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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310087144.0 (22)申请日 2013.03.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104055760 A (43)申请公布日 2014.09.24 (73)专利权人 中国科学院上海药物研究所 地址 201203 上海市浦东新区张江祖冲之 路555号 (72)发明人 果德安 姜宝红 (74)专利代理机构 上海一平知识产权代理有限 公司 31266 代理人 崔佳佳 马莉华 (51)Int.Cl. A61K 31/216(2006.01) A61K 3。
2、1/343(2006.01) A61P 9/00(2006.01) (56)对比文件 CN 102309477 A,2012.01.11,说明书第2页 第0028段， 第3页第0036-0038段. CN 101496798 A,2009.08.05,说明书第10 页实施例2. CN 102309477 A,2012.01.11,说明书第2页 第0028段， 第3页第0036-0038段. CN 101496798 A,2009.08.05,说明书第10 页实施例2. 梁雅慧等.丹酚酸B在体外对基质金属蛋白 酶1、 2和9活性的抑制作用. 中西医结合学报 .2009,第7卷(第2期),第145。
3、-150页. 何远.丹酚酸对心肌梗死大鼠的心肌保护和 调节基质金属蛋白酶的作用. 现代药物与临 床 .2010,第25卷(第3期),第237-238页. 审查员 曹寅秋 (54)发明名称 多聚体丹酚酸在制备用于抑制主动脉瘤或 主动脉夹层的发生或发展的药物中的用途 (57)摘要 本发明涉及多聚体丹酚酸在制备用于抑制 主动脉瘤或主动脉夹层发生的药物中的用途； 以 及一种药物组合物， 包括作为药学活性物质的多 聚体丹酚酸， 以及相关所需的辅剂等， 该药物组 合物可以用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发 生。 所述多聚体丹酚酸为二聚体丹酚酸、 三聚体 丹酚酸或四聚体丹酚酸， 其中， 所述二聚体丹酚 酸为迷。
4、迭香酸， 所述三聚体丹酚酸为丹酚酸C、 紫 草酸或丹酚酸A， 所述四聚体丹酚酸为丹酚酸B。 权利要求书1页 说明书6页 附图8页 CN 104055760 B 2017.12.08 CN 104055760 B 1.多聚体丹酚酸在制备用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生的药物中的用途， 其中 所述述多聚体丹酚酸为二聚体丹酚酸、 三聚体丹酚酸或四聚体丹酚酸。 2.根据权利要求1所述的用途， 其中， 所述多聚体丹酚酸为二聚体丹酚酸、 或三聚体丹 酚酸。 3.根据权利要求1所述的用途， 其中， 所述二聚体丹酚酸为迷迭香酸， 所述三聚体丹酚 酸为丹酚酸C、 紫草酸或丹酚酸A， 所述四聚体丹酚酸为丹酚酸B。
5、。 4.根据权利要求1所述的用途， 其中， 所述多聚体丹酚酸为丹酚酸A。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104055760 B 2 多聚体丹酚酸在制备用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生 或发展的药物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及药物领域， 具体而言涉及多聚体丹酚酸， 尤其是二聚体丹酚酸、 三聚体 丹酚酸、 四聚体丹酚酸在制备用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生的药物中的用途。 背景技术 0002 众所周之， 丹参多酚酸(以下简称丹酚酸)是提取于唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的一类水溶性化合物， 根据结构中苯环的数量可分为一聚体、 二聚 。
