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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710915175.9 (22)申请日 2017.09.30 (71)申请人 江苏理工学院 地址 213001 江苏省常州市中吴大道1801 号 (72)发明人 刘蒙蒙 许磊 霍小位 常珊 (74)专利代理机构 常州佰业腾飞专利代理事务 所(普通合伙) 32231 代理人 刘娟娟 (51)Int.Cl. A61K 31/445(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种哌啶类化合物的新用途 (57)摘要 本发明公开了乙基1-(2-(4-。
2、(N-(4-氟苯甲 基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧 酸酯的新用途。 具体而言， 本发明中的乙基1-(2- (4-(N-(4-氟苯甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙 酰基)哌啶-4-羧酸酯具备AKR1B10抑制剂的功 能， 同时对AKR1B1具有较弱的抑制活性， 可以用 于制备与AKR1B10相关的选择性抗癌药物。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 107595846 A 2018.01.19 CN 107595846 A 1.乙基1-(2-(4-(N-(4-氟苯甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯或 其可药用盐在制备用于治疗与AKR1B10或A。
3、KR1B1中的一种或两种相关的肿瘤细胞的增殖和 抗凋亡过程中的癌症疾病的药物中的应用， 其中所述乙基1-(2-(4-(N-(4-氟苯甲基)-3-甲 基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯的结构式如下： 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述可药用盐为乙基1-(2-(4-(N-(4-氟苯 甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯与无机酸或有机酸中的一种或两种 以上形成的药学上可接受的盐， 该盐为酸加成盐。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述无机酸包括盐酸、 磷酸和硫酸。 4.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述有机酸包括醋酸、 马来酸、 。
4、枸橼酸、 苯 磺酸、 甲基苯磺酸、 富马酸和酒石酸。 5.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述与AKR1B10相关的肿瘤疾病包括鳞状 细胞肺癌、 胰腺癌、 早期肝癌、 子宫癌、 胆管癌、 胰腺癌、 胃癌、 食管癌。 6.一种预防和/或治疗AKR1B10或AKR1B1中的一种或两种相关的癌症的药物， 其特征在 于， 该药物的有效成分为权利要求1或2中所述化合物， 或其药学上可接受的盐的一种或两 种以上。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107595846 A 2 一种哌啶类化合物的新用途 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 涉及一种小分子化合物的医药应用， 具体涉及。
5、乙基1- (2-(4-(N-(4-氟苯甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯或其可药用盐在 制备用于治疗与AKR1B10相关的癌症疾病的药物， 特别是AKR1B10抑制剂中的用途。 背景技术 0002 AKR1B10属于醛酮还原酶超家族(Aldo-keto Reductase， AKR)的成员， AKR是烟酰 胺嘌呤二核苷酸NAD(P)(H)依赖的氧化还原酶， 主要催化醛或者酮的羰基还原成一级或者 二级醇， 是体内一级代谢酶。 研究发现， AKR1B10在多种肿瘤组织和细胞中异常表达： 在84 的鳞状细胞肺癌(squamous cell pulmonary carcinoma。
6、s)， 70的胰腺癌(pancreatic adenocarcinomas)及54的有潜在肝硬化和病毒性肝炎的早期肝癌中过表达； 另外， 在子 宫癌、 胆管癌、 胰腺癌、 早期胃癌和食管癌肿瘤组织中， AKR1B10的表达水平上调。 实验表明， AKR1B10表达上调可能会促进肿瘤的发生和发展。 从220例乳腺癌患者的25年完整临床病理 研究中观察到： AKR1B10的表达水平与肿瘤组织大小、 淋巴结转移程度是正相关的， 而与患 者生存期呈现负相关。 siRNA介导的AKR1B10基因沉默可抑制肝癌HCC细胞、 大肠癌、 肺癌和 乳腺癌BT-20细胞的生长， 并可抑制乳腺癌雌裸鼠和肝癌移植小鼠。
