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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711271341.2 (22)申请日 2017.12.05 (71)申请人 海南省农业科学院植物保护研究所 地址 571100 海南省海口市琼山区流芳路9 号 (72)发明人 赵志祥 严婉荣 肖敏 肖彤斌 陈圆 陈绵才 (74)专利代理机构 北京国坤专利代理事务所 (普通合伙) 11491 代理人 赵红霞 (51)Int.Cl. A01K 67/033(2006.01) A01G 7/06(2006.01) (54)发明名称 一种利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法 (57)。
2、摘要 本发明属于植物病原线虫技术领域， 公开了 一种利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法， 采用 透明的塑料钵， 钵底打洞， 播种通心菜种子或直 接种植通心菜实生苗， 接入根结线虫卵块； 吸取 卵块， 并分离根结线虫。 本发明采用透明的塑料 钵， 钵底打4-5个拇指粗的小洞用于透气和防治 淹水， 播种通心菜种子或直接种植通心菜实生 苗， 待苗长到根系足够发达后， 接入线虫卵块； 采 用透明的塑料钵无需拔出根部可以方便地随时 观察根结形成的动态过程； 需要根结线虫时， 可 以剪下部分含有卵块的根， 余下的继续生长， 又 能长出大量的新根用于扩繁根结线虫； 不需要重 新种植新的植株， 省事， 省时， 。
3、省工， 省材。 权利要求书1页 说明书10页 附图2页 CN 107996522 A 2018.05.08 CN 107996522 A 1.一种利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法， 其特征在于， 所述利用通心菜扩繁植物 根结线虫的方法采用透明的塑料钵， 钵底打洞， 播种通心菜种子或直接种植通心菜实生苗， 接入根结线虫卵块； 吸取卵块， 并分离根结线虫。 2.如权利要求1所述的利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法， 其特征在于， 所述利用通 心菜扩繁植物根结线虫的方法包括以下步骤： 步骤一， 从种植并接种30d以上的番茄苗上分别分离爪哇根结线虫、 象耳豆根结线虫和 南方根结线虫的卵块； 步骤二， 通。
4、心菜种子用1次氯酸钠溶液浸泡消毒3min后， 无菌水冲洗， 并直接播种于 透明塑料钵； 种植好的植株放入线虫资源保存圃中， 每种植株种植40钵； 待叶片生长到5叶1 芯时， 分别接种爪哇根结线虫、 象耳豆根结线虫和南方根结线虫， 每种根结线虫接种10钵； 步骤三， 长到5叶1芯时， 用无菌小铁棍沿着植株茎秆往下挖月2cm的洞穴； 同时， 1mL枪 头剪去尖头， 用1mL移液器套上去尖头的枪头， 吸取1mL卵块悬浮液， 加入到通心菜的洞穴 中， 接种完用周围的土壤将洞穴填平； 步骤四， 通心菜接种根结线虫30d后， 透过自制的透明塑料钵外壁， 能清晰地观察到根 结和卵块， 剪取部分带卵块的根系，。
5、 挑取根系上的卵块， 孵化二龄幼虫， 用于后续室内生物 测定和分子生物学等试验， 余下部分继续种植， 又能长出大量的新根， 用于扩繁三种根结线 虫。 3.如权利要求2所述的利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法， 其特征在于， 所述步骤二 中通心菜种子用1次氯酸钠溶液浸泡消毒3min后， 无菌水冲洗， 带4-6片叶的3-5段通心菜 茎秆直接栽种透明塑料钵中， 每钵播种3-5粒。 4.一种利用权利要求13任意一项所述利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法繁殖的 植物根结线虫。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107996522 A 2 一种利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法 技术领域 0001 本发。
