技术领域
本发明属于植物细胞工程领域，具体涉及一种药用植物半夏多倍体诱导的方法，是利 用植物组织培养技术和细胞悬浮培养相结合进行半夏多倍体植株诱导的方法。
背景技术
半夏(Pinellia spp.)为天南星科半夏属植物，主要进行无性繁殖，干燥块茎为常见的传 统中药。现代药理学研究表明半夏具有燥湿化痰、降逆止咳、消痞散结，抗早孕、抗肿瘤 作用、降血脂，护肝和治疗冠心病等多种功效。目前野生半夏资源由于人们的盲目挖掘逐 渐减少，而人工栽培半夏遗传背景和倍性复杂多变，种质资源的不均一性限制了半夏产业 化的发展。同时，常规半夏品种对温度敏感，容易出现高温倒苗现象，影响药材产量和质 量。半夏已被国家中医药管理局列为重点推荐发展的63种紧缺中药材。
很多药用植物以根、茎、叶和块茎等器官作为收获对象，而且大部分通过营养繁殖的 药材在人工栽培过程中容易出现种质衰退以及二倍体和多倍体混杂的情况，进一步导致原 药材品质混杂。研究发现：多倍体药用植物一般具有根、茎、叶、花和果的巨型性，抗逆 性强，药用成分含量高等特性，这正是药材优质高产品种选育所期望达到的目标。因此， 应用现代生物技术手段制备多倍体药材，并通过人工筛选后扩繁有可能获得适合现代生产 技术所需要的优质药材新品种，为中药材的产业化提供技术保障。开展半夏多倍体研究， 可能从根本上解决半夏产量低、抗逆性差和有效成分含量低等问题。
虽然多倍体的一些特性对生产有利，但自然界产生多倍体的过程相当漫长，因此人们 常用人工诱导的方法来获得多倍体植株。人工诱导方法目前大致可分为物理方法、化学方 法和生物学方法，其中化学方法是最常用和最有效的方法，其诱导多倍体过程通常用秋水 仙碱、富民隆、生物碱和除草剂等化学药剂处理正在分裂的细胞以诱导染色体加倍。该类 方法诱导多倍体常用萌动的种子、幼苗、芽、愈伤组织和茎尖组织等作为秋水仙素处理材 料，处理方法有浸渍、涂抹、滴液和注射等，但是这种活体条件下的染色体加倍诱导容易 受处理材料生理条件的干扰，易产生嵌合体，并可能发生回复突变，从而增加变异植株筛 选的工作量和复杂程度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种半夏多倍体植株的制备方法，采用该方法获得的 半夏植株具有显著的多倍体特征，且筛选过程相对简便，能够确保半夏多倍体后代的纯合 率。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种半夏多倍体植株的制备方法，通过悬浮培养 分离制备单细胞作为多倍体诱导的材料，包括以下步骤：
1)、将幼嫩的半夏叶片经表面消毒后切成0.4～0.6cm2的小块接种到愈伤组织诱导培养 基中进行光照培养，获得质地坚硬愈伤组织；
2)、将质地坚硬愈伤组织转接到愈伤组织继代培养基中进行光照培养，获得质地疏松 愈伤组织；
3)、将质地疏松愈伤组织夹碎后接种到液体培养基中，然后置于光照条件下进行悬浮 振荡培养，获得细胞悬浮培养物；将细胞悬浮培养物用细胞筛过滤以除去大愈伤组织团块， 获得细胞滤液；
4)、将细胞滤液过滤、离心后，弃上清，收集细胞；然后用单细胞液体培养基悬浮上 述细胞；
5)、以步骤4)所得的悬浮单细胞为材料，采用秋水仙素溶液进行多倍体诱导；
6)、将诱导处理后的细胞溶液采用离心和洗涤的方法去除秋水仙素；
7)、将上述除去秋水仙素的单细胞用单细胞液体培养基进行光照条件下的液体浅层培 养；
8)、当细胞团长到0.5～2mm时，将细胞团转接到愈伤组织诱导培养基中进行光照培养；
9)、待愈伤组织形成后转移到丛生芽培养基中进行光照培养；
10)、当所得的再生植株叶子完全展开时，转接到生根培养基中进行光照条件下的生 根培养，获得可栽培的半夏再生植株；
11)、对半夏再生植株进行染色体倍性鉴定，从上述半夏再生植株中筛选出半夏多倍体 植株。
作为本发明的半夏多倍体植株制备方法的改进：
步骤1)和步骤8)中的愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.5～2.0mg·L-1+α-萘乙酸(NAA)0.01～0.05mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1，pH 5.6～6.0；