7、的肿瘤生长。 AKR1B10可 以催化多种醛酮类化合物 ， 包括芳香醛 (aromatic aldehydes) ， 甲基乙二醛 (methylglyoxal)， 4-羟基壬烯醛(4-Hydroxynonenal)， 反式-2-己醛(trans-2-hexanal)等 化合物。 这些羰基类化合物具有高度亲电性， 可以与蛋白质、 DNA等生物大分子结合， 形成非 特异性共价修饰耦合物， 引起蛋白质功能紊乱和DNA损伤， 导致病理反应。 0003 由于AKR1B10在肿瘤组织中异常表达、 促进肿瘤发生和发展， 同时又具有被分泌到 细胞外的特异性分泌机制， 被认为是潜在的抗癌靶标和癌症诊断标记物， 。
8、因此积极寻找和 设计新的AKR1B10抑制剂的肿瘤药物具有重要的理论意义和实际价值。 目前， 从天然产物中 发现的AKR1B10抑制剂如多酚类、 五环三萜类和倒捻子素类化合物， 以及内源性甾体激素 类， 胆汁酸及其代谢产物等对AKR1B10有较强的抑制能力。 甲酸类非甾体抗炎药对AKR1B10 有一定的抑制能力和明显的AKR1B1选择性。 基于AKR1B10/tolrestat结构的虚拟筛选方法 得到的色烯-3-甲酰胺类化合物和2-苯基亚氨基苯并吡喃类是已知活性最高的AKR1B10抑 制剂(最小IC50值为6nM)， 但对AKR1B1也有高度抑制活性。 发明内容 0004 针对上述情况， 本发。
9、明提供了一种小分子化合物乙基1-(2-(4-(N-(4-氟苯甲 基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯或其可药用盐在制备用于治疗与 AKR1B10相关的癌症疾病的药物中的用途， 其中所述乙基1-(2-(4-(N-(4-氟苯甲基)-3-甲 基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯的结构式如下： 说 明 书 1/5 页 3 CN 107595846 A 3 0005 0006 优选的， 在上述技术方案中， 所述可药用盐包括(但不限于)乙基1-(2-(4-(N-(4- 氟苯甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯与盐酸、 磷酸、 硫酸等无机酸形 成的酸加成盐以及与醋。
10、酸、 马来酸、 枸橼酸、 苯磺酸、 甲基苯磺酸、 富马酸、 酒石酸等有机酸 形成的酸加成盐。 0007 优选的， 在上述技术方案中， 所述与AKR1B10相关的癌症疾病包括(但不限于)鳞状 细胞肺癌、 胰腺癌、 早期肝癌。 0008 优选的， 在上述技术方案中， 所述用于治疗与AKR1B10相关的癌症疾病的药物为 AKR1B10抑制剂。 0009 所述预防和/或治疗癌症的药物可通过注射、 喷射、 滴鼻、 滴眼、 渗透、 吸收、 物理或 化学介导的方法导入机体如肌肉、 皮内、 皮下、 静脉、 粘膜组织； 或是被其他物质混合或包裹 后导入机体。 0010 所述乙基1-(2-(4-(N-(4-氟苯甲。
11、基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧 酸酯化合物及其类似物或它们药学上可接受的盐为活性成分的抗肿瘤药物， 需要的时候， 在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。 所述载体包括药学领域常规的 稀释剂、 赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 湿润剂、 崩解剂、 吸收促进剂、 表面活性剂、 吸附载体、 润滑 剂等。 0011 所述乙基1-(2-(4-(N-(4-氟苯甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧 酸酯化合物及其类似物或它们药学上可接受的盐制备的预防和/或治疗肿瘤药物可以制成 注射液、 片剂、 粉剂、 颗粒剂、 胶囊、 口服液、 膏剂、 霜剂等多种形式。 上述各。
12、种剂型的药物均 可以按照药学领域的常规方法制备。 0012 本发明对上述小分子化合物进行了生物学活性测定， 发现其对AKR1B10具有明显 的抑制活性， IC50值达到了5.429 M， 此外该分组对AKR醛酮还原酶家族中的另一位成员 AKR1B1具有较弱的抑制活性， IC50值达到了110.4 M， 因此该化合物可以作为AKR1B10选择性 抑制剂。 0013 本发明中的小分子化合物乙基1-(2-(4-(N-(4-氟苯甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯 基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯具备AKR1B10抑制剂的功能， 对与AKR1B10相关的癌症疾病具有 明显的抑制作用， 可以用于制备与AKR1B10。
