菌去离子水用于从过度生长的霉菌 品种上洗掉孢子(最少5天的旧平板)。将该悬浮液转移到无菌容器中。库 计数通过平板计数确定。
样品分析
牧场酱在时间零点、第3天、第7天、第14天、其后每两周直到第13 周(第90天)、以及每4至6周直到第29周进行测定。检测接种有酵母的 每批3个样品的CFU/g。在每次取样前(密闭瓶)，充分混合样品。从每个 瓶中无菌取出10克样品，用蛋白胨水稀释。使每个样品(1分钟、正常设 置)以两个平行样均质化接种于YGC琼脂(VWR)、PC琼脂和MRS琼脂 (VWR)上，分别在25℃下温育5天和7天，37℃下温育3天。
通过视觉分析每批接种有霉菌的5种样品的霉菌生长。
未接种样品物质的pH测量在每个取样日期使用Mettler Toledo Seven Easy pH计进行。
结果和讨论
样品分析
图8和表26中的相关数据显示了与未经防腐的对照物相比，不同抗微 生物剂对以大约500CFU/ml接种的酵母库生长的影响。如图中可见，在环 境温度(20℃)下温育7天后，无防腐剂对照物(图8中的红色曲线)中接 种的酵母开始生长。因此，在14天后达到稳定生长，YGC琼脂上的细胞计 数为1.93E+04CFU/g。这比所定义的腐败水平低约1倍对数。批次D的 MicroGARD200可将细胞计数保持为接种水平直到第64天，其中检测到 4.7E+03CFU/g的高细胞计数曲线。然而，在如下取样天，批次D的YGC 琼脂上细胞计数再次低于检测限(1.0E+01CFU/g)。
通过将初始负荷减少至低于检测限(2倍对数杀灭)，杀细菌效果可见 于具有1％两种抗真菌组合物“FP1000”(图8中的深绿和浅绿色曲线)以 及包含0.1％山梨酸钾的样品(图8中的蓝色曲线)的牧场酱样品中。在198 天考察的任何经防腐批次中，酵母库不能从初始杀灭恢复。
表26：对YGC-琼脂上的细胞计数，以确定不同牧场酱批次在接种 500CFU/g后的测试期内的酵母生长。
除酵母生长之外，还监测了霉菌的生长。因此，每种样品变体测试5 个容器。在表6中，记录每个试管的可见生长。
所接种的霉菌孢子在环境温度下，甚至在未保护样品中未显示出可见 生长。
表27：牧场酱中的霉菌生长，以可见方式确定并且记录为“+”。(如 “+++--”表示5个瓶中的3个显示出生长)。
pH是细菌生长的非常重要的参数和障碍，例如增加的pH可产生不同 的抗微生物菌群，因为pH-水平作为障碍降低。
然而，决定不调整pH，从而不改变配方，而是通过确定总细胞计数以 及乳酸菌在合适生长培养基上的计数来监测效果。最低pH(3.84)可见于对 照批次中，其中所有包含发酵物的样品具有大于4.1的pH。甚至山梨酸钾 批次的pH也为pH4.02，高于对照批次。pH随着时间的发展可见于表28 中。值得注意的是，所有批次中的pH遵循相同的趋势，并且随着储藏时间 的推移减少约0.1个pH单位。未发现与细胞计数的相关性(总细胞计数的 数据未示出)。(乳酸选择性培养基上的细胞计数在整个测试期低于检测 限。)因此，通过腐败细菌的酸化似乎不能解释该效果。此外，样品的不同 起始pH似乎不对挑战研究具有直接影响。
表28：不同牧场酱批次在测试期中的pH发展
结论
总之，本研究的结果表明，当保藏在环境温度(20℃)下时，本文考 察的抗真菌配方“FP1000D1”和“FP1000D2”具有控制接种酵母(500- 1000CFU/g)库在常规牧场酱(pH4.0)中过度生长的潜力。
1％抗真菌组合物的剂量在活性有机酸、异硫氰酸烯丙酯和儿茶素的组 合物中有所不同，可引起接种细胞负荷的初始2倍对数减少。其还用于1％ 的MicroGARD200和0.1％的山梨酸钾中。
在198天考察的任何经防腐批次中，酵母库不能从初始杀灭恢复。
所考察的霉菌未找到适于所选食品模型的底物。未检测到可见霉菌生 长。
此外，随着这些腐败生物体受到关注，在测试期内监测到乳酸菌的过 度生长。然而，在198天的测试期内，在所有批次中均未发现可培养细胞。 这可能与未记录到pH的显著变化的事实相关联。
通过该挑战研究，我们发现本发明的组合“FP1000D1”和“FP1000 D2”在添加时显示出直接和有效的抗真菌效果，并且其控制了目标酵母在 所考察产品(常规牧场酱)中在环境温度下储藏经过至少29周后的过度生 长。
应用研究-宠物食品
本研究的目的是评估所选实验共混物在pH3.0和pH4.0下对宠物食品 调味剂中酵母库和霉菌库的影响。实验共混物“FP1000”由0.95％来自褐色 芥菜的异硫氰酸烯丙酯、7.5％来自绿茶的儿茶素和8至11％来自丙酸杆菌 属发酵物的总有机酸组成。配方以0.35％和0.7％(w/w)的浓度添加至应用模 型。
挑战研究的实验结果显示，本文考察的抗真菌配方“FP1000”保藏在 42℃下时具有控制接种酵母库在两种测试pH水平下的常规调味剂中过度生 长的潜力，从而与工业用途的抗微生物剂竞争。这也适用于霉菌的过度生 长，与未保护的对照物相比，其被高pH产品中的“FP1000”抑制。
实验设置