6、体、 三聚体和四聚体。 其中， 丹参素、 原儿茶醛为一聚体的代表； 迷迭香酸为二聚体的代表； 紫草酸、 丹酚酸A、 丹酚酸C为三聚体的代表； 丹酚酸B为四聚体的代表。 这些代表性的化合物 的结构如图1所示。 0003 主动脉瘤和主动脉夹层是主动脉病变的两类重要疾病。 主动脉瘤是主动脉壁出现 明显的扩大， 当发展到一定阶段可破裂出血。 主动脉夹层是主动脉内血液沿血管内膜撕裂 处流动， 造成主动脉内膜和中膜的分裂状态， 如不及时医治可危及生命。 主动脉瘤和主动脉 夹层的病因非常复杂， 吸烟、 高血压和动脉粥样硬化等是最常见的诱发因素。 表现为中层和 外膜的细胞外基质降解， 动脉壁变薄及炎症细胞的侵。
7、入。 基质金属蛋白酶(MMPs)可降解细 胞外基质， 在主动脉瘤或主动脉夹层的形成过程中发挥重要作用。 0004 丹酚酸A是已知的对心血管保护有重要作用的化合物， 溶于乙醇、 乙醚,熔点为315 323。 对心绞痛及急性心肌梗塞、 脑血栓形成的后遗症、 硬皮病、 视网膜中央动脉栓塞、 神经性耳聋、 白噻氏综合征及结节性红斑等有一定效果， 但尚未见丹酚酸A或其他丹酚酸用 于主动脉瘤或主动脉夹层治疗的研究报道。 发明内容 0005 本申请提供了一种多聚体丹酚酸， 尤其是二聚体丹酚酸、 三聚体丹酚酸、 四聚体丹 酚酸在制备用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生或发展的药物中的用途。 0006 优选地， 。
8、所述多聚体丹酚酸为二聚体丹酚酸、 三聚体丹酚酸或四聚体丹酚酸。 更优 选地， 所述二聚体丹酚酸为迷迭香酸， 所述三聚体丹酚酸为丹酚酸C， 紫草酸或丹酚酸A， 所 述四聚体丹酚酸为丹酚酸B。 进一步优选地， 所述多聚体丹酚酸为丹酚酸A或丹酚酸B。 0007 一种药物组合物， 包括作为药学活性物质的多聚体丹酚酸， 以及相关所需的辅剂 等， 该药物组合物可以用于抑制主动脉瘤或主动脉夹层的发生。 0008 优选地， 所述多聚体丹酚酸为二聚体丹酚酸、 三聚体丹酚酸或四聚体丹酚酸。 更优 选地， 所述二聚体丹酚酸为迷迭香酸， 所述三聚体丹酚酸为丹酚酸C， 紫草酸或丹酚酸A， 所 述四聚体丹酚酸为丹酚酸B。。
9、 进一步优选地， 所述多聚体丹酚酸为丹酚酸A或丹酚酸B。 附图说明 0009 图1为代表性多聚体丹酚酸的化学结构图； 说 明 书 1/6 页 3 CN 104055760 B 3 0010 图2为Biacore检测数据图； 0011 图3为酶动力学实验结果图； 0012 图4为主动脉瘤或主动脉夹层动物实验结果的图； 0013 图5为收缩压测定和血脂测定、 血管病变程度的实验结果图； 0014 图6为采用620M-DMT微血管张力测定的曲线图； 0015 图7为丹酚酸A改善损伤血管的组织学结构图； 0016 图8为明胶酶谱的方法评价丹酚酸A的酶抑制活性的实验结果图； 0017 图9为对肝脏组织采。
10、用HE染色进行组织学评价的照片； 0018 图10为小鼠粪便菌群培养的照片； 0019 图11为小鼠主动脉血管结构的电镜照片。 具体实施方式 0020 实验实施例 0021 1、 多聚体丹酚酸与MMP-9蛋白直接结合的Biacore检测 0022 通过蛋白重组技术获得MMP-9催化域蛋白， 并验证该蛋白具有降解胶原等底物的 能力， 然后利用表面等离子共振技术 （Biacore3000仪器） 考察评价多聚体丹酚酸中代表性 酚酸与MMP-9催化域蛋白的直接结合能力。 0023 2、 酶动力学筛选试验 0024 采用荧光多肽thiopeptolide(购自Bachem Bioscienc)作为MMP。