13、相关的抗肿瘤药物。 所述用于预防和/或治疗与 AKR1B10或AKR1B1中的一种或两种相关的癌症的药物为AKR1B10或AKR1B1中的一种或两种 抑制剂。 0014 AKR1B10与AKR1B1具有高度的序列相似性， 所述乙基1-(2-(4-(N-(4-氟苯甲基)- 3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯化合物及其类似物或它们药学上可接受的 盐对AKR1B10具有较强抑制活性， 而对AKR1B1具有较弱抑制活性， 在化合物实际应用时， 副 说 明 书 2/5 页 4 CN 107595846 A 4 作用较低， 在抑制AKR1B10的同时对抑制AKR1B1的抑制效果较小,上述化合。
14、物具有较好的选 择性和AKR1B10特异性。 附图说明 0015 图1为实施例1中化合物对AKR1B10的酶抑制活性曲线。 0016 图2为实施例2中化合物对AKR1B1的酶抑制活性曲线。 0017 图3为实施例3中化合物对肝癌HCC细胞存活率抑制活性曲线。 具体实施方式 0018 下面将结合附图及具体实施例对本发明做出进一步的描述。 0019 实施例1： 化合物乙基1-(2-(4-(N-(4-氟苯甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基) 哌啶-4-羧酸酯对AKR1B10的酶抑制活性实验。 0020 实验原理： 根据辅酶NADPH随着AKR1B10催化醛酮类底物还原反应的进行转化为 NADP+。
15、这一特点设计。 由于NADPH在340nm处有特征最大紫外吸收峰值， 而产物NADP+在此波 长处吸收很弱， 故可通过检测340nm的紫外吸收值降低来检测辅酶NADPH的消减程度， 从而 获得酶催化反应的速度。 在反应初始阶段， 340nm处紫外吸收变化曲线理论应为直线(零级 反应)， 斜率与反应速度成正比。 0021 当加入化合物后， 反应速度降低， 证明化合物对AKR1B10的催化有抑制作用。 0022 实验试剂的准备： 吡啶-3-醛、 NADPH、 NADP+购自Sigma-Aldrich公司。 0023 实验步骤： 0024 1)配置反应液 0025 用PBS-buffer(0.1M 。
16、potassium phosphate,pH 7.4)配制浓度0.15mM的NADPH反 应液； 0026 2)确定酶AKR1B10稀释比例 0027 取930 l NADPH反应液， 加入20 l稀释后AKR1B10， 30恒温5min后， 加50 l底物吡 啶-3-醛启动反应。 探索不同稀释比例， 至340nm紫外吸收曲线为平直线且斜率数值约为 0.2。 最终固定酶AKR1B10浓度为0.5 左右； 0028 3)配置酶反应溶液 0029 按照步骤2所得酶稀释比例， 用NADPH反应液稀释酶至反应浓度(0.5 )， 配成酶 反应溶液； 0030 4)化合物IC50测定 0031 为了测试化。
17、合物对AKR1B10酶活性的抑制效应， 将浓度为15、 7.5、 3.75、 1.875、 0.9375、 0.46875、 0.234375 M的化合物分别添加到包含重组人类AKR1B10的比色皿中。 按照 酶反应溶液： 底物溶液950:50体积比混合反应体系， 测试过程先将酶反应溶液和化合物 混合均匀后在30下恒温5min后 ,加50l底物吡啶-3-醛启动反应。 采用Tecan InfiniteM1000酶标仪在340nm波长下进行5min吸光度测试。 0032 实验结果： 将浓度为0.46875、 0.9375、 1.875、 3.725、 7.5和15 M的乙基1-(2-(4- (N-。
18、(4-氟苯甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯进行AKR1B10的酶抑制活 性实验， 发现该化合物有很好的抑制活性， 其半抑制浓度IC50为5.429 M/L(如图1所示)。 说 明 书 3/5 页 5 CN 107595846 A 5 0033 实施例2： 化合物乙基1-(2-(4-(N-(4-氟苯甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基) 哌啶-4-羧酸酯对AKR1B1的酶抑制活性实验。 0034 实验原理： 根据辅酶NADPH随着AKR1B1催化醛酮类底物还原反应的进行转化为 NADP+这一特点设计。 由于NADPH在340nm处有特征最大紫外吸收峰值， 而产物NADP。
19、+在此波 长处吸收很弱， 故可通过检测340nm的紫外吸收值降低来检测辅酶NADPH的消减程度， 从而 获得酶催化反应的速度。 在反应初始阶段， 340nm处紫外吸收变化曲线理论应为直线(零级 反应)， 斜率与反应速度成正比。 0035 当加入化合物后， 反应速度降低， 证明化合物对AKR1B1的催化有抑制作用。 0036 实验步骤： 0037 1)配置反应液 0038 用PBS-buffer(0.1M potassium phosphate,pH 7.4)配制浓度0.15mM的NADPH反 应液； 0039 2)确定稀释比例 0040 取930 l NADPH反应液， 加入20 l稀释后AK。