6、明属于植物病原线虫技术领域， 尤其涉及一种利用通心菜扩繁植物根结线虫 的方法。 背景技术 0002 根结线虫主要包括南方根结线虫(M.incognita)、 爪哇根结线虫(M.javanica)、 花 生根结线虫(M.arenaria)、 北方根结线虫(M.hapla)和象耳豆根结线虫(M.enterolobii)等 5种。 筛选利用抗植物根结线虫的抗病品种、 鉴定抗性基因、 功能基因的克隆表达以及植物 根结线虫的农业、 物理、 生物和化学防治方法的研究等都需要大量培养、 扩繁和分离植物根 结线虫。 目前， 植物根结线虫通常是活体寄生的， 主要利用茄科植物(如烟草、 番茄、 茄子、 辣 椒等)。
7、、 葫芦科植物(黄瓜、 丝瓜、 苦瓜等)实生苗作为宿主， 宿主范围较窄。 导致缺陷的原因 主要有三点： 其一， 这些作物受季节性的约束较大。 海南等热带地区， 夏季温棚中温度过高， 不宜种植辣椒、 茄子、 番茄和一些瓜类作物， 即使种植， 生根也较少， 不利于根结线虫的侵染 和繁殖； 其二、 根结线虫卵块的获得必须在破坏其根系的前提下， 而茄科、 葫芦科植物根系 不发达， 受破坏无法正常生长， 需要重新种苗； 其三、 上述作物从苗期到成株期需要的时间 很长， 线虫侵染后根系老化以至植株无法正常生长影响根结线虫的大量扩繁所经历的时间 又较短。 因而， 不能在短时间内获得大量的卵块和二龄幼虫， 影。
8、响抗病品种筛选和根结线虫 防控等研究进度。 而通心菜生长势、 根系活力、 产量、 生长周期、 对高温的耐受性和接种后扩 繁线虫的能力较强； 且通心菜的栽培方法简单， 对环境的适应性较强， 具庞大和持久的根 系， 以及再生根的能力， 能为根结线虫接种后的长期繁殖和保种提供更好的基础。 对于实验 室用于长期保存根结线虫种质资源而言， 具有重要的研究价值和现实意义。 0003 综上所述， 现有技术存在的问题是： 目前植物根结线虫活体寄生方法存在受季节 性的约束较大， 生根较少； 原有的扩繁根结线虫的植物根系不发达， 受破坏无法正常生长， 需要重新种苗； 且从苗期到成株期需要的时间很长， 线虫侵染后根。
9、系老化以至植株无法正 常生长； 此外， 还有再生根能力较差等缺点， 不利于根结线虫的侵染和繁殖， 影响抗病品种 筛选和根结线虫防控。 发明内容 0004 针对现有技术存在的问题， 本发明提供了一种利用通心菜扩繁植物根结线虫的方 法。 0005 本发明是这样实现的， 一种利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法， 所述利用通心 菜扩繁植物根结线虫的方法采用透明的塑料钵， 钵底打洞， 播种通心菜种子或直接种植通 心菜实生苗， 接入根结线虫卵块； 吸取卵块， 并分离根结线虫。 0006 进一步， 所述利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法包括以下步骤： 0007 步骤一， 从种植并接种30d以上的番茄苗上分别分离。
10、爪哇根结线虫、 象耳豆根结线 虫和南方根结线虫的卵块； 说 明 书 1/10 页 3 CN 107996522 A 3 0008 步骤二， 通心菜种子用1次氯酸钠溶液浸泡消毒3min后， 无菌水冲洗， 并直接播 种于透明塑料钵； 种植好的植株放入线虫资源保存圃中， 每种植株种植40钵； 待叶片生长到 5叶1芯时， 分别接种爪哇根结线虫、 象耳豆根结线虫和南方根结线虫， 每种根结线虫接种10 钵； 0009 步骤三， 长到5叶1芯时， 用无菌小铁棍沿着植株茎秆往下挖月2cm的洞穴； 同时， 1mL枪头剪去尖头， 用1mL移液器套上去尖头的枪头， 吸取1mL卵块悬浮液， 加入到通心菜的 洞穴中， 。