在pH3和pH4下无任何防腐措施的宠物食品调味剂样品由AFB国际 (AFB International)提供。变量的设计旨在表明，概念抗真菌剂在本发明的水 平上的抗真菌效果的可行性，基准为工业上通常使用的防腐剂。包含常用浓 度该防腐剂的调味剂批次(pH4)也由AFB国际(AFB International)提供。
每批分为(方案表30)200ml试样，并且置于无菌瓶中。分别地，每 批的试样接种所需水平的酵母，每批的10ml接种霉菌孢子，目标接种率为 500至1000CFU/g。
粘稠产品在接种的10分钟内充分混合(2分钟)，以确保种菌均匀分 布于整个产品中。所有样品在42℃下温育，并且测定酵母的过度生长，接 种于适当的培养基上，分别直到6周储藏后，或直到可见霉菌生长。由于宠 物食品调味剂所提供的体积，测试期是有限的。
表29
1在整个测试期分析相同的样品(广口瓶)。
细菌培养物的制备
该挑战研究中考察的酵母和霉菌菌株在表32中示出。将得自丹麦布拉 布兰丹尼斯克公司自身的丹尼斯克培养物保藏中心(Danisco’s Culture Collection(DCS)(Danisco A/S，Brabrand，Denmark))的总共8个菌株，用作相 应的宠物食品调味剂中的1种酵母和1种霉菌库。起初，它们例如从腐败的 食品和宠物食品分离，或从官方培养物保藏中心例如DMSZ和ATCC获 得。
表30：在本研究中用作1酵母和1霉菌库的考察菌株。
在每个实验前，每种酵母的储存培养物保存在-86℃下包含50％(v/v)甘 油的合适肉汤中，在合适的培养基(YGC-琼脂(VWR)，pH5.1+0.2；YM 肉汤(碧迪公司(Becton，Dickinson and company))中以及pH6.0±0.2和温 度25℃下经过两个连续生长周期繁殖。过夜培养物用盐水溶液稀释，以得 到工作培养物。酵母的混合物通过将等细胞数的每种培养物加入无菌容器 中，并且适当混合来制备。稀释酵母混合物，并且接种到产物中，以得到最 终所需的浓度。库计数通过平板计数确定。
霉菌孢子如下制备：将大约2ml无菌去离子水用于从过度生长的霉菌 品种上洗掉孢子(最少5天的旧平板)。将该悬浮液转移到无菌容器中。库 计数通过平板计数确定。
样品分析
为了获得代表性样品，始终在接种前混合2相液体调味剂，并且在研 究期间取样。所接种的宠物食品调味剂保藏在42℃，在时间零点和其后每 周进行测定，直到第6周。(储藏和取样受到所提供调味剂的体积限制。) 以两个平行样检测每批接种有酵母的2个样品的CFU/g。从每个瓶中无菌取 出部分样品，用Ringers溶液稀释10倍，用旋涂技术接种于合适的琼脂上。 测定酵母的样品在30℃的YGC-琼脂[AM-015]上温育48小时。
通过视觉分析每批接种有霉菌的5种样品的霉菌生长。(霉菌接种的 那些样品未混合。)
结果
酵母的计数
在储藏6周期间，实验调味剂中酵母计数的结果在表31中示出。常规 防腐系统以及实验共混物“FP1000”不允许目标生物体在储藏期内的两个 pH水平下过度生长。在另一个方面，未保护的批次在pH3和pH4下被视 为在第2周内腐败。然而，需要提及的是，所考察的指示酵母库似乎对pH 3产品中的低pH敏感。随着时间的推移，所有包括未保护对照物的样品中 细胞密度降低。
表31：对YGC-琼脂上的细胞计数，以确定不同宠物食品调味剂批次在 接种1,000CFU/g后的测试期内的酵母生长。
＜1.00E+02CFU/g是所用旋涂方法的检测限
霉菌
监测每个样品变体5管调味剂的霉菌的可见过度生长。如表32中可 见，在测试期内，霉菌仅见于pH4下的未保护批次中。
其他样品未提供霉菌过度生长的有利环境。
表32：宠物食品调味剂中的霉菌生长。可见过度生长记录为“x”，无 生长报告为“-”。(如“xxxxx”表示5管中的5个显示出生长)。
结论
高pH降低了腐败生物体的障碍，因此对保护更具挑战性。酵母细胞密 度的增加可见于pH4下温育一周后的未经防腐的对照物中。
然而，所考察的指示酵母库似乎对pH3产品中的低pH敏感。随着时 间的推移，所有包括未保护对照物的样品中的细胞密度降低。
然而，包含绿茶提取物、芥菜油和发酵物的实验共混物(“FP1000”) 的两个浓度(0.35％和0.7％)控制了酵母污染，并且保护产品在两个pH水 平下免于腐败。因此，与如通常工业中所用的防腐剂竞争，其中测试生物体 在测试期内未生长。
接种霉菌孢子在pH4下2天后在未保护的样品中显示出可见生长。
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上面说明书中提及的所有出版物以引用的方式并入本文。在不背离本 发明的范围和精神的情况下，本领域技术人员会显而易见地想到本文所描述 的本发明方法和系统的各种修改和变化。虽然已结合具体优选的实施例对本 发明进行了描述，但应理解，要求权利保护的本发明不应被不恰当地限于这 些具体实施方案。实际上，化学、生物学、食品科学或相关领域技术人员显 而易见地想到的对本文所描述的本发明实施方式的各种修改，也视为落入以 下权利要求书的范围内。