即在每1L的MS培养基中加0.5～2.0mg6-苄氨基嘌呤、0.01～0.05mg的α-萘乙酸和25～35 g蔗糖，并调节pH为5.6～6.0。
步骤2)中的愈伤组织继代培养基为：MS培养基+6-BA 0.1～0.5mg·L-1+激动素(KT) 0.3～1.0mg·L-1+2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1.0～2.5mg·L-+蔗糖25～35g·L-11，pH 5.6～6.0；
步骤3)中的液体培养基为：MS培养基+6-BA0.1～0.5mg·L-1+KT 0.3～1.0mg·L-1+ 2，4-D 1.0～2.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1，pH 5.2～5.8；
步骤4)和步骤7)中的单细胞液体培养基均为：MS培养基+6-BA 0.5～2.0mg·L-1+NAA 0.01～0.05mg·L-1+水解酪蛋白(CH)100～400mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1，pH 5.2～5.8；
步骤9)中的丛生芽培养基为：MS培养基+6-BA 0.5～2.0mg·L-1+NAA 0.1～0.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1，pH 5.6～6.0；
步骤10)中的生根培养基为：1/2MS培养基+吲哚丁酸(IBA)0.1～0.5mg·L-1+NAA 0.05～0.3mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+活性炭3.0～4.0g·L-1，pH 5.6～6.0；
作为本发明的半夏多倍体植株制备方法的进一步改进：步骤5)的秋水仙素溶液中秋 水仙素质量浓度为0.001％～0.01％，诱导处理时间为12h～72h。
作为本发明的半夏多倍体植株制备方法的进一步改进：秋水仙素溶液中秋水仙素质量 浓度为0.003％～0.005％，诱导处理时间为24h～48h。
在本发明的制备方法中：光照培养均指光照(12h/d)和暗培养(12h/d)交替进行， 光照强度均为1500lx～2000lx，培养温度为22～28℃。因此，步骤1)～3)和步骤7)～ 10)均满足上述培养条件。步骤1)的培养时间为10～20d，步骤2)的培养时间为14～30d， 步骤3)的悬浮振荡培养时间为7～12d，步骤7)浅层培养时间为20～30d，步骤8)的培 养时间20～30d，步骤9)的培养时间为10～20d，步骤10)的培养时间为7～14d。
在本发明的制备方法中：
步骤3)：将质地疏松愈伤组织夹碎后接种到分装有液体培养基的三角瓶中，接种量为 6～8g质地疏松愈伤组织/100ml液体培养基；然后置于摇床中光照条件下进行悬浮振荡培 养，摇床转速为60～100rpm；所用的细胞筛为80～100目细胞筛；
步骤4)中：采用200目细胞筛过滤，离心条件为：600～1000rpm离心5～10min；
步骤6)为：将诱导处理后细胞溶液600～1000rpm离心5～10min，去上清液；然后再用 单细胞液体培养基清洗2～3次；该单细胞液体培养基同步骤4)中的单细胞液体培养基；
步骤7)中：单细胞在单细胞液体培养基中的浓度为4～8×105个/ml。
在本发明中，MS培养基配方例如为：(单位：mg/L)
贮备液I：NH4NO3，33000；KNO3，38000；CaCl2·2H2O，8800；MgSO4·7H2O，7400； KH2PO4，3400；其余为去离子水。
贮备液II：KI，166；H3BO3，1240；MnSO4·4H2O，4460；ZnSO4·7H2O，1720； Na2MoO4·2H2O，50；CuSO4·5H2O，5；CoCl2.6H2O，5；其余为去离子水。
贮备液III：FeSO4·7H2O，5560；Na2.EDTA·2H2O，7460；其余为去离子水。
贮备液IV：肌醇，20000；烟酸，100；盐酸吡哆醇，100；盐酸硫胺素，100；甘氨酸， 400；其余为去离子水。