11、接种完用周围的土壤将洞穴填平。 0010 步骤四， 通心菜接种根结线虫30d后， 透过自制的透明塑料钵外壁， 能清晰地观察 到根结和卵块， 剪取部分带卵块的根系， 挑取根系上的卵块， 孵化二龄幼虫， 用于后续室内 生物测定和分子生物学等试验， 余下部分继续种植， 又能长出大量的新根， 用于扩繁三种根 结线虫， 避免了重新种植新苗的麻烦。 0011 进一步， 所述步骤二中通心菜种子用1次氯酸钠溶液浸泡消毒3min后， 无菌水冲 洗， 带4-6片叶的3-5段通心菜茎秆直接栽种透明塑料钵中， 每钵播种3-5粒。 0012 本发明的另一目的在于提供一种利用所述利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法 繁殖的植。
12、物根结线虫。 0013 本发明采用透明的塑料钵， 钵底打4-5个拇指粗的小洞用于透气和防治淹水， 播种 通心菜种子或直接种植通心菜实生苗， 待苗长到根系足够发达后， 接入线虫卵块； 采用透明 的塑料钵无需拔出根部可以方便地随时观察根结形成的动态过程； 需要根结线虫时， 可以 剪下部分含有卵块的根， 余下的继续生长， 又能长出大量的新根用于扩繁根结线虫， 不需要 重新种植新的植株。 同时， 通过与黄瓜和番茄的比较试验， 研究通心菜扩繁根结线虫的效 果。 具体方案如下： 0014 每钵保留通心菜、 番茄苗和黄瓜苗3株， 待其长到5叶1芯时， 用无菌小铁棍(直径 3mm)沿着植株茎秆往下挖月2cm左。
13、右的洞穴， 直到能看到植株的根。 同时， 将1mL枪头剪去尖 头(以免伤着卵块或接种时枪头被土壤、 沙粒堵住)， 接下来用1mL移液器套上去尖头的枪 头， 吸取1mL卵块悬浮液(含卵块35个)， 加入到通心菜、 番茄和黄瓜根部附近的洞穴中， 接 种完用周围的土壤将洞穴填平， 接种后每天观察透明塑料钵中植株根系的生长情况， 根结 线虫侵染形成根结情况和繁殖虫量等特征。 每处理分别于15d和30d时， 取出3钵用于调查根 系长度、 质量以及一级根和二级根的数量等指标。 每处理余下4钵植株中， 1钵于接种后50d 剪去一半的根系后继续种植， 比较通心菜、 番茄和黄瓜的生长情况、 新根的生长情况以及卵。
14、 块的扩繁情况； 余下3钵， 在根结线虫接种繁殖试验中， 于接种线虫50d后， 观察、 拍照， 并统 计根结数、 卵块数、 二龄幼虫数以及根系线虫总数。 0015 本发明是这样实现的： (1)通心菜、 番茄和黄瓜根系的生长状况比较。 种植通心菜、 番茄苗和黄瓜苗15d、 30d以后， 通心菜、 番茄和黄瓜的根系长势均较好。 根系长度依次为通 心菜黄瓜番茄； 根系质量和一级根系的数量依次为黄瓜通心菜番茄； 二级根系的 数量依次为通心菜黄瓜番茄， 且30d时通心菜和黄瓜的二级根系数量相近， 差异不显 著。 番茄产生的二级根系数量最少， 始终不超过50条。 30d后， 随着种植时间的延长， 通心菜 。
15、的二级根系的数量呈急速上升趋势； 而黄瓜和番茄二级根系的数量趋于平缓。 因而， 通心菜 更有利于后期各种根结线虫的侵染和扩繁。 比较根系长度、 根系质量、 二级根系数量和通心 菜、 番茄、 黄瓜等根结线虫的良好寄主生长的时间。 通心菜具有根系长度长， 二级根系数量 说 明 书 2/10 页 4 CN 107996522 A 4 多， 产生新根能力强， 生存、 存活时间长等优点。 0016 (2)通心菜、 黄瓜和番茄对夏季高温的耐受性和生长周期比较。 番茄和黄瓜分别在 种植90d左右时植株开始黄萎， 根系出现部分腐烂； 且黄瓜需要搭架， 如不搭架则根系更加 不发达， 其黄萎的时间会进一步缩短； 。
16、同时， 番茄和黄瓜均属于喜温蔬菜， 生长适温20-30 ， 不耐夏季高温， 35以上生长和结实不良。 通过控温手段在线虫圃中种植黄瓜和番茄以 扩繁根结线虫， 将人为地增加了人力、 物力成本。 而空心菜属于耐热的蔬菜， 30左右生长 较好， 35-40仍能正常生长； 且种植300d左右的时间后根系才开始腐烂， 其间虽然地上部 分茎叶变黄， 但从茎基部将老黄的茎叶剪去后， 从茎基能长出新的茎叶， 同时还有新的根系 产生； 另外， 因试验需要剪取部分根之后， 重新种回塑料钵中， 又能从茎基部长出大量的新 根， 保证了植株的正常生长。 这充分说明了供试的通心菜、 番茄和黄瓜3种植物中， 空心菜根 系最。