11、-9的荧光底物， 考 察不同浓度丹酚酸 （丹酚酸A、 丹酚酸B、 丹酚酸C、 紫草酸、 原儿茶醛、 丹参素和迷迭香酸） 对 MMP-9的抑制活性， 并利用双倒数法进行数据分析， 并计算Ki值评价多聚体丹酚酸对MMP-9 的抑制能力。 0025 3、 主动脉瘤或主动脉夹层动物模型的制备和化合物处理 0026 SPF级8周龄APOE-/-小鼠57只， C57小鼠10只。 APOE-/-小鼠持续喂食高脂饲料， 采用 异氟烷麻醉， 皮下埋置ALZET缓释泵(Micro-osmotic pump Model1004,Lot:10221-09, Durect Corporation)， 维持血管紧张素II。
12、的释放速度为1.1 g/hour， 埋泵1周后进行腹腔 注射给药， 埋泵4周后进行化合物药效评价。 试验分为以下六组： C57小鼠给予生理盐水作为 正常动物对照组(C57， n=10)， APOE-/-小鼠给予生理盐水作为疾病模型鼠(n=12)， APOE-/-小 鼠每天给予10mg/kg丹酚酸A(n=11)， APOE-/-小鼠每天给予20mg/kg SalA(n=12)， APOE-/-小 鼠每天给予10mg/kg强力霉素(n=11)， APOE-/-小鼠每天给予20mg/kg强力霉素(n=11)。 埋泵 28天后进行小鼠眼眶取血， 脏器称重， 组织冻存， 组织固定包埋等。 动物实验均通过。
13、上海药 物所动物学会兽医护理、 伦理福利专业委员会准许。 实验人员具备实验动物与动物实验培 训合格证书。 0027 4、 收缩压测定和血脂测定 0028 于皮下埋置微量注射泵的第0周， 第2周进行血压检测。 收缩压测定采用尾套法， 采 用NIBP鼠尾无创血压测量分析系统(上海奥尔科生物科技有限 公司)将小鼠置于37 C动物 保温毯上预热10min， 测量小鼠在安静、 清醒状态下的尾动脉压5次， 取其平均值。 血脂的测 定于取材前18小时禁食， 采用眼眶取血， 3000r/min离心分离血清， 采用甘油三脂(TG)和总 胆固醇(TCH)测定试剂盒(浙江东瓯生物工程有限公司)测定血清中甘油三脂和总。
14、胆固醇的 说 明 书 2/6 页 4 CN 104055760 B 4 水平。 0029 5、 血管病变程度的评价 0030 血管紧张素II处理28天后， 小鼠进行取材。 主动脉直径与C57对照小鼠相比扩张 150%(即血管直径大于1.2mm)便认为是主动脉瘤模型成立， 并计算动脉瘤的发生率。 通过动 物解剖和组织切片评价主动脉夹层的发生率。 0031 6、 组织学分析 0032 主动脉取出后进行体式显微镜拍照， 用4%多聚甲醛进行固定48h， 而后进行石蜡包 埋。 主动脉石蜡切片(3mm)用于HE染色， 天狼猩红染色。 0033 7、 DMT微血管张力测定实验 0034 采用620M-DMT。
15、微血管张力测定系统(Danish Myo Technology A/S,Aarhus, Denmark)。 将两根不锈钢金属丝穿过肾下动脉内腔， 两根金属丝分别固定于固定架两端从 而将肾下动脉固定于固定架上。 固定架的一端与微定位器相连， 控制肾下动脉周长； 另一端 与张力转换器相连， 用于测量血管张力变化。 肾下动脉浸没于充有95%O2和5%CO2的混合气和 Krebs溶液的浴槽中， 浴槽可加热至37， 肾下动脉可维持活性数小时。 肾下动脉被固定及 平衡后， 通过血管标准化程序测定微血管的长度-张力关系从而确定肾下动脉最佳初始张 力。 每个血管环先用105M苯肾上腺素收缩稳定至平台期， 然后。