制备1L MS培养基，取50ml贮备液I，5ml贮备液II，5ml贮备液III，5ml贮备 液IV；其余为去离子水。
1/2MS培养基是指溶液中所有物质的含量为MS培养基的一半。
本发明的半夏多倍体植株的制备方法，是通过半夏叶片诱导质地疏松愈伤组织，再将 其进行悬浮培养，分离半夏单细胞，然后将分离得到的单细胞用秋水仙素进行处理，洗去 秋水仙素后在单细胞培养基中进行培养，将形成的细胞团块转接到愈伤组织诱导培养基中 培养，愈伤组织形成后转移到丛生芽培养基中培养，植株叶子完全展开后转移到生根培养 基中进行生根培养，然后取根尖进行染色体观察以确定植株倍性，从而得到半夏多倍体植 株。
将本发明所得的半夏多倍体植株用根尖进行染色体鉴定，以确定再生植株的倍性，具 体内容如下：剪取0.5～2.0cm根尖放入盛有0.001～0.005mol·L-18-羟基喹啉的敞口小瓶中， 常温下预处理4～5h；取出预处理根尖，用蒸馏水清洗2～3遍，接着用卡诺氏固定液(乙 醇∶冰醋酸体积比＝3∶1)常温固定12～24h；用蒸馏水将材料清洗2～3遍，转入0.5～1.5mol·L-1的盐酸中，在60～65℃恒温水浴锅里离析10～15min；再用蒸馏水清洗根尖2～3遍，将其置 于改良苯酚品红溶液中染色6～8min，最后用解剖刀截取约0.1～0.5cm左右长度的根尖进 行压片染色体观察。染色体鉴定结果显示：采用本发明方法获得的变异植株的染色体数目 为2n＝16x＝208。
随着植物悬浮培养技术的发展，使在离体条件下诱导单个细胞使染色体加倍成为可 能。它不仅能减少常规处理易产生嵌合体的干扰，获得同质的多倍体，而且能在人为控制 实验条件下反复多次试验，从而提高诱变效率。因此本发明尝试从单细胞开始进行染色体 加倍，设计探索悬浮培养条件，秋水仙素处理浓度、处理时间和单细胞再生培养条件，以 期获得半夏多倍体植株。
本发明所述的半夏多倍体诱导方法与传统的秋水仙素诱导多倍体方法不同点在于：传 统方法主要以萌动种子、愈伤组织、幼苗、幼根或茎的生长点以及球茎或球根的萌动芽等 作为秋水仙素诱导的材料，这些材料的细胞生理状态差别较大，而秋水仙素诱导多倍体时 只对处于有丝分裂前期和中期的细胞才起作用，所以在多倍体诱导过程中比较容易出现嵌 合体。为降低嵌合体的几率，获得纯合的多倍体半夏，本发明通过细胞悬浮培养，获得了 大量生理状态较均一的细胞，分离得到的单细胞同步化程度高，更有利于秋水仙素作用于 正在分裂的细胞。
本发明所述的半夏多倍体诱导方法与传统的秋水仙素诱导多倍体方法相比优势在于： 从细胞水平进行染色体加倍，处理靶标准确，很好的排除了非秋水仙素作用时期细胞的干 扰，确保变异植株为纯合的多倍体，从而大大降低了嵌合体出现的几率，同时也大大减少 了变异植株筛选的工作量。
本发明获得的变异植株(半夏多倍体植株)具有显著的多倍体植株特征：叶片厚，颜 色深、叶柄粗壮，块茎大；叶片表皮气孔密度小等(见图3，图4)。染色体鉴定结果显 示：变异植株的染色体数目是对照植株的染色体数目的两倍，半夏多倍体的诱导率(诱导 率＝多倍体半夏植株数/再生的半夏植株数×100％)最高达35.59％。而如果采用传统方法利 用秋水仙素对半夏的叶片、叶柄、茎尖进行多倍体诱导，诱导率不超过15％。
综上所述，本发明首次用悬浮培养后的单细胞为材料进行多倍体诱导，并成功获得了 多倍体半夏，变异植株中嵌合体几率较低，性状稳定。采用本发明方法获得的半夏植株具 有显著的多倍体特征，且筛选过程相对简便，能够确保半夏多倍体后代的纯合率。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明的步骤2)所得的质地疏松愈伤组织；
图2为本发明单细胞的培养过程图；
图2中，A：步骤4)所得的用于多倍体诱导的单细胞；
B：步骤5)诱导培养3～5d后正在分裂的单细胞；
C：步骤7)培养7～14d后形成的细胞团；
D：步骤8)所用的0.5～2mm左右的细胞团；
E：步骤8)所得的愈伤组织；
图3为普通植株和本发明植株的再生过程图；
图3中，A：未经秋水仙素处理的再生芽；B：经秋水仙素处理后的再生芽；
C：未经秋水仙素处理的丛生芽；D：经秋水仙素处理后的丛生芽；