17、大、 生长周期最长、 对高温的耐受性较好， 可能更有利于根结线虫的大量繁殖和长期保 存。 0017 (3)剪去一半的根系后通心菜、 番茄和黄瓜的生长、 新根产生以及卵块的扩繁情 况。 0018 接种50d剪去一半的根系后继续种植， 第65d时调查， 结果通心菜生长良好， 还能继 续生长出大量的新根， 其根系长度26.3cm， 较50d时(25.6cm)有所生长， 根系质量恢复到剪 去之前的水平， 为8.7g/株， 一级根系数量为65条/株， 二级根系数量为2470条/株， 均比剪去 一半之后要多得多， 说明通心菜生长适应性较强； 剪去一半后番茄和黄瓜生长较差， 植株矮 小， 已有一半以上的叶片。
18、黄花枯死， 根系长度与剪去之前无差异， 分别为7.6cm和22.3cm， 根 系质量、 一级根系的数量和二级根系的数量仅为剪去之前的一半， 几乎无新根生长。 0019 第65d时调查， 三种线虫均能够很好地侵染通心菜、 番茄和黄瓜的根系。 由于通心 菜能够快速地长出大量的新根， 有利于根结线虫的进一步侵染。 因而， 在这三种植物的根系 上， 接种三种根结线虫所产生的根结数、 二龄幼虫数、 卵块数、 成熟雌虫数和根系及根围土 壤中根结线虫的总量均是通心菜黄瓜番茄。 而三龄和四龄幼虫数则恰恰相反， 番茄 黄瓜通心菜， 其中， 番茄上略大于黄瓜， 差异不显著。 0020 (4)三种根结线虫在通心菜、。
19、 黄瓜和番茄上的接种繁殖效果。 通心菜接种象耳豆根 结线虫、 南方根结线虫和爪哇根结线虫等三种不同的线虫， 最早出现肉眼可见根结的时间 以及形成根结的数量有一定的差异。 通过透明的塑料钵外壁直接观察， 接种三种不同的根 结线虫后在2533d之间通心菜根部均可见直径约1.2mm左右肉眼可见的根结， 其中最早观 察到形成根结的是象耳豆根结线虫， 为25d； 其次为南方根结线虫， 为28d； 最迟观察到形成 根结的是爪哇根结线虫， 为33d。 而对照黄瓜 “南优二号青瓜” 形成三种肉眼可见根结的时间 分别为28d、 31d和35d； 对照番茄品种 “粤满红番茄” 形成三种肉眼可见根结的时间分别为 2。
20、9d、 32d和35d。 0021 形成肉眼可见根结的时间快慢与形成根结的数量有一定的相关性， 即通心菜、 黄 瓜和番茄接种线虫后肉眼观察到根结所需要时间越早， 其形成的根结数也越多， 这也是观 察到的通心菜上的三种线虫根结数远大于黄瓜和番茄的主要原因。 0022 一般而言， 同种寄主作物， 象耳豆根结线虫的侵染为害要高于南方根结线虫和爪 哇根结线虫， 为害程度为象耳豆根结线虫南方根结线虫爪哇根结线虫； 对于同种根结 线虫而言， 在这3种寄主植物的根系上， 根结数、 二龄幼虫数、 成熟雌虫数、 卵块数以及根系 说 明 书 3/10 页 5 CN 107996522 A 5 线虫总数均是通心菜黄。
21、瓜番茄， 并且差异达极显著水平； 而三龄幼虫和四龄幼虫数则 是番茄黄瓜通心菜， 差异极显著， 这可能与番茄和黄瓜受根结线虫侵染后， 根系极易老 化从而缩短了进入成熟幼虫期的时间有关。 此外， 通心菜接种三种根结线虫后， 生长周期仍 可达10个月左右， 而黄瓜和番茄接种三种根结线虫后， 顶多生长3个月左右， 根系就已经完 全腐烂或老化。 附图说明 0023 图1是本发明实施例提供的利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法流程图。 0024 图2是本发明实施例提供的通心菜、 黄瓜和番茄根系长度的比较示意图。 0025 图3是本发明实施例提供的通心菜、 黄瓜和番茄根系质量的比较示意图。 0026 图4是本发。
22、明实施例提供的通心菜、 黄瓜和番茄种植一段时间后一级根系的数量 比较示意图。 0027 图5是本发明实施例提供的通心菜、 黄瓜和番茄种植一段时间后二级根系的数量 比较示意图。 具体实施方式 0028 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 0029 通心菜属于叶菜类， 一年四季均可种植， 受季节性的约束较弱， 其根系发达， 适合 在沙性土壤中种植， 沙性土壤透气性好； 同时， 线虫侵染后的根虽然也老化， 能在短时间内 长出大量的新根， 不会影响通心菜的正。