20、R1B1混合均匀后在30下恒温5min后， 加50 l底物吡啶-3-醛启动反应。 探索不同稀释比例， 至340nm紫外吸收曲线为平直线且斜 率数值约为0.2。 最终固定酶AKR1B1浓度为0.5 左右； 0041 3)配置酶反应溶液 0042 按照步骤2所得酶稀释比例， 用NADPH反应液稀释酶AKR1B1至反应浓度0.5 M， 配成 酶反应溶液； 0043 4)化合物IC50测定 0044 为了测试化合物对AKR1B10酶活性的抑制效应， 将浓度为7.8125、 15.625、 31.25、 62.5、 125和250的化合物分别添加到包含重组人类AKR1B10的比色皿中。 按照酶反应溶液:。
21、 底物溶液950:50体积比混合反应体系。 测试过程先将酶反应溶液和化合物混合均匀后在 30下恒温5min,加50 l底物吡啶-3-醛启动反应。 采用Tecan InfiniteM1000酶标仪在 340nm波长下进行5min吸光度测试。 0045 实验结果： 实验结果： 将浓度为7.8125、 15.625、 31.25、 62.5、 125和250 M的乙基1- (2-(4-(N-(4-氟苯甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯进行AKR1B1的酶 抑制活性实验， 发现该化合物有较弱的抑制活性， 其半抑制浓度IC50为110.4 M/L(如图2所 示)。 0046 实施例。
22、3： MTT法检测化合物乙基1-(2-(4-(N-(4-氟苯甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯 基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯体外对肝癌肿瘤细胞HCC存活率的影响。 0047 实验原理： MTT， 商品名噻唑蓝， 全称为 0048 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide。 MTT比色 法， 是一种检测细胞生存活力的方法。 其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使 外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中， 而死细胞无此 功能。 二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒， 用酶标仪在。
23、570nm波长处测定其光吸收值， 可间接反映存活细胞的数量。 在一定范围内， MTT结晶形成的量与细胞存活数成正比。 0049 实验试剂的准备： 肝癌肿瘤细胞HCC细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所 细胞中心， MTT购自Sigma-Aldrich公司。 说 明 书 4/5 页 6 CN 107595846 A 6 0050 实验步骤： 0051 1)细胞培养 0052 取对数生长期的细胞， 按8103个/孔接种于96孔板， 放置于37， 含5CO2的细胞 培养箱中进行培养。 0053 2)测定化合物对肝癌肿瘤细胞HCC的IC50。 0054 待细胞适应生长12h后， 加入100 L含不同。
24、浓度化合物的新鲜培养基(化合物的终 浓度为75、 37.5、 18.75、 9.375、 4.6875、 2.34375、 1.171875 M)， 每个剂量组至少设3个平行 复孔， 于37培养箱中继续培养24h后， 每孔加入10 L MTT溶液(0.5mg/mL,PBS配制)， 继续 培养4h。 2000rmp离心5min， 小心弃上清， 每孔加入200 L DMSO溶解甲簪沉淀， 微型振荡器振 荡10min充分混匀后， 用酶标仪在570nm波长下测定光密度值(OD)， 并计算细胞存活率及IC50 值。 细胞存活率100-(OD对照组-OD药物组)/OD对照组100。 根据计算， 能够得在 。
25、不同浓度的受试化合物作用下细胞的存活率， 据此结果绘制曲线， 计算该受试化合物诱导 50细胞死亡时的浓度， 即为IC50值。 0055 实验结果： 将浓度为75、 37.5、 18.75、 9.375、 4.6875、 2.34375、 1.171875 M的乙基 1-(2-(4-(N-(4-氟苯甲基)-3-甲基丁酰氨基)苯基)乙酰基)哌啶-4-羧酸酯对肝癌肿瘤细 胞HCC进行细胞存活率测试， 发现该化合物有很好的抑制活性， 其半抑制浓度IC50为132.4 M/L(如图3所示)。 说 明 书 5/5 页 7 CN 107595846 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 8 CN 107595846 A 8 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 9 CN 107595846 A 9 。