E：未经秋水仙素处理的正常植株；F：经秋水仙素处理后的变异植株；
图4为八倍体和十六倍体(本发明)的离体块茎对比图；
图4中，A：8倍体半夏组培苗的离体块茎；B：16倍体半夏组培苗的离体块茎；
图5为本发明所得的半夏多倍体植株与普通半夏植株的染色体对比图；
图5中，A：普通的8倍体半夏染色体数目2n＝8x＝104；B：本发明的16倍体半夏染 色体数目2n＝16x＝208。
具体实施方式
实施例1、一种桃叶型半夏多倍体植株的制备方法，依次进行以下步骤：
1)、将幼嫩的桃叶型半夏叶片用体积浓度75％酒精浸泡30～45s，然后用质量浓度0.1％ 的HgCl2溶液消毒1～5min，用无菌水冲洗5～10次；将消毒好的叶片切成0.5cm2左右的 小块接种到愈伤组织诱导培养基中光照培养14～16d，光照时间为12h/d，光照强度1500 lx～2000lx，培养温度为22～28℃，获得黄绿色的质地坚硬愈伤组织；
愈伤组织诱导培养基配方为：MS培养基+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.02mg·L-1+蔗糖 30g·L-1，pH 5.6～6.0。
2)、将质地坚硬愈伤组织转接到愈伤组织继代培养基中进行光照培养，光照时间为12 h/d，光照强度1500lx～2000lx，培养温度为22～28℃；每隔7～10d继代一次，继代培养2～3 次，获得乳白色的疏松愈伤组织；
愈伤组织继代培养基为：MS+6-BA 0.2mg·L-1+KT 0.5mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1+ 蔗糖30g·L-1，pH 5.6～6.0。
3)、将上述生长旺盛、分散性好的疏松愈伤组织夹碎后，接种到分装有50ml液体培 养基的150ml三角瓶中，接种量为7g疏松愈伤组织/100ml液体培养基；然后置于转速为 80rpm的摇床中光照条件下进行悬浮振荡培养，光照时间为12h/d，光照强度1500lx～2000 lx，培养温度为22～28℃，每4d更换一次新鲜培养基，培养时间为9～10d，得细胞悬浮培 养物；
液体培养基为：MS+6-BA0.2mg·L-1+KT 0.5mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1， pH 5.2～5.8。
再将上述细胞悬浮培养物用80～100目细胞筛过滤以除去大愈伤组织团块，得细胞滤 液；该细胞滤液作为分离单细胞的细胞悬液。
4)、将上述细胞滤液用200目细胞筛过滤，收集筛网下的滤液，将滤液静置15min， 用经灭菌处理的移液管小心移去一半上清液，然后800rpm离心5min，弃上清，收集单细 胞；再以单细胞液体培养基悬浮上述细胞；
单细胞液体培养基配方为：MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.02mg·L-1+CH 200mg·L-1+ 蔗糖30g·L-1，pH 5.2～5.8。
5)、以上述悬浮的单细胞为材料进行多倍体诱导，多倍体诱导方法为：使用质量浓度 为0.003％的秋水仙素溶液，于22～28℃诱导处理24h。得诱导处理后细胞溶液。
6)、将秋水仙素诱导处理后细胞溶液采用800rpm离心5min，去上清液，然后用单细 胞液体培养基清洗2～3次，以去除秋水仙素；该单细胞液体培养基同步骤4)中的单细胞液 体培养基。
7)、将上述除去秋水仙素后的单细胞用单细胞液体培养基调整细胞浓度，单细胞培养 的起始浓度为6×105个/ml，该单细胞液体培养基同步骤4)中的单细胞液体培养基；然后进 行液体浅层培养，培养时间为25d左右，培养温度为22～28℃，光照时间为12h/d，光照强 度1500lx～2000lx。
8)、此时，细胞团已生长到1.5mm左右，将上述细胞团转接到愈伤组织诱导培养基中 培养，光照时间为12h/d，光照强度1500lx～2000lx，培养温度为22～28℃，培养时间为25d 左右，获得再生芽。
愈伤组织诱导培养基为：MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.02mg·L-1+蔗糖30g·L-1，pH 5.6～6.0。