16、给予109105M乙酰胆碱测 量各血管的舒张力。 0035 8、 血清MMP-2、 MMP-9的检测 0036 明胶酶谱法检测血清中MMP-2、 MMP-9的活性。 小鼠取血后于4 C， 3000r/min， 15分 钟离心,取上清用于明胶酶谱实验， 上样量含0.375 l血清。 电泳后， 用含有2.5%Tween20， 10mmol CaCl2， 1 mol ZnCl2和50mmolTris-Cl(pH7.5)的洗脱液洗三次， 以洗去十二烷基硫 酸钠。 然后用含1%Tween20， 10mmol CaCl2， 1 mol ZnCl2和50mmol Tris-Cl(pH7.5)的孵育液 于37。
17、 C孵育18小时， 然后用考马斯亮蓝染液进行染色30分钟， 而后用含5%冰醋酸和10%甲醇 进行脱色， 直到显出底色， 可显示出分子量92KDa的MMP-9酶原， 分子量83KDa的活性MMP-9， 72KDa的MMP-2酶原， 64KDa的活性MMP-2， image pro plus4.10版本的专业图像分析软件进 行图像分析， 记录积分光密度IOD。 0037 9、 肝肾毒性检测 0038 取适当大小的肝脏、 肾脏组织迅速放入4%多聚甲醛中固定， 48小时后进行脱水， 而 后进行石蜡包埋、 切片， HE染色， 光学显微镜下采集图像。 0039 10、 小鼠粪便大肠杆菌检测 0040 该部。
18、分实验均使用C57小鼠， 给药8周后采用无菌容器留取新鲜粪便， 将新鲜粪便 溶于无菌的生理盐水， 各组取相同重量的粪便于血平皿上均匀涂布， 37 C培养18小时后对 大肠杆菌的菌落数目进行统计。 0041 11、 透射电镜检测丹酚酸B对主动脉结构的保护作用 0042 主动脉瘤或主动脉夹层制备方法同上， 丹酚酸B的给药剂量为每天25mg/kg、 50mg/ kg， 给药时程为一个月。 试验结束后， 主动脉血管经过戊二醛及四氧化锇固定， LX-1112包 埋， 透射电镜 （Tecnai12BioTwin） 观察血管结构。 0043 12、 统计学方法 0044 以上各组实验检测数据经整理后用均值标。
19、准差表示,用t检验作统计学处理。 说 明 书 3/6 页 5 CN 104055760 B 5 0045 测试结果 0046 1、 多聚体丹酚酸可与MMP-9直接结合 0047 表面等离子共振技术 （Biacore） 可以用来检测小分子与蛋白的直接结合。 KD为平 衡解离常数， 用于评价结合能力。 KD值依次为0.8 mol/L （丹酚酸A） ,32.9 mol/L(丹酚酸B), 1.13 mol/L(丹酚酸C),10.7 mol/L(迷迭香酸)， 66.2 mol/L （紫草酸） ， 丹参素和原儿茶醛 未见明显的结合活性 （图2） 。 图2中数据显示代表性的二聚体丹酚酸、 三聚体丹酚酸和四聚。
20、 体丹酚酸与MMP-9可直接结合， 而一聚体丹酚酸对MMP-9无结合能力。 0048 2、 多聚体丹酚酸对MMP-9的抑制类型为竞争性抑制。 0049 采用酶动力学实验检测多聚体丹酚酸对MMP-9的抑制活性和抑制类型。 图3为酶动 力学实验结果图， 其中双倒数曲线 （图3A） 的分析显示多聚体丹酚酸的抑制类型为竞争型。 Ki值用于评价酶抑制活力 （图3B） ， 分别为5.741.15 mol/L(丹酚酸A) ,64.6838.44 mol/L(丹酚酸B) ,110.4333.06 mol/L(丹酚酸C) ,125.788.73 mol/L(迷迭香酸) and324.25132.15 mol/L。