23、常生长， 而且长出的新根又有利于根结线虫种群的 扩繁。 0030 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。 0031 如图1所示， 本发明实施例提供的利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法包括以下 步骤： 0032 S101： 从已经种植并接种30d以上的 “金圣” 番茄苗上分别分离爪哇根结线虫、 象耳 豆根结线虫和南方根结线虫的卵块用于接种； 0033 S102： 通心菜种子用1次氯酸钠溶液浸泡消毒3min后， 无菌水冲洗， 并直接播种 (或是带4-6片叶的3-5段通心菜茎秆直接栽种)于直径为20cm自制透明塑料钵中， 每钵播种 3-5粒； 种植好的植株放入线虫资源保存圃中， 每种植株种植40。
24、钵； 待叶片生长到5叶1芯(约 25d左右)时， 分别接种3种根结线虫， 每种根结线虫接种10钵； 0034 S103： 长到5叶1芯时， 用无菌小铁棍(直径3mm)沿着植株茎秆往下挖月2cm左右的 洞穴， 直到能看到植株的根； 同时， 将1mL枪头剪去尖头(以免伤着卵块或接种时枪头被土 壤、 沙粒堵住)， 接下来用1mL移液器套上去尖头的枪头， 吸取1mL卵块悬浮液(含卵块35 个)， 加入到通心菜的洞穴中， 接种完用周围的土壤将洞穴填平。 0035 S104： 通心菜接种根结线虫30d后， 透过自制的透明塑料钵外壁， 能清晰地观察到 根结和卵块， 剪取部分带卵块的根系， 挑取根系上的卵块，。
25、 孵化二龄幼虫， 用于后续室内生 物测定和分子生物学等试验， 余下部分继续种植， 又能长出大量的新根， 用于扩繁三种根结 说 明 书 4/10 页 6 CN 107996522 A 6 线虫， 避免了重新种植新苗的麻烦。 0036 下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。 0037 本发明实施例提供的利用通心菜扩繁植物根结线虫的方法具体包括以下步骤： 0038 (1)利用叶菜类植物通心菜作为宿主， 建立了室内扩繁植物根结线虫的新方法， 通 心菜品种 “海南青骨柳叶空心菜” 和对照黄瓜品种 “南优二号青瓜” 购于海南金华玉种子门 市部。 对照番茄品种为 “粤满红番茄” ， 购于广州旺。
26、优种业研究开发有限公司。 根结线虫样品 南方根结线虫(M .incognita)、 爪哇根结线虫(M .javanica)和象耳豆根结线虫 (M.enterolobii)均由本研究所线虫资源圃保存， 在野外采集。 0039 (2)用于接种的三种根结线虫卵块的获得： 首先从之前已经种植并接种30d以上的 “金圣” 番茄苗上分别分离爪哇根结线虫、 象耳豆根结线虫和南方根结线虫的卵块用于接 种， 具体方法是：“金圣” 番茄品种的种子经次氯酸钠消毒， 并用无菌水清洗处理后， 在22 28避光条件下催芽3d， 待其破白后， 移入直径1020cm的红色塑料花盆中种植， 每盆种1 3株苗。 花盆中的土壤(经。
27、121， 高温消毒30min)和番茄苗的生长条件与后续种植通心菜 和黄瓜的一致。 移栽25d的番茄苗按照常规方法(即将1ml无菌枪头， 剪去尖头后， 吸取1ml含 1-3个南方根结线虫(M.incognita)、 爪哇根结线虫(M.javanica)或象耳豆根结线虫 (M.enterolobii)的卵块， 或者孵化后含200-300头二龄幼虫)接种上述三种根结线虫。 番茄 苗移栽后第28天每盆浇复合肥营养液1次。 随后， 每隔2d观察番茄面长势， 并适时浇水， 防止 土壤干燥和板结， 从而影响番茄苗生长。 接种第49d(7周)后拔出番茄苗， 用无菌水根部后再 用解剖针或接种针挑取根上的线虫卵块。
28、， 放入盛有无菌水的透明玻璃培养皿中。 0040 (3)通心菜苗的生长： 通心菜种子和对照番茄种子、 黄瓜种子分别用1次氯酸钠 溶液浸泡消毒3min后， 无菌水冲洗， 并直接播种(或是带4-6片叶的3-5段通心菜茎秆直接栽 种)于直径为20cm自制透明塑料钵中， 每钵播种3-5粒。 土壤由河沙和粘土以1:1的比例配置 而成， 配好后湿热灭菌法灭菌(121， 30min)。 种植好的植株放入线虫资源保存圃中， 每种 植株种植40钵， 其中每30钵用于接种根结线虫， 另外10钵备用， 防备缺苗、 少苗、 中途死苗或 其它不确定因素发生时需要补钵的情况。 调节其温度2528， 每天浇适量的水， 并少。