9)、将所得的再生芽转移到丛生芽培养基中培养，光照时间为12h/d，光照强度1500 lx～2000lx，培养温度为22～28℃，培养时间为17天左右，获得丛生芽。
丛生芽培养基为：MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1，pH 5.6～6.0。
10)、此时，丛生芽叶子已完全展开，就转接到生根培养基中进行生根培养10～12d， 光照时间为12h/d，光照强度1500lx～2000lx，培养温度为22～28℃，获得桃叶型半夏再生 植株。
生根培养基为：1/2MS+IBA0.3mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+活性炭3.5 g·L-1，pH 5.6～6.0，1/2MS即以MS培养基浓度的一半作为培养基。
11)、剪取桃叶型半夏再生植株0.5～2.0cm根尖放入盛有0.001～0.005mol·L-18-羟基喹 啉的敞口小瓶中，常温下预处理4～5h；取出预处理材料，用蒸馏水清洗2～3遍，接着用 卡诺氏固定液(乙醇∶冰醋酸＝3∶1)常温固定12～24h；用蒸馏水将材料清洗2～3遍，转 入0.5～1.5mol·L-1的盐酸中，在60～65℃恒温水浴锅里离析10～15min；再用蒸馏水清洗根 尖2～3遍，将其置于改良苯酚品红溶液中染色6～8min，最后用解剖刀截取约0.1～0.5cm 左右长度的根尖进行压片染色体观察。
染色体鉴定结果显示：对照桃叶型植株的染色体数目为2n＝8x＝104，变异桃叶型植株的 染色体数目为2n＝16x＝208，桃叶型半夏多倍体的诱导率(诱导率＝多倍体半夏植株数/再生 的半夏植株数×100％)高达35.59％。
经染色体鉴定为变异桃叶型半夏植株(即桃叶型半夏多倍体植株)长成后均具备以下 特征：叶片厚，颜色深、叶柄粗壮，块茎大；叶片表皮气孔密度小。
实施例2、以桃叶型半夏为材料进行多倍体诱导，具体步骤如实施例1所示，所不同 的是步骤5中秋水仙素的质量浓度为0.003％，处理时间为48h，诱导获得的多倍体性状与 实施例1一致，该处理的多倍体诱导率为31.43％。
实施例3、以桃叶型半夏为材料进行多倍体诱导，具体步骤如实施例1所示，所不同 的是步骤5中秋水仙素的质量浓度为0.005％，处理时间为24h，诱导获得的多倍体性状与 实施例1一致，该处理的多倍体诱导率为33.15％。
实施例4、以柳叶型半夏为材料进行多倍体诱导，具体步骤如实施例1所示，所不同 的是步骤5中秋水仙素的质量浓度为0.005％，处理时间为24h，诱导获得的对照植株染色 体数目为2n＝4x＝52，多倍体植株染色体数目为2n＝8x＝104，多倍体诱导率为28.57％。
经染色体鉴定为变异柳叶型半夏植株(即柳叶型半夏多倍体植株)长成后均具备多倍 体植株的特征。
实施例5、以柳叶型半夏为材料进行多倍体诱导，具体步骤如实施例4所示，所不同 的是步骤5中秋水仙素的质量浓度为0.007％，处理时间为12h，诱导获得的对照植株染色 体数目为2n＝4x＝52，多倍体植株染色体数目为2n＝8x＝104，多倍体诱导率为20.69％。
实施例6、以芍药叶型半夏为材料进行多倍体诱导，具体步骤如实施例1所示，所不 同的是步骤5中秋水仙素的质量浓度为0.005％，处理时间为48h，诱导获得的对照植株染 色体数目为2n＝6x＝78，多倍体植株染色体数目为2n＝8x＝156，多倍体诱导率为28.58％。
经染色体鉴定为变异芍药叶型半夏植株(即芍药叶型半夏多倍体植株)长成后均具备 多倍体植株的特征。
实施例7、以芍药叶型半夏为材料进行多倍体诱导，具体步骤如实施例6所示，所不 同的是步骤5中秋水仙素的质量浓度为0.007％，处理时间为24h，诱导获得的对照植株染 色体数目为2n＝6x＝78，多倍体植株染色体数目为2n＝8x＝156，多倍体诱导率为26.80％。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明 不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。