21、(紫草酸)， 说明二聚体、 三聚体、 四聚体丹酚酸的MMP-9抑制活性 显著。 实验结果表明多聚体丹酚酸对MMP-9有非常好的抑制活性， 其中三聚体、 四聚体活性 最明显， 一聚体丹酚酸无抑制活性。 0050 3、 丹酚酸A对小鼠血脂、 血压无影响 0051 APOE-/-小鼠皮下埋泵Ang II28天用于研究丹酚酸A的保护作用。 图4(A)显示各组 体重在给药前后无变化。 图4为主动脉瘤或主动脉夹层动物实验结果的图， 其中图4(B)显示 APOE-/-小鼠收缩压在Ang II埋泵后2周收缩压较0周明显升高(122.410.6mmHg比148 8.14mmHg)， 且有显著性差异(P0.05)。
22、， C57小鼠血压在整个实验阶段无明显波动。 图4(C) 和4(D)显示APOE-/-小鼠较C57小鼠总胆固醇(102.351.16mmol/l比642.8020.99mmol/ l， P0.05)和总甘油三脂(28.546.79mmol/l比47.3715.07mmol/l， P0.05)明显升高 且有显著性差异。 但丹酚酸A在检测期间对血压、 血脂均无明显影响。 该实验结果表明丹酚 酸A对主动脉瘤或主动脉夹层模型动物的基 本情况的影响：（A） 丹酚酸A对动物体重无明显 影响，（B） 丹酚酸A对动物血压无明显影响，（C） 丹酚酸A对动物总胆固醇无明显影响，（D） 丹 酚酸A对甘油三酯无明显影。
23、响。 研究结果用均值标准差表示， *代表与对照相比P0.05。 0052 4、 丹酚酸A降低主动脉瘤及主动脉夹层的发生率且减轻其严重性 0053 图5表明丹酚酸A给药后明显降低APOE-/-小鼠动脉瘤的发生率(图5A， 66.67比 91.67%)， 也显示抑制动脉夹层发生的趋势(图5B， 25比33.3%)， 最大外直径较对照组比明显 降低(图5C， 1.90mm比1.55mm， P0.05)。 按主动脉损伤的严重程度， 将动脉瘤按如下标准分 成五个级别 （图5D） ： 0型， 没有动脉瘤发生； I型， 主动脉肾上动脉部位扩张但没有血栓形成； II型， 肾上动脉部位有重构现象且经常伴有血栓的。
24、存在； III型， 在II型的基础上有明显的 球状膨胀且含有血栓； IV型， 在肾上动脉区域有多个动脉瘤存在且含有血栓。 APOE-/-对照小 鼠多发生在II型、 III型、 IV型， 与之相比丹酚酸A给药组多为I型， 表明丹酚酸A降低Ang II 诱导的主动脉损伤的严重程度 （图5E） 。 丹酚酸A显著降低主动脉瘤、 主动脉夹层的发生和主 动脉的损伤程度。 图5的实验数据证明丹酚酸A对主动脉损伤的改善作用。 其中图5(A)表明 丹酚酸A能够抑制主动脉瘤的形成； 图5(B)表明丹酚酸A能够抑制主动脉夹层的形成； 图5 (C)表明丹酚酸A可以降低主动脉最大外直径， 且有显著性差异； 图5(D)为。
25、主动脉损伤严重 程度分型的代表动脉图， 从0型到IV型严重程度逐级提高； 图5(E)说明丹酚酸A降低主动脉 说 明 书 4/6 页 6 CN 104055760 B 6 损伤的严重程度。 研究结果用均值标准差表示， *代表P0.05。 0054 5、 丹酚酸A给药后明显改善肾下动脉的舒张作用 0055 肾下动脉被固定及平衡后， 每个血管环先用105M苯肾上腺素收缩稳定至平台期， 然后给予109105M乙酰胆碱测量各血管的舒张能力， 图6为采用620M-DMT微血管张力测 定的曲线图； 该曲线图数据显示丹酚酸A给 药组及强力霉素给药组对血管的舒张作用均高 于对照组， 丹酚酸A20mg/kg组于1。
26、06105M浓度乙酰胆碱时体现较对照组有更好的舒张作 用， 与C57组相当。 由此可见， 丹酚酸A对血管的舒张功能有一定的保护作用。 0056 6、 丹酚酸A明显改善主动脉组织结构的完整性 0057 图7为丹酚酸A改善损伤血管的组织学结构图。 主动脉瘤或主动脉夹层表现为中层 和外膜的细胞外基质降解， 血管中层细胞增殖， 动脉壁变薄及炎症细胞的浸入。 基质金属蛋 白酶(MMPs)可降解细胞外基质， 在主动脉瘤或主动脉夹层的形成过程中发挥重要作用。 本 实验将主动脉切片后用于HE染色(图7A)， 模型动物组血管细胞排列凌乱， 相互间的距离参 差不齐， 且细胞核大小不均， 核染色深浅不一。 丹酚酸A。