29、量喷 雾以保证线虫圃中的湿度为80以上， 待其叶片生长到5叶1芯(约25d左右)时， 分别接种上 述3种根结线虫， 每种根结线虫接种10钵。 对照番茄苗、 黄瓜苗扩繁根结线虫的方法类似于 通心菜种子直接播种的方法， 每天浇水， 保证土壤湿润， 利于幼苗的萌发和生长， 同样每种 根结线虫接种10钵。 0041 (4)根结线虫的接种和扩繁： 每钵保留通心菜、 番茄苗和黄瓜苗3株， 待其长到5叶1 芯时， 用无菌小铁棍(直径3mm)沿着植株茎秆往下挖月2cm左右的洞穴， 直到能看到植株的 根。 同时， 将1mL枪头剪去尖头(以免伤着卵块或接种时枪头被土壤、 沙粒堵住)， 接下来用 1mL移液器套上去。
30、尖头的枪头， 吸取1mL卵块悬浮液(含卵块35个)， 加入到通心菜、 番茄和 黄瓜根部附近的洞穴中， 接种完用周围的土壤将洞穴填平， 接种后每天观察透明塑料钵中 植株根系的生长情况， 根结线虫侵染形成根结情况和繁殖虫量等特征。 每处理分别于15d和 30d时， 取出3钵用于调查根系长度、 质量以及一级根和二级根的数量等指标。 每处理余下4 钵植株中， 1钵于接种后50d剪去一半的根系后继续种植， 比较通心菜、 番茄和黄瓜的生长情 况、 新根的生长情况以及卵块的扩繁情况； 余下3钵， 在根结线虫接种繁殖试验中， 于接种线 虫50d后， 观察、 拍照， 并统计根结数、 卵块数、 二龄幼虫数以及根系。
31、线虫总数。 根内线虫数量 说 明 书 5/10 页 7 CN 107996522 A 7 统计采用组织染色的方法， 土壤中根结线虫采用改进贝曼漏斗法分离后进行统计。 用DPS数 据处理系统和SPSS19.0统计学软件对试验数据进行统计分析。 0042 下面结合对比对本发明的应用效果作详细的描述。 0043 1、 通心菜、 番茄和黄瓜根系的生长状况比较 0044 如下图2、 图3、 图4、 图5所示， 种植通心菜、 番茄苗和黄瓜苗15d、 30d以后， 通心菜、 番茄和黄瓜的根系长势均较好。 根系长度依次为通心菜黄瓜番茄； 根系质量和一级根 系的数量依次为黄瓜通心菜番茄； 二级根系的数量依次为通。
32、心菜黄瓜番茄， 且30d 时通心菜和黄瓜的二级根系数量相近， 差异不显著。 番茄产生的二级根系数量最少， 始终不 超过50条。 30d后， 随着种植时间的延长， 通心菜的二级根系的数量呈急速上升趋势； 而黄瓜 和番茄二级根系的数量趋于平缓。 因而， 通心菜更有利于后期各种根结线虫的侵染和扩繁。 比较根系长度、 根系质量、 二级根系数量和通心菜、 番茄、 黄瓜等根结线虫的良好寄主生长 的时间。 通心菜具有根系长度长， 二级根系数量多， 产生新根能力强， 生存、 存活时间长等优 点， 因此， 不难看出通心菜是最为理想的植物根结线虫培养和繁殖材料。 0045 2、 通心菜、 黄瓜和番茄对夏季高温的耐。
33、受性和生长周期比较 0046 观察发现， 番茄和黄瓜分别在种植90d左右时植株开始黄萎， 根系出现部分腐烂； 且黄瓜需要搭架， 如不搭架则根系更加不发达， 其黄萎的时间会进一步缩短； 同时， 番茄和 黄瓜均属于喜温蔬菜， 生长适温20-30， 不耐夏季高温， 35以上生长和结实不良。 通过控 温手段在线虫圃中种植黄瓜和番茄以扩繁根结线虫， 将人为地增加了人力、 物力成本。 而空 心菜属于耐热的蔬菜， 30左右生长较好， 35-40仍能正常生长； 且种植300d左右的时间 后根系才开始腐烂， 其间虽然地上部分茎叶变黄， 但从茎基部将老黄的茎叶剪去后， 从茎基 能长出新的茎叶， 同时还有新的根系产。
34、生； 另外， 因试验需要剪取部分根之后， 重新种回塑 料钵中， 又能从茎基部长出大量的新根， 保证了植株的正常生长。 这充分说明了供试的通心 菜、 番茄和黄瓜3种植物中， 空心菜根系最大、 生长周期最长、 对高温的耐受性较好， 可能更 有利于根结线虫的大量繁殖和长期保存。 0047 3、 剪去一半的根系后通心菜、 番茄和黄瓜的生长、 新根产生以及卵块的扩繁情况 0048 表1所示， 接种50d剪去一半的根系后继续种植， 第65d时调查， 结果通心菜生长良 好， 还能继续生长出大量的新根， 其根系长度26.3cm， 较50d时(25.6cm)有所生长， 根系质量 恢复到剪去之前的水平， 为8.7。
35、g/株， 一级根系数量为65条/株， 二级根系数量为2470条/株， 均比剪去一半之后要多得多， 说明通心菜生长适应性较强； 剪去一半后番茄和黄瓜生长较 差， 植株矮小， 已有一半以上的叶片黄花枯死， 根系长度与剪去之前无差异， 分别为7.6cm和 22.3cm， 根系质量、 一级根系的数量和二级根系的数量仅为剪去之前的一半， 几乎无新根生 长， 说明番茄和黄瓜生长适应性较差， 在根结线虫继代培养扩繁方面需不间断地补充新苗， 以满足后续实验所需虫源。 0049 表1 剪去一半的根系后第65d通心菜、 番茄和黄瓜的生长情况 0050 说 明 书 6/10 页 8 CN 107996522 A 8。
36、 0051 0052 注： 表中数据为3次重复的平均值。 同列数据后所标小写字母相同者， 表示在P 0.05水平上差异不显著(DMRT法)。 反之， 则差异显著， 下表同。 0053 通过接种象耳豆根结线虫、 南方根结线虫和爪哇根结线虫(表2)， 第65d时调查， 三 种线虫均能够很好地侵染通心菜、 番茄和黄瓜的根系。 由于通心菜能够快速地长出大量的 新根， 有利于根结线虫的进一步侵染。 因而， 在这三种植物的根系上， 接种三种根结线虫所 产生的根结数、 二龄幼虫数、 卵块数、 成熟雌虫数和根系及根围土壤中根结线虫的总量均是 通心菜黄瓜番茄。 而三龄和四龄幼虫数则恰恰相反， 番茄黄瓜通心菜， 。
37、其中， 番茄 上略大于黄瓜， 差异不显著。 出现这种情况的主要原因可能是番茄和黄瓜剪去一半的根系 后， 不能长出大量的新根， 加速了植株的老化， 线虫无法吸收幼嫩根系的营养物质， 缩短了 其进入成熟期的时间。 而线虫在侵染通心菜的新根后， 产生了大量的卵块和后续分子生物 学试验和生物防治试验所需的二龄幼虫。 0054 表2 三种根结线虫在剪去一半的通心菜、 黄瓜和番茄根系上65d的繁殖情况 0055 0056 4、 三种根结线虫在通心菜、 黄瓜和番茄上的接种繁殖效果 0057 “海南青骨柳叶空心菜” 、 对照黄瓜品种 “南优二号青瓜” 和对照番茄品种 “粤满红 番茄” 接种象耳豆根结线虫、 南。
38、方根结线虫和爪哇根结线虫卵块后均成功繁殖了根结线虫。 通心菜接种象耳豆根结线虫、 南方根结线虫和爪哇根结线虫等三种不同的线虫， 最早出现 肉眼可见根结的时间以及形成根结的数量有一定的差异(表3)。 通过透明的塑料钵外壁直 接观察， 接种三种不同的根结线虫后在2533d之间通心菜根部均可见直径约1.2mm左右肉 眼可见的根结， 其中最早观察到形成根结的是象耳豆根结线虫， 为25d； 其次为南方根结线 虫， 为28d； 最迟观察到形成根结的是爪哇根结线虫， 为33d。 而对照黄瓜 “南优二号青瓜” 形 说 明 书 7/10 页 9 CN 107996522 A 9 成三种肉眼可见根结的时间分别为2。
39、8d、 31d和35d； 对照番茄品种 “粤满红番茄” 形成三种肉 眼可见根结的时间分别为29d、 32d和35d。 0058 形成肉眼可见根结的时间快慢与形成根结的数量有一定的相关性， 即通心菜、 黄 瓜和番茄接种线虫后肉眼观察到根结所需要时间越早， 其形成的根结数也越多， 这也是观 察到的通心菜上的三种线虫根结数远大于黄瓜和番茄的主要原因； 而形成肉眼可见根结的 时间快慢与分离获得的卵块数以及分离获得的线虫总数的多少之间无相关性.通过显微观 察， 分离获得的根结线虫在不停地运动， 具有旺盛的活力。 0059 表3 通心菜、 黄瓜和番茄各自形成根结的最早时间 0060 0061 接种50d后。
40、观察(表49)， 通心菜、 黄瓜和番茄根系上都一定程度的受到了象耳豆 根结线虫、 南方根结线虫和爪哇根结线虫的侵染。 其侵染为害程度与根结线虫种类和寄主 品种类型有一定的关系。 一般而言， 同种寄主作物， 象耳豆根结线虫的侵染为害要高于南方 根结线虫和爪哇根结线虫， 为害程度为象耳豆根结线虫南方根结线虫爪哇根结线虫； 对于同种根结线虫而言， 在这3种寄主植物的根系上， 根结数、 二龄幼虫数、 成熟雌虫数、 卵 块数以及根系线虫总数均是通心菜黄瓜番茄， 并且差异达极显著水平； 而三龄幼虫和 四龄幼虫数则是番茄黄瓜通心菜， 差异极显著， 与番茄和黄瓜受根结线虫侵染后， 根系 极易老化从而缩短了进入。