27、给药组， 特别是20mg/kg丹酚酸A给药 组的血管细胞排列相对整齐， 细胞大小均匀， 染色深浅相对一致， 说明血管的结构完整， 丹 酚酸A明显改善血管内外三层结构的完整性， 细胞排列相对规则。 天狼星红用于对胶原进行 染色 （图7B） ， 可见胶原明显深染， 模型动物的血管各层之间间隔距离大小不一， 有多处出现 断裂现象， 而丹酚酸A给药组可见血管各层相对均匀一致， 各层之间距离基本维持稳定， 基 本未见明显的断裂之处， 说明丹酚酸A处理组的血管外膜结构较为完整， 各层结构均匀整 齐。 0058 7、 图8为明胶酶谱的方法评价丹酚酸A的酶抑制活性的实验结果图； 丹酚酸A明显 抑制主动脉瘤或主。
28、动脉夹层小鼠血清中MMP-9活性。 采用明胶酶谱对血清中MMP-2， MMP-9的 活性进行检测和评价。 如图8所示， 丹酚酸A对MMP-9有明显的抑制作用。 0059 8、 丹酚酸A无明显肝毒性 0060 图9为对肝脏组织采用HE染色进行组织学评价的照片， 由图9可见， 正常对照组肝 组织染色均匀， 细胞排列整齐有序。 与C57正常对照组相比， 强力霉素20mg/kg组明显可见肝 细胞肿胀、 肝血窦挤压、 小叶结构改变。 而 高、 低丹酚酸A给药组无明显肝脏毒性。 可见， 丹 酚酸A对肝组织无明显毒性， 而阳性MMP抑制剂强力霉素呈现明显肝毒性。 0061 9、 丹酚酸A未见明显菌群失调副作。
29、用 0062 对各组小鼠的粪便进行菌群培养发现， 强力霉素(20mg/kg)组小鼠肠道内小肠细 菌的数量明显减少， 肠道内正常菌群的平衡遭到破坏， 出现明显菌群失调， 而丹酚酸A无此 副作用。 具体测试结果示于图10， 实验结果表明丹酚酸A无诱导菌群失调的副作用， 而广谱 MMP抑制剂强力霉素则导致明显的菌群失调。 0063 10、 丹酚酸B对主动脉瘤或主动脉夹层具有防治作用 0064 采用电镜对小鼠的主动脉血管的结构进行细致评价 （图11） ， 图11的电镜照片显示 丹酚酸B可明显改善损伤小鼠主动脉的细胞结构(保护平滑肌细胞、 内皮细胞)， 改善胶原和 弹力蛋白层的结构完整性。 动物模型的制。
30、备方法如前所诉， 检测方法为电镜。 丹酚酸B明显 改善主动脉内皮细胞、 中间层、 外膜的组织结构的完整性。 0065 11、 结论 0066 基质金属蛋白酶， 特别是基质金属蛋白酶-9在主动脉瘤或主动脉夹层的发生中起 说 明 书 5/6 页 7 CN 104055760 B 7 到非常关键的作用。 多聚体丹酚酸表现出明显的MMP-9抑制活性， 代表性三聚体化合物丹酚 酸A、 四聚体化合物丹酚酸B皆在动物模型上表现出明显的疾病防治效果,说明多聚体丹酚 可用于主动脉瘤或主动脉夹层的预防和治疗。 说 明 书 6/6 页 8 CN 104055760 B 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/8 页。
31、 9 CN 104055760 B 9 图3 说 明 书 附 图 2/8 页 10 CN 104055760 B 10 图4 说 明 书 附 图 3/8 页 11 CN 104055760 B 11 图5 说 明 书 附 图 4/8 页 12 CN 104055760 B 12 图6 图7A 说 明 书 附 图 5/8 页 13 CN 104055760 B 13 图7B 图8 说 明 书 附 图 6/8 页 14 CN 104055760 B 14 图9 图10 说 明 书 附 图 7/8 页 15 CN 104055760 B 15 图11 说 明 书 附 图 8/8 页 16 CN 104055760 B 16 。