41、成熟幼虫期的时间有关。 此外， 通心菜接种三种根结线虫后， 生长 周期仍可达10个月左右， 而黄瓜和番茄接种三种根结线虫后， 顶多生长3个月左右， 根系就 已经完全腐烂或老化。 0062 表4 象耳豆根结线虫在通心菜、 黄瓜和番茄根系上接种培养50d的繁殖情况 0063 0064 表5 南方根结线虫在通心菜、 黄瓜和番茄根系上接种培养50d的繁殖情况 说 明 书 8/10 页 10 CN 107996522 A 10 0065 0066 表6 爪哇根结线虫在通心菜、 黄瓜和番茄根系上接种培养50d的繁殖情况 0067 0068 表7 象耳豆根结线虫、 南方根结线虫和爪哇根结线虫在通心菜根系上接。
42、种培养 50d的繁殖情况 0069 0070 表8 象耳豆根结线虫、 南方根结线虫和爪哇根结线虫在黄瓜根系上接种培养50d 的繁殖情况 0071 0072 表9 象耳豆根结线虫、 南方根结线虫和爪哇根结线虫在番茄根系上接种培养50d 的繁殖情况 说 明 书 9/10 页 11 CN 107996522 A 11 0073 0074 本发明通心菜作为植物根结线虫扩繁的寄主优于黄瓜和番茄， 利用通心菜成功扩 繁了象耳豆根结线虫、 南方根结线虫和爪哇根结线虫， 丰富了目前繁殖根结线虫的宿主材 料， 克服了通常利用茄科植物的烟草、 番茄和辣椒作为宿主； 或者利用葫芦科植物黄瓜、 苦 瓜和丝瓜等作为宿主。
43、， 宿主范围较单一的问题。 另外， 利用透明塑料钵替代通常使用的陶瓷 和红、 黑色塑料盆钵繁殖根结线虫， 无需拔出根部就可以方便地随时观察根结形成的动态 过程； 并且， 使用定制的透明塑料钵底部无透水孔， 因此， 避免了给植株浇水繁殖管理过程 中可能造成线虫逃逸对周围土壤的污染问题。 本发明在海南热带高温高湿的气候条件下， 利用通心菜替代黄瓜和番茄， 成功繁殖了三种植物根结线虫， 为繁殖和分离根结线虫提供 了一条新途径， 也为抗根结线虫作物品种的鉴定和根结线虫的防控研究提供有益的基础。 由于黄瓜和番茄根系生长期较短， 一般3个月左右的时间就开始腐烂， 通心菜不仅具有较庞 大的根系， 而且生长周。
44、期很长， 可达10个月左右。 当需要根结或卵块用于后续试验时， 可以 先剪下部分根系， 余下部分继续种植， 又能长出大量的根系用于根结线虫的扩繁； 当通心菜 地上部分茎叶变黄后， 可以从茎基部将老黄的地上部剪去， 然后会从茎基长出新的茎叶， 同 时还会有新的根系产生， 不像番茄和黄瓜一样， 无需重新种植新苗用于后续的线虫扩繁； 通 心菜生长势、 根系活力、 产量、 生长周期、 对高温的耐受性以及接种后根结数、 卵块数、 二龄 幼虫数等均明显优于番茄和黄瓜。 另外， 通心菜的栽培方法简单， 对环境的适应性较强； 而 在高温条件下， 黄瓜根系易受地下害虫和病原菌为害， 更易腐烂； 番茄根系生长情况。
45、最差， 生长周期也较短。 因此， 耐高温、 对环境适应性较强的通心菜具有庞大和持久的根系， 以及 再生根的能力， 能为根结线虫接种后的长期繁殖和保种提供更好的基础。 在根结线虫接种 繁殖试验中， 与葫芦科作物黄瓜和茄科作物番茄相比， 通心菜繁殖三种根结线虫能产生更 多的卵块和根结， 繁殖效果更好。 同时， 通心菜接种三种根结线虫后， 生长周期可达到10个 月左右； 而黄瓜和番茄接种三种根结线虫后生长最多3个月左右， 根系就开始腐烂或老化枯 死。 因此， 通心菜繁殖根结线虫法是一种比较经济、 实用的大量繁殖根结线虫的方法， 对于 实验室用于长期保存根结线虫种质资源而言， 本发明较黄瓜和番茄培养根结线虫均有明显 优势。 0075 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 10/10 页 12 CN 107996522 A 12 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 13 CN 107996522 A 13 图3 图4 图5 说 明 书 附 图 2/2 页 14 CN 107996522 A 14 。